DE2413512A1 - Verfahren zur verlaengerung der wirkung pharmazeutischer substanzen - Google Patents

Verfahren zur verlaengerung der wirkung pharmazeutischer substanzen

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DE2413512A1
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polysaccharide
dextran
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Eraldo Antonini
Luigi Molteni
Attilio Trebbi
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Dr L Zambeletti SpA
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Dr L Zambeletti SpA
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Description

Dr. Max Schneider Dr. Alfred Eitel DiPi,ing. Ernst Czowalla CiP p!.S. >initainiw&llte Peter Matschkur mt
85 Nürnberg 6. den 18. März 1974 Königstraße 1 (Museumsbrücke) Fernsprech-Sammel-Nr. 20 39 31
Parkhaus Katharlnenhot Parkhaus AdlerstraBe
diess.Nr. 26 188/Cz-Rl
Firma Dr« L. Zambeletti S.p.A., Via L. Zambeletti, Baranzate, Mailand /Italien
"Verfahren zur Verlängerung der Wirkung pharmazeutischer Substanzen"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verlängerung der Wirkung pharmazeutischer Substanzen, welche Amino- oder Amidogruppen enthalten.
Das erfindungsgemäßeVerfahren zur Herstellung von Derivaten einer eine Amino- oder Amidogruppe enthaltenden pharmakologisch oder therapeutisch wirksamen Substanz mit verlängerter Aktivität zeichnet sich dadurch aus, daß man diese Substanz mit einem Polysaccharid reagieren läßt, um kovalente Bindungen zwischen den beiden über die Amino- oder Amidogruppe der ersteren Substanz und die Hydroxylgruppen der zweiten Substanz zu bilden. Das Polysaccharid kann beispielsweise Dextran, Cellulose oder Alginsäure sein, deren Hydroxylgruppen beispielsweise mit Zyan-
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Deutsche Bank A. G. Nürnberg Nr. 03./ 30 688, BLZ 760 70012 - Hypobank Nürnberg Nr. 156 / 274 SOO, BLZ 760 20214 Postscheck-Konto: Amt Nürnberg Nr. 383 05-855 - Drahtanschrift: Norispatent
bromid, einem Zyanamid oder Woodward-Reagenz aktiviert worden sind. Besonders gute Ergebnisse erhält man durch Aktivierung der Hydroxylgruppen des Dextran mit Zyanbromid.
Die erhaltenen makromolekularen Verbindungen haben die gleiche pharmakologische Wirkung, wie die pharmazeutische Ausgangssubstanz, jedoch eine verlängerte Wirkungsdauer. Auf diese Weise können gemäß der Erfindung pharmakologisch interessante Substanzen mit einer relativ kurzen Wirkungsdauer in stabile Verbindungen umgewandelt werden, die wesentlich langsamer aufgenommen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im wesentlichen wie folgt durchgeführt werden:
Das in Wasser mit basischem pH-Wert gelöste Polysaccharid mit vorbestimmtem Molekulargewicht wird beispielsweise mit einer berechneten Menge von Zyanbromid aktiviert, wobei der alkalische pH-Wert durch Zufügen einer verdünnten Natriumhydroxydlösung konstant gehalten wird.
Das bei der Reaktion nicht": verbrauchte Zyanbromid wird vom aktrwferten Polysaccharid mittels Filtration durch Dextrangel mit einer Pufferlösung von beispielsweise Borax, Natriumbikarbonat, Natriumkarbonat oder einem Dreifachpuffer, mit einem pH-Wert zwischen 9 und 10 abgetrennt.
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Die. Lösung der pharmakologisch oder therapeutisch wirksamen Substanz wird der Lösung des aktivierten Polysaccharids zugesetzt und 24 bis 48 Stunden auf einer Temperatur zwischen 0 70C gehalten. Die benötigte Verbindung kann dann vom nicht reagierten Polysaccharid in einfacher Weise durch Chromatographie entfernt werden, beispielsweise über Dextran, wie es unter der Bezeichnung Sephadex vertrieben wird. Das Endprodukt wird in festem Zustand aus der wässrigen Lösung durch Konzentrierung unter Hochvakuum oder durch Lyophilisierung gewonnen.
Das Molekulargewicht des Polysaccharids und seine Proportion im Verhältnis zur pharmazeutischen Substanz steuern das molekulare Verhältnis der pharmazeutischen Substanz zum Polysaccharid im erhaltenen Produkt. Dementsprechend läßt sich eine mehr oder weniger ausgeprägte Verzögerung der pharmakolgischen Wirkung des Endprodukts erreichen.
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung einiger Ausführungsbeispiele.
Beispiel 1:
Dimethofrin-Dextran 70
Dimetofrin ist d*s sympathomimetische Amin 1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-2-methylamino-1-ethanolhydrochlorid mit hypertensiven Eigenschaften.
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Zu 2,5 g "Dextran 70", welches in Wasser bei einem pH-Wert von 11 gelöst ist, werden 1,25g Zyanbromid in kleinen Portionen zugefügt und der pH-Wert durch Zufügen von N-Natriumhydroxidlösung auf dem Wert 11 gehalten.
Die so erhaltene Lösung wird über Sephadex G-25 ehromatographiert, um das nicht reagierte Zyanbromid zu eliminieren, wobei man eine 0,1 M Lösung von NaHCO, (pH 9) als Elutionsmittel verwendet.Die rechtsdrehende Fraktion wird gesammelt, sie enthält das aktivierte Dextran. Zu dieser Lösung werden 100 mg Dimethofrin zugefügt und das Ganze 24 Stunden lang bei 5°C zur Vervollständigung der Reaktion stehengelassen.
Die erhaltene Lösung wird in einer Kolonne von Sephadex G-50 chromatographiert und in 20cc Fraktionen gesammelt. Die Dünnschichtchromatographie der verschiedenen Fraktionen (Silicagel F 254-Schichtj Elutionsmittel: n-Butanol, Essigsäure, Wasser 80:20:100) zeigt eine scharfe Trennung zwischen nicht reagiertem Dextran (Rf. = 0), unreagiertem Dimethofrin (Rf. = 0,33) und Dimethofrin-Dextran (Rf. = 0,85).
Durch Vereinigung und Lyophilisierung der Fraktionen, die den Dimethofrin-Dextran-Komplex enthalten, werden 500 mg eines weißen Stoffes erhalten, der sich bei 255 - 260°C zersetzt. Aus der Prozentanalyse des Produkts ergibt sich, daß an jedes
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MoI Dextran 120 - 125 Mol des Ausgangsdimethofrins gebunden sind. Molekulargewicht: 90.000.
TheoretischerGehalt in % C = 48,47 H = 6,31 N= 1,76
Gefundener Gehalt in % 48,31 6,25 1,66.
Die Dauer des hypertensiven Effekts des erhaltenen Produkts, verglichen mit dem, der von einer äquivalenten Dosis reinen Dimethofrins hervorgerufen wird, verlängert sich bei intramuskulärer Verabreichung bei verschiedenen Tieren um 25 - 30 %. Dieser hypertensive Effekt wurde bestimmt am Kaninchen der Gattung "Gelber Burgunder" und anästhetisierten Beagle-Hunden, wobei der Blutdruck in der Halsschlagader durch einen mit einem Polygraph verbundenen Druckwandler vom Statham-Typ gemessen wurde.
Beispiel 2 Insulin-Dextran 70
Zu 4g Dextran "70", welches in 130 ml N-Natriumhydroxid gelöst und auf einem pH-Wert von 11 gehalten ist, werden 2g Zyanbromid in kleinen Portionen zugefügt, wobei man den pH-Wert durch Zufügen ^von N-Natriumhydroxid auf dem pH-Wert. 11 hält. Die entstehende Lösung wird über Sephatex G-25 chromatographiert, um
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das nicht an Dextran gebundene Zyanbromid abzutrennen, wobei man als Elutionsmittel eine 0,1 normale Natriumkarbonatlösung verwendet. Den optischen aktiven durch Elution gewonnenen Fraktionen (ungefähr 400 ml) werden 500 mg Insulin zugefügt. Zum vollständigen Ablauf der Reaktion wird die entstehende Mischung 24 Stunden lang bei 4°C stehengelassen.D as Produkt wird über Sephadex G-50 chromatographyert, wobei man 0,1 molare Natriumkarbonatlösung als Elutionsmittel verwendet und in Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt.
Aus der Dünnschichtchromatograph-Analyse dieser Fraktionen , (Silicagel F254-Schichtj Elutionsmittel Chloroform, Methan/20, Ammoniak 1796 = 4:4:2) ist es einfach, die-Hauptfraktionen, die den Überschuß von nicht reagiertem Dextran enthalten, von denen abzutrennen, welche das Insulin-Dextran-Reaktionsprodukt enthalten.Durch Lyophilisierung dieser Fraktionen werden 4,65 g Insulin-Dextran-Komplex als weißes Pulver erhalten, welches extrem leicht in Wasser löslich ist.
Aus dem Stickstofftiter dieses Produkts ergibt sich, daß 3 Mol Insulin an 1 Mol Dextran gebunden sind.
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Theoretischer Gehalt in % C = 46,10 H = 6,25 N = 3,13
Gefundener Gehalt in % 46,05 6,17 3,06.
Diese Verhältnisse werden durch die Titration des Syntheseprodukts in internationalen Einheiten von Insulin entsprechend French Pharmacopoea, 8. Ausgabe, bestätigt. Titer: 4,5 I.U./mg.
Die verzögerte hypoglykämische ¥irkung dieser neuen Substanz wurde durch das Verfahren gemäß British Pharmacopoea, Anhang XV C, Seite 938, nachgewiesen. Die Verzögerung des hypoglykämischen Effekts von Dextran-Insulin wird bestimmt im Vergleich mit der Unterzuckerung durch Standardinsulin in Meerschweinchen und Kaninchen. Nicht weniger als 10 Tiere einer gesunden Kolonie werdenswahllos in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Die Tiere werden individuell untergebracht, und es wird ihnen 18 Stunden vor Beginn des Tests keine Nahrung mehr gegeben. Beim Beginn des Tests wird der Durchschnittszuckerspiegel im Blut jeder Gruppe bestimmt. Die Tiere einer Gruppe werden subkutan mit dem zu testenden vPräparat behandelt, während di'e Tiere der anderen Gruppe mit einer Standardlösung von Insulin in wässriger Salzlösung und durch HCl auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert, behandelt werden, welche die gleiche nominale Stärke hat wie die zu prüfende Verbindung. Beide Präparate werden ohne weitere
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Verdünnung in dem Körpergewicht der Tiere entsprechenden Quantitäten injiziert. Der durchschnittliche Blutzuckerspiegel jeder Gruppe wird 1, 2, 4 und 6 Stunden nach der Injektion gemessen. Die so bestimmten Werte zeigen eindeutig, daß nach 4 und 6 Stunden ein Rückgang im Glukosetiter auftritt, der deutlich von dem verschieden ist, den man mit äquivalenten Dosen von Standardinsulin erhält, -©es» Verzögerung liegt in der Größenordnung von 20 - 30%.
Man kann auch Vitamin B^^-Derivate mit verlängerter Aktivität herstellen, bei denen Cobamamid kovalent mit Dextran über die Amidogruppe der ersteren und die Hydroxylgruppe der letzteren verbunden ist, wobei diese Derivate durch Reaktion von Dextran mit Zyanbromid und anschließende Reaktion des dabei erhaltenen Produkts mit Cobamamid gewonnen werden.
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Claims (6)

-9-Patentansprüche;
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten einer pharmakologisch oder therapeutisch wirksamen Substanz mit einer Amino- oder Amidogruppe mit verlängerter Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit einem Polysaccharid zurBildung kovalenter Bindungen zwischen beiden über die Amino- oder Amidogruppe der ersteren und die Hydroxylgruppen des letzteren zur Reaktion gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid zunächst mit Zyanbromid umgesetzt und das so erhaltene aktivierte Polysaccharid anschließend mit der pharmakologisch oder therapeutisch aktiven Substanz zur Reaktion gebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Dextran ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmakologisch oder therapeutisch aktive Substanz Dimethofrin oder Insulin ist.
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- ίο -
5. Derivat einer pharmakologisch oder therapeutisch aktiven Substanz mit einer Amino- oder Amidogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz kovalent mit einem Polysaccharid über die Amino- oder Atnidogruppe der Substanz und die Hydroxylgruppe des Polysaccharids verbunden ist.
6. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Dextran ist.
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