DE2442655B2 - Amidierte Immunglobuline und ihre Verwendung zur intravenösen Applikation - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft modifizierte Immunglobuline und ihre Verwendung zur intravenösen Applikation.

Durch Fraktionierung aus Serum, insbesondere aus menschlichem Serum hergestellte Immunglobuline haben die wesentliche Eigenschaft als Antikörper gegen körperfremde Antigene wirksam zu sein.

Immunglobulin-Präparationen erwiesen sich bislang im wesentlichen nur für die intramuskulöse Anwendung geeignet Bei intravenöser Applikation reagierten die Empfänger mehr oder weniger ausgeprägt mit anaphylaktoiden Erscheinungsformen.

Es wird angenommen, daß diese Nebenreaktionen auf der Bindung des Serumkomplements durch das verabreichte Immunglobulin beruhen. Andererseits ist ein intravenöses Immunglobulin-Präparat erwünscht, da es im Organismus rascher zur Wirkung kommt

Man hat bereits mehrfach versucht, die Immunglobuline derart zu verändern, daß ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Maß der Komplementbildung jedoch soweit verringert wird, daß die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse Applikation eingesetzt werden können. Beispielsweise lassen sich Immunglobulinmoleküle durch enzymatischen Abbau dahingehend verändern, daß die Bindungsstellen für das Komplement abgespalten werden, der Rest der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert

Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit alkylierenden und acylierenden Mitteln führt zu einem zur intravenösen Anwendung geeigneten Immunglobulin (DE-OS 17 92 555). Die bevorzugte Ausführungsform in dieser Literaturstelle ist die Behandlung von Gammaglobulin mit jJ-Propiolacton. Ein entsprechendes Produkt ist auch im Handel erhältlich. Dieses Produkt hat jedoch immer noch eine verhältnismäßig hohe Komplementbindung. Die Verminderung der Komplementbindung von Immunglobuline ist durch N-Alkylierung und Benzylierung ebenfalls zu erreichen.

Es ist weiter ein Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion von intramolekularen Disulfidbindungen teilweise gespalten und die gebildeten Sulfhydrilgruppen anschließend alkyliert werden. Bei diesem Verfahren bleibt die ursprüngliche Moleküleröße erhalten.

Diese Verfahren beruhen im wesentlichen auf der Veränderung der freien Aminogruppen bzw. Disulfidbindungen der Immunglobulinmoleküle.

Obwohl diese Verfahren zu Produkten mit ziemlich zufriedenstellenden Eigenschaften führen, verbleiben Probleme, die in verbesserter Weise gelöst werden sollen, insbesondere weil die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Moleküle durch die beschriebenen Verfahren wesentlich verändert werden.

ίο Die deutsche Offenlegungsschrift 20 39 223 befaßt sich mit der Behandlung von allergenen Proteinen oder Glykoproteinen mit verschiedenen desensibilisierenden Reagenzien. Unter diesen wird auch Carbodiimid erwähnt In dieser Entgegenhaltung sind aber weder Immunglobuline noch deren Behandlung mit Aminen erwähnt Erfindungsgemäß werden Carbodiimide ebenfalls, aber nur als Hilfsstoffe und niemals ohne gleichzeitige Anwesenheit von Amin verwendet. Die Entgegenhaltung berührt den Anmeldungsgegenstand nicht Es konnte aus der DE-OS 2039 223 nicht abgeleitet werden, daß die Komplementbindung von Immunglobulinen durch Behandlung mit Aminen in Anwesenheit von Carbodiimiden herabgesetzt werden kann.

α Es wurde nun gefunden, daß Immunglobuline, bei denen einige Carboxylgruppen modifiziert werden, ihr Bindungsverhalten gegenüber Komplement wesentlich ändern, ohne ihre Wirksamkeit als Antikörper zu verlieren. Derart modifizierte Immunglobuline, die

jo wenig oder nicht nachweisbar Komplement zu binden vermögen, sind als Arzneimittel für die intravenöse Applikation geeignet.

Gegenstand der Erfindung sind demnach amidierte Immunglobuline erhältlich durch Umsetzung von

Γ) Immunglobulinen mit einem molaren Überschuß eines primären Monoamins und einem Carbodiimid oder dessen Salz wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 3—7 und einer Temperatur von 5—50⁰C, wobei das molare Verhältnis von Immunglobuline zu Amin

4(i mindestens 1 :50 und das von Immunglobulinen zu Carbodiimid mindestens 1 :1 ist.

Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Umsetzung dienen aus Seren, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten oder Organextrakten gewonnene

v, Immunglobulin-Fraktionen. Insbesondere werden die bezüglich Immunglobulin G angereicherten Fraktionen eingesetzt. Eine vorteilhafte Methode zu deren Herstellung ist beispielsweise die nach Levy und Sober über Chromatographie an DEAE-Zellulose. Selbstverständlieh können auch die reinen Immunglobuline erfindungsgemäß amidiert werden. In der Praxis spielen die 100%ig reinen Immunglobuline wegen der aufwendigen Reinigungsverfahren zur Zeit aber keine bedeutende Rolle.

^r)5 Es hat sich gezeigt, daß die Komplementbildung der Immunglobuline besonders niedrige Werte ergibt, wenn das Verhältnis Immunglobuline zu Carbodiimid 1 :5 bis 1 :20 ist. Als Amine im Sinne der Erfindung eignen sich alle primären Monoamine, also Verbindungen der

Mi allgemeinen Formel R—NH2, in der R einen Rest

bedeutet, der nach bekannten Vorstellungen in der

Immunologie kein markantes antigenes Motiv darstellt. Beispiele geeigneter Amine sind in erster Linie

aliphatische Amine, Methylamin, Äthylamin und höhere

*5 aliphatische Amine, insbesondere solche mit bis zu 10 C-Atomen. In den zur Anwendung gelangenden schwachsauren wäßrigen Lösungen liegen die Amine in der Regel als die entsprechenden Ammomium-Katio-

nen vor. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind solche Amine, -die weitere funktionelle Gruppen, insbesondere hydrophile Gruppen, wie Hydroxy oder Acetal tragen. Beispiele solcher Amine sind Äthanolamin, Trishydroxymethyiaminomethan oder Glukosamin, die die Löslichkeit des Umsetzungsprodukts in einem physiologisch verträglichen wäßrigen Medium günstig beeinflussen.

Da das Verfahren im wäßrigen System unter Bedingungen, unter denen die Antikörperaktivität des lmmunglobulins nicht geschädigt werden darf, durchgeführt wird, ist es zweckmäßig, die Umsetzung in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivator auszuführen. Als Carbodiimide eignen sich hier alle Vertreter dieser Verbindungsklasse, die in der Lage sind, bei der Bildung von Peptidbindungen aktivierend zu wirken. Beispiele für solche Carbodiimide sind das l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-ca,rbodiimid-Hydrochlorid (EDC) oder das l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl) carbodiimid metho-p-toluolsulfonat (CMC). Ebenso wie die Amine werden auch die Carbodiimide in den zur Anwendung kommenden schwachsauren wäßrigen Lösungen als Salze vorliegen. In der Regel werden die Carbodiimide ohnehin als Salze zum Einsatz gebracht, weil sie in dieser Form beständiger und leichter zu handhaben sind. Prinzipiell können aber auch die freien Carbodiimide zur Anwendung kommen, die dann beim Auflösen in der wäßrigen Lösung in die Salzform übergehen.

Die Testung der Komplementbindung kann nach A. Nowotny, Basic Exercies in Immunochemistry, S. 160 ff. (1969) durchgeführt werden.

Amidierte Immunglobuline mit einer hinreichenden Verringerung der Komplementbindung können intravenös appliziert werden. Sie lassen sich mit physiologisch verträglichen Lösungsmitteln zu entsprechenden Zubereitungen verarbeiten. Amidierte Immunglobuline enthaltende Arzneimittel können in flüssiger oder gefriergetrockneter Form zur Verfugung gestellt werden.

Zur Prüfung des technischen Fortschritts des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde gemäß dem Verfahren von A. Nowotny die Komplementbildung von unbehandeltem Gammaglobulin, einem bekannten Produkt gemäß DE-OS 17 92 555 und dem erfindungsgemäßen Produkt verglichen. Dabei wurden folgende Werte gefunden:

unbehandeltes Gammaglobulin 71,1%

bekanntes Produkt 33,2%

erfindungsgemäßes Produkt 21,2%

Die Erfindung soll an nachstehend angeführten Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1
Herstellung des Ausgangsmaterials

22,1 Liter Humanserum, gewonnen aus spontan geronnenem Blut, werden zur Umsalzung über eine mit 0,0175 M Natriumphosphat pH 63 äquilibrierten Säule, gefüllt mit Sephadex G-25® »medium« (eingetragenes Warenzeichen der Firma Pharmacia für quervernetztes

ίο Dextran) geleitet Mit einem Durchfiußphotometer wird im Säuleneluat die Absorption bei 280 nm gemessen. Der erste, von den Serumproteinen gebildete Gipfel wird getrennt von den nachfolgenden niedermolekularen Anteilen aufgefangen und über eine mit dem oben genannten Phosphatpuffer gespülte Säule aus 15 kg DEAE-Cellulose mit 1 mäqu/g Austauscherkapazität geleitet Die Säule wird mit 1,5 Säulenvolumen Puffer nachgespült Die im Durchfluß der Säule befindlichen Immunglobuline werden durch Zugabe von festem Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 2,2 M ausgefällt Der größte Teil der überstehenden Flüssigkeit wird nach 24stündigem Stehen abgehebert, der Rest durch Zentrifugieren bei 5200 g entfernt. Der Zentrifugen-Rückstand wird durch Dialyse gegen 0,1 M NaCl-Lösung von Ammonsulfat befreit. Das Volumen der dialysierten Immunglobulinlösung wird mit NaCl-Lösung auf 2000 ml aufgefüllt. Sie enthält insgesamt 155 g Protein.

in Amidierung des Immunglobulin

1000 ml der nach dem oben beschriebenen Vorgehen erhaltenen Immunglobulinlösung werden 24 Stunden unter Rühren gegen 1000 ml 1 M Tris-Hydroxymethyl-

r> aminomethan-(»Tris«)-HCl-Puffer pH 5,4 dialysiert, in ein Glasgefäß überführt und unter Rühren mit 9,6 l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid ■ HCI versetzt. Der Ansatz wird zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Das mit Tris-Hydroxymethyl-aminomethan amidierte Immunglobulin wird danach über eine 8 Liter Sephadex G-25· enthaltende Säule geleitet die vorher mit einer Lösung gespült worden ist, die 0,15 M NaCI und 0,3 M Glycin sowie einen pH-Wert von 7,3 hatte. Die optische

•r, Dichte des Säuleneluates wird bei 280 nm mit einem Durchflußphotometer gemessen. Der das amidierte Immunglobulin enthaltende Teil des Eluates wird vereinigt und mit einem Ultrafilter ankonz;ntriert bis zu einem Proteingehalt von 5%.

■ίο Die folgende Tabelle zeigt eine Gegenüberstellung Ausgangs-Immunglobulin zu amidiertes Immunglobulin in bezug auf Komplementbindung und Antikörper-Aktivität:

Tabelle 1

Komple-

menl-

bindung¹ Antikörper-Spezifitä't

Titer

IE/m!

Tetanus
IE/ml

Ausgangs-Immunglobulin 22% Amidiertes Immunglobulin 0%

1024 >0,5<l,0 >1<2

1024 >0,5 < 1,0 >1 <2

') Die Auswertung der Komplementbindung erfolgte nach Nowotny, A., Basic Exercies in Immunochemistry; Springer-Verlag, 1969, S. 160.

Beispiel 2

1000 ml Immungiobulinlösung, gewonnen nach Beispiel 1, mit 75,5 g Protein werden mit 850 ml einer 52^> g Glucosamin - KCl enthaltenden Lösung versetzt und der pH-Wert mit 2 M NaOH auf 6,0 eingestellt Unter Rühren werden der Lösung 20,6 g l-Cyclohexyl-3-{2-morpholinyl-4-äthyl) carbodiimid metho-p · toluolsulfonat zugesetzt und der Ansatz 1 Stunde weiter tterührt Die Reaktionstemperatur beträgt 25° C. Die Überfüh

Tabelle 2

rung des amidierten Immunglobulins in eine 0,15 M NaCl und 03 M Glycin enthaltende Lösung von pH 73 erfolgt nach der im Bespiel 1 beschriebenen Weise, jedoch mit einer 10 Liter Sephadex G-25 * enthaltenden Säule. Auch die Konzentrierung auf 5% Protein erfolgt wie im Beispiel 1. Die Ergebnisse der Auswertung des nach Beispiel 2 erhaltenen amidierten Immunglobulins sind denen des Ausgangs-lmmunglobulins in Tabelle 2 gegenübergestellt

Komplement bindung Antikörper-Spezifität

Röteln
Titer

Diphtherie
IE/ml

Tetanus
IE/ml

Ausgangs-Immunglobulin 22% 1 : 1024 >0,5 ·

Amidiertes Immunglobulip 1,5% 1 : 1024 >0,5

<2
<2

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Amidierte Immunglobuline erhältlich durch Umsetzung von Inmrunglobuiine mit einem primären Monoamin und einem Carbodiimid oder dessen Salz in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 3 bis 7 und einer Temperatur von 5—50⁰C, wobei das molare Verhältnis von Iminunglobulin zu Amin mindestens 1 :50 und das von Immunglobulin zu Carbodiimid mindestens 1 :1 ist

2. Verwendung von amidierten Immunglobuline nach Anspruch 1 zur intravenösen Applikation.