DE2429040A1

DE2429040A1 - Steroid-haptene, verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2429040A1
Application number: DE2429040A
Authority: DE
Inventors: Andre Pierdet; Vesperto Torelli
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1973-06-18
Filing date: 1974-06-18
Publication date: 1975-01-09
Also published as: AT343295B; ATA504374A; JPS5890597A; ES448012A1; GB1478357A; BE816457A; DK322274A; US3922292A; JPS5838440B2; NL7408041A; SE7407108L; ES448013A1; GB1478356A; JPS6241719B2; CA1032927A; JPS601200A; JPS5934200B2; SE402461B; FR2235949B1; LU70329A1

Description

Dr. F. Zumsteln sen, - Dr E Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln jun.

PATENTANWÄLTE

TELEFON: SAMMEL-NR. 225341 β MÜNCHEN 2, TELEX 529979 BRÄUHAUSSTRASSE TELEGRAMME: ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139-809. BLZ 70010080 BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER

KTO.-NR. 397997. BLZ 70030600

tM/N

Cas 1595 D

ROUSSEL-UCLAF, Paris/Frankreich

Steroid-Haptene, Verfahren zu deren Herstellung «mti- „~ ""».

Die Erfindung betrifft Steroid-Haptene der allgemeinen Formel I

in der

/OH

X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel \ ,

^NH

Y ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe und entweder R eine Gruppe der Formel -(CH₉) CO₀H, worin

■i- ^- et C.

a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3, worin

η O, 1 oder 2 bedeutet, darstellt, und

^H

R2 eine Gruppe der Formel^

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oder R₁ ein Wasserstoffatom und

,(CH₂). CO₂H R₀ eine Gruppe der Formel <T , in der

^H
b eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 18 darstellt,

oder R₂ eine Gruppe der Formel =NZ-(CH₂) CO₂H, worin Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen,

bedeuten.

Die Gruppe der Formel -(CH₀) CO-H steht vorzugsweise für den Rest der Buttersäure, der Pentansäure oder der Hexansäure.

Die Gruppe der Formel -(CHp)_b CO^H steht vorzugsweise für den Rest einer Alkancarbonsäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie den der Buttersäure, der Isobuttersäure, der Pentansäure, der Undecansäure oder der Dodecansäure.

Die Gruppe der Formel -(CH₂) CO₂H stellt vorzugsweise den Rest einer aliphatischen Carbonsäure mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen dar, z.B'. den Rest der Essigsäure, der Propionsäure, der Butter säure, der Isobuttersäure oder der Pentansäure.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Haptene der allgemeinen Formel I, in der R₁ eine Gruppe der Formel -(CH₀) CO₀H, in der

X et Sl ei

a die oben angegebene Bedeutung besitzt und R₂ die Gruppe der Formel >,. bedeuten.

Als besonders bevorzugte Haptene kann man insbesondere nennen die 3,17ß-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure und die 3-Hydroxy-l7-oxoöstra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure.

Die Erfindung betrifft ferner die Haptene der allgemeinen Formel I, in der die Gruppe R^ ein Wasserstoffatom und die Gruppe

^(CH₀), CO₂H

R₀ eine Gruppe der Formel ^T ,in der b die oben

^H

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angegebene Bedeutung besitzt, darstellen. Bevorzugte Haptene dieser Art sind insbesondere:

3,17ß-Dihydroxyöstra-l, 3,5 (10)-trien-7a-buttersäure, 3-Hydroxy-17-oxoöstra-l,3,5(10)-trien- 7a -buttersäure, 3,16a,17ß-Trihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-7a-buttersäure und 3,17ß-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-7a-undecansäure.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Haptene der allgemeinen Formel I, in der die Gruppe R. ein Wasserstoffa^om und die Gruppe R₂ eine Gruppe der Formel =NZ-(CH₂) CO₂H, in der c und Z die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, bedeuten.

Von diesen Haptenen sind insbesondere die folgenden zu nennen:

7-Carboxymethoxyiminoöstra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diol, 7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-17-on und

das 4'-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3,17ß-Dihydroxyöstral,3,5(10)-trien-7-ons.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Haptene der allgemeinen Formel·I zur Herstellung von Antigenen.

Im übrigen erstreckt sich die Erfindung insbesondere auf die Verwendung der Haptene der allgemeinen Formel I, die dadurch gekennzeichnet ist, daß- man ein Hapten der allgemeinen Formel I mit Hilfe eines Halogenameisensäurealkylesters und insbesondere des Chlorameisensäureisobutylesters in ein gemischtes Anhydrid überführt und dieses Anhydrid auf dem Albumin von Rinderserum fixiert.

Ein Beispiel für die Herstellung eines derartigen Antigens ist weiter unten in den Beispielen beschrieben. Ausgehend von diesen Antigenen, ist es möglich, nach den klassischen Methoden und insbesondere nach dem Verfahren'von Erlanger ("J.Biol.Chem.", 228, 7 13) Antikörper zu bereiten.

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Die in dieser Weise erhaltenen Antikörper sind für Steroide der allgemeinen Formel I spezifisch, in der R., X, Y und R« die oben angegebenen Bedeutungen besitzen. Sie können z.B. spezifisch sein für Östron, Östradiol oder Östriol. Dieses spezifische Verhalten wird nach klassischen Verfahrensweisen nachgewiesen und insbesondere nach der Gleichgewichtsdialysemethode. Dieses spezifische Verhalten macht die in dieser Weise bereiteten Antiköper als Bestimmungsmittel für die Produkte der allgemeinen Formel I, und insbesondere für Östron, Östradiol oder Östriol geeignet, wobei ein besonderes Interesse dafür besteht, den Östriolspiegel im Blut und im Harn von schwangeren Frauen zu bestimmen, was es möglich macht, gegebenenfalls gewisse Anomalien des Fetus festzustellen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel I, in der die Gruppe R₁ eine Gruppe der Formel -(CH₀) CO₀H, in der a die oben angegebene Bedeutung besitzt und R~ die Gruppe der Formeln be-

*'H

deuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

OL K

in der K und K¹ eine in Form des Ketals blockierte Ketofunktion und L eine Acylgruppe bedeuten, der Einwirkung eines Epoxydierungsmittels und dann der Einwirkung eines Verseifungsmittels unterzieht, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel III

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erhält, die man mit einem Allylmagnesiumhalogenid zu einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

CK=CH,

IV

umsetzt, die man mit einem Deketalisierungsmittel und dann mit einem Cyclisierungsmittel behandelt, so daß man die Verbindung der Formel V

erhält, die man mit einem Aromatisierungsmittel zu der Verbindung der allgemeinen Formel VI

VI

umsetzt, deren Hydroxygruppen man in Form des Esters blockiert, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel VII erhält:

L¹O

OL¹

VII

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>■ -e- 2A29040

in der die Gruppe L¹ eine Acylgruppe darstellt, man die Verbindung der allgemeinen Formel VII einer Ozonolyse-Reaktion unterwirft, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel VIII

HC=O

OL¹

. VIII

erhält, die man mit einem Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester der folgenden allgemeinen Formel

¹ ^P-CH -(CH=CH) CO IU

in der R₁, R_? und R₃, die gleichartig oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten und η die oben angegebene Bedeutung besitzt, und anschließend mit einem Verseifungsmittel umsetzt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel IX

(CH=CH)_n+1CO₂H

OH

IX

erhält, die man mit einem Hydrierungsmittel behandelt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I erhält, in der R eine Gruppe der Formel -(CH₂) CO₂H, in der a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3, worin η die oben angegebene Bedeu-

^ OH tung besitzt, darstellt, X eine Gruppe der Formel <^ ,

^V*H

^-^H Y ein Wasserstoffatom und R_? eine Gruppe der Formel c

^H

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- 7- 2429Q4Q

bedeuten, die man gewünschtenfalls mit einem Oxydationsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel I umsetzt, in der die Gruppe R. eine Gruppe der folgenden Formel -(^CH ₂^a ^C02^H) in der a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3, worin η die oben angegebene Bedeutung besitzt, X ein Sauerstoffatom,

Y ein Wasserstoffatom und R₀ eine Gruppe der Formel

² ^H

bedeuten.

Die Substituenten K und K¹, die gleichartig oder verschieden sein können, stellen vorzugsweise cyclische Alkylketalgruppen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und insbesondere die Äthylenketalgruppe oder die Propylenketalgruppe oder eine Dialkylketalgruppe, z.B. die Dimethylketalgruppe oder die Diäthylketalgruppe, dar.

Die Gruppe L bedeutet vorzugsweise den Acylrest einer aliphatischen oder cycloaliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Säure und insbesondere den Rest einer Alkancarbonsaure, wie der Essigsäure, der Propionsäure, der Buttersäure, der Isobuttersäure oder der Undecansäure, oder den Rest einer Cycloalkylcarbonsäure oder einerCycloalkylalkancarbonsaure, wie z.B. den Rest der Cyclopropancarbonsäure, der Cyclopentancarbonsäure oder der Cyclohexancarbonsäure, der Cyclopentanessigsäure, der Cyclopentanpropionsäure, der Cyclohexanessigsäure oder der Cyclohexanpropionsäure, der Benzoesäure oder den Rest einer Phenylalkancarbonsäure, wie den Rest der Phenylessigsäure oder der Phenylpropionsäure, oder den Rest einer Aminosäure, wie den Rest der Diäthylaminoessigsäure, der Asparaginsäure oder der Ameisensäure.

Als Epoxydierungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Persäure, z.B. die Peressigsäure, die Perphthaisäure oder die m—Chlorperbenzoesäure.

Als Verseifungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Alkalibase, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-rbutylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin,

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wobei man die Verseifungsreaktion vorzugsweise in Gegenwart eines niedrigmolekularen Alkohols, wie Methanol oder Äthanol, durchführt.

Als Allylmagnesiumhalogenid setzt man vorzugsweise Allylmagnesiumchlorid oder Allylmagnesiumbromid ein.

Das verwendete Deketalisierungsmittel ist vorzugsweise ein saures Mittel, z.B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Citronensäure oder p-Toluolsulfonsäure. Diese Deketalisierung kann in Gegenwart eines oder mehrerer Lösungsmittel, wie eines Alkohols, wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol, eines Ketons, wie Aceton, oder eines Kohlenwasserstoffs, wie Benzol oder Toluol, erfolgen.

Als Cyclisierungsmittel kann man ein saures oder basisches Mittel verwenden, wobei man vorzugsweise ein basisches Mittel und insbesondere ein Alkalimetallalkoholat, wie Natriummethylat, Natriumäthylat, Natrium-tert.-butylat oder Kalium-tert.-butylat einsetzt.

Als Aromatisierungsmittel benützt man vorzugsweise ein Acylhalogenid, z.B. ein Acetylhalogenid, vorzugsweise Acetylbromid, oder auch Essigsäureanhydrid. Die Wirkung dieses Aromatisierungsmittels wird von der eines Verseifungsmittels gefolgt, wobei man als Verseifungsmittel vorzugsweise eines der oben erwähnten anwendet.

Als Veresterungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Säure oder ein funktionelles Derivat der Säure, beispielsweise ein Säurehalogenid, z.B. ein Säurebromid oder ein Säurechlorid, oder auch ein Anhydrid der Säure.

Die für L bevorzugten Bedeutungen sind auch für die Gruppe L¹ bevorzugt.

Als Mittel für die Ozonolyse verwendet man Ozon, wobei man die Ozonolyse bei einer Temperatur zwischen -50°C und -100⁰C durch-

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"⁹" 2A29040 .

führt.

Der verwendete Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester der folgenden allgemeinen Formel

R₁O 8

OP-CH₃-(CH=CH) CCXJU R₂O^ ^ά ^η ^ά ->

ist vorzugsweise eine Verbindung, in der die Gruppen R^ und R₂ identisch sind und Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellen und die Gruppe R₃ eine Alkylgruppe mit ebenfalls 1 ■ bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Das verwendete Verseifungsmittel ist vorzusgweise eine Alkalimetallbase, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-butylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin. ·

Als Hydrierungsmittel verwendet man vorzugsweise Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators, wie z.B. Palladium.

Als Oxydationsmittel setzt man vorzugsweise Chromsäureanhydrid, Silbercarbonat, Silbersilicat oder Bleitetraacetat ein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der genannten Haptene verwendet man

als Epoxydierungsmittel die Perphthalsäure,

als Allylmagnesiumhalogenid Allylmagnesiumbromid,

als Deketalisierungsmittel Schwefelsäure,

als Cyclisierungsmittel Natriumhydroxyd,

als Aromatisierungsmittel Essigsäureanhydrid,

als Verseifungsmittel nach der Aromatisierung Natriumhydroxyd,

als Veresterungsmittel BenzoylChlorid,

als Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester Diäthylphosphonoessigsäuremethylester,

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als Hydrierungsinittel Wasserstoff in Gegenwart von Palladium, als Verseifungsmittel Kaliumhydroxyd und als Oxydationsmittel Chromsäureanhydrid.

Die als Ausgangsmaterialien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formel II können nach der in der FR-PS 1 497 593 beschriebenen Methode hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel I, in der R. ein Wasserstoff atom und die Gruppe Rp eine Gruppe der folgenden allgemeinen

,-(CH₂ )_b CO H
Formel "L . , in der b die oben angegebene Bedeutung

besitzt, bedeuten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XII

XII

in der L eine Acylgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

HaIMg-(CH₂)_b

,OM

in der Hai ein Chlor- oder Brom-Atom und OM eine in Form eines Äthers blockierte Hydroxygruppe bedeuten und b die oben angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt und das erhaltene Produkt mit einem sauren Mittel umsetzt, das gebildete Produkt mit einer Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D eine Acylgruppe bedeutet, oder einem funktioneilen Derivat dieser Säure zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XIII

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XIII

H₂Oi)

umsetzt, die man mit einem Verseifungsmittel behandelt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XIV

OH

"'"(CH₂)_bCH₂GH

XIV

erhält, die man mit einem Oxydationsmittel behandelt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XV

erhält, die man der Einwirkung eines Dehydrierungsmittels unterzieht, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XVI

XVI

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel I erhält, in der R.. ein Wasserstoffatom, X ein Sauerstoffatom, Y ein Wasserstoffatom

und R₂ eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel//'

bedeuten, worin b eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 18 darstellt, die Verbindung der allgemeinen Formel XVI entweder

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mit einem Reduktionsmittel zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XVII

XVII

d.h. einem Hapten der allgemeinen Formel I, umsetzt, in der

•OH R^. ein Wasserstoff atom, X eine Gruppe der Formel^ , Y ein

Wasserstoffatom und Rp eine Gruppe der folgenden allgemeinen

,'(CH₂), CO₂H

Formel C bedeuten, worin b eine ganze Zahl mit

^XH

einem Wert von 3 bis 18 darstellt,

oder mit einem Alkohol der allgemeinen Formel TOH, in der T eine Alkylgruppe bedeutet, oder einem funktionellen Derivat dieses Alkohols umsetzt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XVIII

XVIII

erhält, die man mit einer Säure der allgemeinen Formel VOH, in der V eine Acylgruppe bedeutet, oder einem funktionellen Derivat dieser Säure umsetzt, um die Hydroxygruppen in der 3-Stellung und die enolischen Hydroxygruppen in der 17-Stellung zu verestern, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XIX

XIX

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erhält, die man mit einem Epoxydierungsmittel zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XX

umsetzt, die man zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XXI

-QE

(CH₂)_b

hydrolysiert, worauf man diese Verbindung mit einem Reduktionsmittel und schließlich einem Verseifungsmittel umsetzt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XXII

XXII

''(CH₂) _b CO₂H

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel I erhält, in der R₁ ein Wasserstoffatom, X eine Gruppe der Formel <T , Y eine OH-

^H

Gruppe und R₂ eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel

, in der b eine ganze Zahl mit einem Wert von

3 bis 18 darstellt, bedeuten.

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Die Gruppe L besitzt die gleichen bevorzugten Bedeutungen,wie sie weiter oben angegeben sind. Hai stellt ein Chlor- oder Brom-Atom dar. Bei der Gruppe M handelt es sich vorzugsweise um eine Benzylgruppe oder eine Tetrahydropyranylgruppe.

Als saures Mittel verwendet man vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Citronensäure, Essigsäure oder p-Toluolsulfonsäure; als Veresterungsmittel benützt man vorteilhafterweise eine Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D irgendeine der oben angegebenen Bedeutungen von L besitzen kann, oder ein funktionelles Derivat einer derartigen Säure. Als Verseifungsmittel ist irgendeines der oben erwähnten Verseifungsmittel bevorzugt, insbesondere eine Alkalimetallbase, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-butylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin,, wobei die Verseifungsreaktion in einem niedrigmolekularen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, durchgeführt wird. Als Oxydationsmittel setzt man irgendeines der oben erwähnten Oxydationsmittel und insbesondere Chromsäureanhydrid ein. Die Dehydrierung erfolgt vorzugsweise auf biochemischen Wege, insbesondere durch die Anwendung des Bacteriums' "Arthrobacter Simplex" (U.Cl 047). Das Reduktionsmittel der Wahl ist Wasserstoff, den man in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladium, einsetzt. Als Veres terungsmittel für die Verbindung der allgemeinen Formel XVI verwendet man vorzugsweise einen Alkohol der allgemeinen Formel TOH, in der T eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet. Das Veresterungsmittel, dasein der Lage ist, die Hydroxygruppe in der 3-Stellung und die enolische Form der Ketofunktion in der 17-Stellung zu verestern, ist vorzugsweise ein Säureanhydrid, beispielsweise Essigsäureanhydrid oder ein Derivat der folgenden allgemeinen Formel

OR₄
H₃C-C=CH₂

in der R₄ eine Acylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, darstellt. Als Epoxydieirungsmittel setzt man vorzugsweise eine Persäure, wie Per-

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chlorsäure oder Perphthalsäure, oder Hexafluoracetonhydroperoxyd, ein. Die Hydrolyse bewerkstelligt man in saurem Medium, insbesondere in schwefelsaurem oder essigsaurem Medium. Als Reduktionsmittel benützt man mit Vorteil ein gemischtes Hydrid, beispielsweise Natriumborhydrid oder Lithiumborhydrid. Als Verseifungsmittel kann man irgendeines der oben erwähnten Verseifungsmittel einsetzen.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des genannten erfindungsgemäßen Verfahrens

stellt L eine Acetylgruppe dar,

bedeutet Hai ein Chloratom,

stellt M eine Tetrahydropyranylgruppe dar,

verwendet man als Säure die Chlorwasserstoffsäure, benützt man als Veresterungsmittel Essigsäureanhydrid,

setzt man als Verseifungsmittel methanolisches Kaliumhydroxyd ein,

verwendet man als Reduktionsmittel Natriumborhydrid,

bewirkt man die Veresterung der Säurefunktion vorzugsweise mit Äthylalkohol,

verwendet man als Veresterungsmittel für die Hydroxygruppe in der 3-Stellung und die enolische Form des Ketons in der 17-Stellung Essigsäure!sopropenylester,

benützt man als Epoxydierungsmittel Hexafluoracetonhydroperoxyd, bewirkt man die Hydrolyse in schwefelsaurem Medium, wendet man als Hydrierungsmittel Natriumborhydrid an und

bewerkstelligt man die Verseifung mit Kaliumhydroxyd in methanolischem Medium.

Die als Ausgangsmaterialien eingesetzten Verbindungen der allgemeinen Formel XII können nach der in der FR-PS 1 180 907 angegebenen Methode bereitet werden.

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Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel I, in der R₁ ein Wasserstoffatom und Rp eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel =NZ-(CHp) COpH bedeuten, worin Z und c die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XXIII

XXIII O

mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

H₂NZ-(CH₂)_c CO₂H

umsetzt, in der Z und c die oben angegebenen bedeutungen besitzen, so daß man eine Verbindung der allgeme nen Formel XXIV

OH

NZ(GH₂)_C

XXIV

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel I, erhält, in der R^ ein Wasserstoffatom, X eine Gruppe der folgenden Formel

^ OH
<^ , Y ein Wasserstoffatom und Rp eine Gruppe der folgenden

allgemeinen Formel =NZ-(CH₉) CO₉H bedeuten, in der Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel NHCONH und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen, die man gegebenenfalls mit einem Oxydationsmittel behandelt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XXV

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srz(cH₂)_c

XXY

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel I erhält, in der R. ein Wasserstoffatom, X ein Sauerstoffatom, Y ein Wasserstoffatom und Rp eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel =NZ-(CH₂)_C CO₂H, bedeuten, worin Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man die Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

H₀NZ-(CH₀) CO₀H

in der Z und c die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in Form des Hydrochlorids, während man als Oxydationsmittel irgendeines der oben erwähnten Oxydationsmittel, vorzugsweise Chromsäureanhydrid, einsetzt.

Das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemaße Verfahren eingesetzte 7-Ketoöstradiol kann nach der in der US-PS 2 418 603 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

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Beispiel 1

Herstellung der 3,17ß-Dihydroxyöstra-l,3,5(lO)-trien-llß-buttersäure

Stufe I: Bis-3,3,5_TS-äthylendioxy-Sg,lla-epoxy-4,5-seco-östra-17ß-ol

Stufe A

In 220 ecm Tetrahydrofuran bringt man 21,9 g des Benzoesäureester des Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-4,5-seco-östr-9(ll)-en-17ßols (das man nach dem in der FR-PS 1 497 593 beschriebenen Verfahren hergestellt hat) ein. Dann gibt man unter Rühren und bei 20°C 22 g Monoperphthalsäure zu, läßt die Reaktionsmischung während etwa 16 Stunden stehen und gießt sie dann in eine gesättigte Bicarbonatlösung. Man saugt ab und wäscht den erhaltenen Niederschlag. In dieser Weise erhält man 22,2 g eines bei 160°C schmelzenden Produktes, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe verwendet.

Stufe B

Man bringt 31,98 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes in 130 ecm Methylalkohol ein. Zu der erhaltenen Suspension gibt man 130 ecm einer methanolischen 1,74n-Kaliumhydroxydlösung. Man erhitzt während 1 Stunde zum Sieden am Rückfluß, kühlt ab, verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Methylenchlorid. Man trocknet und engt die organische Phase ein. In dieser Weise erhält man 23,6 g eines Harzes, das man aus Isopropyläther umkristallisiert. Es ergeben sich 22,3 g Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-9a,lla-eopoxy-4,5-seco-östra-l7ß-ol. F = 148°C.

Stufe II: Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-llß-allyl-4,5-seco-östra-9a,17ß-diol

Unter Rühren und unter Einleitung von Stickstoff bringt man 32,4 g Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-9a,lla-epoxy-4,5-seco-östra-17ß-ol in 1105 ecm einer O,65m-Allylmagnesiumbromidlösung in Tetrahydrofuran ein. Man erhitzt die Lösung während 4 l/2 Stun-

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den auf 6O⁰C, läßt dann abkühlen und über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff stehen. Dann kühlt man auf 0 C ab und gibt langsam 45 ecm Methanol und 100 ecm Äther zu. Anschließend setzt man 5 ecm Wasser zu und gießt die Reaktionsmischung in 1000 ecm einer gesättigten Ammoniumchloridlösung. Man dekantiert und extrahiert mit Äther. Man trocknet und destilliert unter vermindertem Drzck zur Trockne. Man erhält 45 g eines kristallisierten Produktes, das man mit einer Äther-Petroläther(Siedepunkt 60 bis 68 C)-Mischung anteigt. Man saugt ab und wäscht das erhaltene Produkt mit dem genannten Petroläther. Man erhält 34 g Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-llß-allyl-4,5-seco-östra-9a,17ß-diol. F = 140°C.

Stufe III; llß-Allyl-17ß-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on Stufe A: Hydrolyse

Unter Rühren gibt man zu einer Mischung aus 340.ecm Aceton und 68 ecm In-Schwefelsäure 34 g Bis-3,3,5,5-äthylendioxyllß-allyl-4,5-seco-östra-9oc, I7ß-diol. Man rührt während 4 Stunden bei Raumtemperatur, gibt dann 0,5 1 Wasser zu und extrahiert mit Methylenchlorid. Man erhält 38 g eines Produktes, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.

Stufe B: Cyclisierung

Unter Rühren und unter Einleiten von Stickstoff bringt die 38 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes in 760 ecm wasserfreies Methanol ein. Man kühlt die Lösung unter Einleiten von Stickstoff und gibt bei einer Temperatur unterhalb 20 C 85 g Kaliumhydroxyd zu. Man läßt die Reaktionsmischung anschließend während 4 Stunden unter Einleiten von Stickstoff bei Raumtemperatur stehen. Dann setzt man 100 ecm Essigsäure zu, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Methylenchlorid und erhält 25 g des Produktes, das man chromatographiert, wobei man llß-Allyl-17ß-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on erhält

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-20- 2A29040

UV- Sp ek tr um (Äth an ο 1):

Max. 215 nm E J ^ 171
1 cm

Max. 238 ran E J* 157
l cm

Inf 1.248 nm E ^ ^_1n 148

Max. 305 nm E \ ^% 491 £: 15 300
1 cm

Stufe IV: llß-Allyl-östra-1,3,5(10)-trien-3,17ß-diol

1. Aromatisierung

Unter Rühren und unter Einleiten von Stickstoff gibtmanzu 125 ecm Essigsäureanhydrid 25 g llß-Allyl-17ß-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on. Man erhitzt die Lösung während 2 Stunden auf 100°C, kühlt die Lösung anschließend ab und gibt tropfenweise bei einer Temperatur unterhalb 10°C 62,5 ecm Acetylbromid zu. Man läßt die Umsetzung während 2 Stunden bei 20 C ablaufen, gießt auf Eis, extrahiert mit Methylenchlorid und wäscht mit Wasser. Man trocknet und destilliert zur Trockne, wobei man 36 g eines Produktes erhält, das man über Siliciumdioxyd chromatographiert, wobei sich 27 g eines Harzes ergeben, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.

2. Verseifung

Bei 25°C und unter Einleiten von Stickstoff löst man 27 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Harzes in 540 ecm Methanol. Dann gibt man 27 ecm Natronlauge zu, läßt die Mischung während 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, setzt 16 ecm Essigsäure und 2,5 1 Wasser zu, saugt ab, wäscht den erhaltenen Niederschlag, trocknet und erhält 19,65 g eines bei 195°C schmelzenden Produktes. Nach dem Anteigen mit Dichloräthan am Rückfluß erhält man llß-Allyl-östra-1,3,5(10)-trien-3,17ßdiol. F = 200°C.

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Stufe V: 3,17-Dibenzoat des llß-Allyl--östra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diols

Unter Rühren gibt man 9,286 g llß-Allyl-östra-l,3,5(lO)-trien-3,17ß-diol zu 93 ecm wasserfreiem Pyridin. Man setzt 9,3 ecm Benzoylchlorid zu, rührt während 4 Stunden bei Raumtemperatur und gibt bis zu einem Gesamtverdünnungsvolumen von 250 ecm Wasser zu. Man saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet die erhaltenen Kristalle. Man erhält 12,6 g des 3,17-Dibenzoats des llß-Allyl-östra~l,3,5(10)-trien-3,17ß-diols. F = 198°C.

Stufe VI: 3,17-Dibenzoat des llß-[2'-0xoäthyl]-östra-l,3,5(10)-

trien~3,l7ß-diols

Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom bringt man in 370 ecm Methylenchlorid 12,3 g des 3,17-Dibenzoats des llß-Allyl-östra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diols ein. Man kühlt die erhaltene Lösung auf -65°C und leitet während 1 l/2 Stunden 0,2 bis 0,3 1 ozonisierten Sauerstoff pro Minute ein. Dann gibt man 25 g Zinkpulver und 50 ecm Essigsäure zu. Man läßt die Reaktionsmischung sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt während weiterer 30 Minuten. Man filtriert das Zink ab, wäscht das Filtrat, trocknet es und destilliert es zur Trockne, wobei man 12,89 g eines Harzes erhält, das man über Siliciumdioxyd chromatographiert. Hierbei erhält man 11,15 g des 3,17-Dibenzoats des llß-[2'-Oxoäthyl]-östra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diols. F = 148°C.

Stufe VIl; 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-llß-crotonsäure

Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom gibt man zu 20 ecm wasserfreiem Tetrahydrofuran 1,2 g einer 50%-igen Dispersion von Natriumhydrid in Öl. Man kühlt die Suspension auf 15°C ab und gibt tropfenweise, ohne 20°C zu übersteigen, 5 ecm Diäthylphosphonoessigsäuremethylester zu. Man läßt l/2 Stunde reagieren und setzt tropfenweise 1,305 g des 3,17-Dibenzoats des llß-[2'-Oxoäthyl]-östra-l,3,5(10)-trien-3,l7ß-diols, in Form einer Lösung mit 20 ecm Tetrahydrofuran, zu. Man rührt während 40 Minuten bei Raumtemperatur, gibt Wasser zu und

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extrahiert mit Äthylacetat. Man wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet sie und destilliert sie im Vakuum, wobei man 2,23 g eines Harzes erhält. Man gibt zu den 2,23 g des Harzes 20 ecm In-Natriumhydroxydlösung und 10 ecm Äthanol, erhitzt während 1 l/2 Stunden zum Sieden am Rückfluß, kühlt die Reaktionsmischung ab und extrahiert mit Chloroform und schließlich mit Äthylacetat. Man wäscht die organischen Phasen und trocknet sie, teigt sie mit Äther an, saugt ab, wäscht die erhaltenen Kristalle und erhält 830 mg der 3,17ß-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-llß-crotonsäure. F = 272°C.

Stufe VIII; 3,176-Dihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-llß-buttersäure

1. Hydrierung

Man gibt 726 mg 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-llß-crotonsäure zu einer Lösung, die 30 ecm Methylalkohol und 2 ecm Chloroform enthält. Man setzt 150 mg Aktivkohle, die 10 % Palladium enthält, zu und rührt unter Wasserstoff bis zur Sättigung. Man filtriert dann den Katalysator ab und verdampft das Filtrat, wobei 750 mg eines Harzes zurückbleiben.

2. Verseifung

Man löst die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen 750 mg des Harzes in einer Mischung aus 7,5 ecm Methylalkohol und 0,75 ecm Kalilauge. Man erhitzt die Reaktionslösung zum Sieden am Rückfluß, säuert an, verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Äthylacetat. Dann wäscht man mit Wasser, trocknet und destilliert im Vakuum zur Trockne. Man erhält 6 74 mg eines kristallisierten Produktes, das man umkristallisiert, wobei sich 604 mg 3,l7ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure ergeben. F= 26 2°C.

Beispiel 2

3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure

Man bringt 2,1 g 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(lO)-trien-llßb.uttersäure in 100 ecm Aceton ein, bringt die in dieser Weise erhaltene Suspension auf 0°C und setzt 25 ecm einer 8n-Chrom-

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säureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu. Nach Ablauf von 30 Minuten gibt man 400 ecm Wasser zu, saugt ab, wäscht das erhaltene kristallisierte Produkt mit Wasser und erhält in dieser Weise 1,386 g eines Produktes, das bei 24O°C schmilzt. Man extrahiert die Mutterlaugen mit Äthylacetat und erhält 0,580 g eines bei 240 C schmelzenden Produktes. Die in dieser Weise erhaltenen Chargen werden aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 770 mg 3-Hydroxy-17-oxoöstra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure erhalten werden. F = 256°C.

Beispiel 3

3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäure

Stufe I: Diacetat des 7a-[4'-Hydroxybutyl]-17ß-hydroxy-östra-4-en-3-ons

Man gibt 575 ecm einer O,62m-Lösung der Magnesiumverbindung des 4-Chlorbutanoltetrahydropyranyläthers zu Tetrahydrofuran. Mankühlt diese Lösung unter Stickstoff auf -30°C und gibt 2,6 g Kupfer-(I)-chlorid zu. Man rührt während 20 Minuten und gibt dann im Verlauf von 1 Stunde und 10 Minuten eine Lösung von 95 g 6-Dehydro-19-nortestosteronacetat in 300 ecm Tetrahydrofuran zu. Man beläßt die Lösung dann während 1 Stunde bei -30⁰C und gibt 40 ecm Essigsäure und 300 ecm Wasser zu. Dann extrahiert man mit Äther, wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet sie und verdampft sie unter vermindertem Druck zur Trockne. Man erhält in dieser Weise 174 g eines Öls, das man mit 350 ecm Methanol und 88 ecm 0,5n-Chlorwasserstoffsäure versetzt. Dann erhitzt man 2 Stunden zum Sieden am Rückfluß, kühlt ab, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Methylenchlorid, wäscht, trocknet und destilliert. Man erhält 122 g eines Harzes, das man chromatographiert, wobei man ein Produkt erhält, das man über Nacht bei Raumtemperatur mit 2 Volumen Essigsäureanhydrid und 2 Volumen Pyridin umsetzt. Man engt die erhaltene Reaktionsmischung ein und erhält in dieser Weise das Diacetat des 7a-[4'-Hydroxybutyl]-17ß-hydroxy-östra-4-en-3-ons. F = 113°C.

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Stufe II: 7g-[4'-Hydroxybutyl]-17ß-hydroxy-östra-4-en-3-on

Man beschickt 10 ecm Methanol mit 5 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes. Dann gibt man zu der sich ergebenden Lösung unter Einleiten von Stickstoff 12 ecm 2n-methanolische Kaliumhydroxydlösung. Nach Ablauf einer halben Stunde neutralisiert man mit Essigsäure, verdünnt und extrahiert mit Methylenchlorid. In dieser Weise erhält man 4,3 g 7a-[4'-Hydroxybutyl]-17ß-hydroxy-östra-4-en-3-on, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.

Stufe III; 3,17-Dioxo-östra-4-en-7a-buttersäure

Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in 250 ecm Aceton, rührt bei 0 C und gibt 10 ecm einer 8n-Chromsäureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu. Man rührt während einer weiteren halben Stunde, setzt Methanol und dann Wasser zu. Man vertreibt das Aceton durch Destillation im Vakuum, kühlt mit Eis ab, saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet. Man erhält in dieser Weise 3,9 g 3,17-Dioxo-östra-4-en-7a-buttersäure, die nach der Umkristallisation aus Äthanol (95°) bei 25O°C schmilzt.

Stufe IV: 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäure

Unter Rühren und unter Einleiten von Luft gibt man zu 1500 ecm einer auf einen p„-Wert von 7 gepufferten Lösung, die man durch Neutralisieren einer Lösung von 19 g Monokaliumphosphat in 1450 ecm destilliertem Wasser mit In-Natrxumhydroxydlösung auf einen p„-Wert von 7 und Verdünnen mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 2800 ecm erhalten hat, 3 g Kieselgur (Hyflosupercel). Dann gibt man 3 g 3,17-Dioxo-östra-4-en-7a-buttersäure und schließlich 30 mg Menadion und 30 g eines acetonischen Arthrobacter-Pulvers und 35 ecm Methanol zu. Man beläßt die Suspension während 112 Stunden bei 34 C, wobei man nach Ablauf von 65 Stunden 15 g des acetonischen Pulvers zusetzt. Nach Ablauf von 112 Stunden bringt man die Lösung durch Zugabe einer konzentrierten Natriumhydroxydlösung auf einen p„-Wert von 14, gibt 500 ecm Äthylacetat zu und filtriert. Man säuert das Filtrat mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure

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an, sättigt mit Ammoniumsulfat, dekantiert, reextrahiert mit Äthylacetat, wäscht die Extrakte, trocknet sie und dampft sie zur Trockne ein. Die unlösliche Fraktion wird mit Methanol und Wasser gewaschen. Man bringt das Filtrat durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf einen p„-Wert von 1 und dampft zur Trockne ein. Die beiden trockenen Extrakte werden chromatographisch gereinigt. In dieser Weise erhalt man 1,92 g 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7abuttersäure,die nach der Umkristallisation aus wäßriger Essigsäure bei 2O6°C schmilzt.

IR-Spektrum (Chloroform):

17-C=O des Ketons 1733 cm"¹ Säure 1710 cm"¹

—1 freie OH-Gruppe 1710 cm Aromaten-Banden 1613 cm

-. _?. . 1589 cm"¹ 1499 cm"¹

Beispiel 4

3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5 (10)-trien-7g-buttersäure

Zu 6 ecm 0,5n-Natriumhydroxydlösung und 1 ecm Methanol gibt man 900 mg 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7a-buttersäure. Man rührt, leitet Stickstoff ein, kühlt ab und gibt 100 mg Natriumborhydrid zu* Nach Ablauf 1 Stunde gibt man erneut 100 mg Natriumborhydrid zu, rührt während weiterer 30 Minuten und setzt dann 4 ecm 2n-Chlorwasserstoffsäure zu. Man verdünnt, extrahiert und wäscht. Man trocknet und bringt unter vermindertem Druck zur Trockne. Dann reinigt man den Rückstand chromatographisch und erhält 816 mg 3,17ß-Dihydroxyöstra-1,3,5(10)~trien-7a-buttersäure in Form eines amorphen Produktes.

IR-Spektrum

C=0-Bande 1706 cm"¹

— 1 Aromaten-Bande 1610 cm

1584 cm"¹ 1503 cm"¹

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Beispiel 5

3,16g,17ß-Trihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäure

Stufe I; 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5 (10)-trien-7g-buttersäureäthy!ester

Man bringt 100 mg 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7a buttersäure in 3 ecm Äthanol ein. Man leitet bis zur Sättigung gasförmigen Chlorwasserstoff ein und bringt während 1 Stunde zum Sieden am Rückfluß. Dann destilliert man unter vermindertem Druck zur Trockne und nimmt mit Äthylacetat auf. Man wäscht, trocknet und bringt zur Trockne. Man' chromatographiert den erhaltenen Rückstand und erhält in dieser Weise 81 mg der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7a-buttersäureäthylesters in Form eines amorphen Produktes.

Stufe II: 3,17-Diacetoxy-östra-l,3,5(IQ)-,16-tetraen-7g-buttersäureäthylester

Man bringt 1,41 g 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l, 3, 5 (10)-trien-7ctbuttersäure-äthylester in 30 ecm mehrfach destillierten Essigsäur ei sopropenyl es ter ein. Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 150 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat. Man bringt zum Sieden am Rückfluß und destilliert, wobei man durch Zugabe von Essigsäureisopropenylester ein konstantes Volumen aufrechterhält. Nach 8-stündiger Destillation bringt man die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur, gibt eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung zu, extrahiert mit Methylenchlorid und wäscht. Man trocknet und bringt zur Trockne, wobei man 1,1 g eines Produktes erhält, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.

Stufe III: 3,17ß-Diacetoxy-16a,17a-epoxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäureäthylester

Man löst 936 mg des in des vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes in 10 ecm Methylenchlorid, setzt zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung einen Tropfen Pyridin und dann im Eisbad im Verlauf von 15 Minuten 2,5 ecm einer 1,2-molaren Lösung von Hexafluoraceton-hydroperoxyd in MethylenChlorid zu. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und rührt während

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2 l/2 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre. Dann verdünnt man mit Methylenchlorid, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält 1 g eines Produktes, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.

Stufe IV; 3,16-g~Dihydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(lO)-trien-7g~ buttersäuremethylester

Zu 10 ecm Methanol gibt man 1 g des 3,17ß-Diacetoxy-16g,17gepoxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäureäthylesters. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 1 ecm 6n-Schwefelsäure, rührt die erhaltene Lösung während 30 Minuten bei Raumtemperatur und bringt sie dann während 2 Stunden zum Sieden am Rückfluß. Man' kühlt auf Raumtemperatur ab, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 882 mg 3,16g-Dihydroxy-17-oxo-östral,3,5(10)-trien-7a-buttersäuremethylester.

Stufe V: 3,16 g,17ß-Trihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-buttersäure

Man löst die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen 882 mg des Harzes in 10 ecm Methanol und gibt dann unter Einleiten von Stickstoff 900 mg Natriumborhydrid zu. Nach Ablauf von 1 Stunde und 15 Minuten setzt man 450 mg Natriumborhydrid zu. Man beläßt während 1 weiteren Stunde bei Raumtemperatur und gibt dann 1 ecm destilliertes Wasser und 1 ecm Kalilauge zu. Man erhitzt während 15 Minuten zum Sieden am Rückfluß, bringt auf Raumtemperatur, verdünnt mit Wasser, säuert mit Hilfe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an, extrahiert mit Äthylacetat und wäscht. Dann trocknet man und bringt zur Trockne. Man erhält 795 mg eines Harzes, das man chromatographisch reinigt. In dieser Weise isoliert man 575 mg 3,16g,l7ß-Trihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-7g-buttersäure, die bei 160 bis 170°C schmilzt, [a]^° = +42° (c = 1 %, Äthanol).

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Beispiel 6

3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-undecansäure

Stufe I: Herstellung einer Lösung der Maqnesiumverbindunq des Tetrahydropyranyläthers von 11-Bromundecanol

Man bringt 5 g Magnesiumspäne in 40 ecm Tetrahydrofuran ein. Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man im Verlauf von 2 Stunden eine Lösung, die 65 g des Tetrahydropyranyläthers des ll-Bromundecanols in 200 ecm Tetrahydrofuran enthält. In dieser Weise bereitet man eine 0,4-molare Lösung der Magnesiumverbindung des Tetrahydropyranyläthers des ll-Bromundecanols.

Stufe II; Diacetat des 17ß-Hydroxy-3-oxo-östra-4-en-7g-undecanols

Man verdünnt 150 ecm einer O,4m-Lösung der Magnesiumverbindung des Tetrahydropyranyläthers des ll-Bromundecanols in Tetrahydrofuran mit 50 ecm Tetrahydrofuran. Man bringt die in dieser Weise erhaltene Lösung auf -30 C und gibt 500 mg Kupfer-(I)-chlorid zu. Man rührt die in dieser Weise erhaltene Lösung bei -25 bis -30°C und gibt im Verlauf von 5 Stunden eine Lösung von 16 g 6-Dehydro-19-nortestosteronacetat in 150 ecm Tetrahydrofuran zu.

Die in dieser Weise erhaltene Lösung wird während 1 Stunde bei -30°C gerührt, wonach man 10 ecm Essigsäure zugibt.

Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, gibt Wasser zu, dekantiert, extrahiert mit Diäthyläther, wäscht, trocknet und dampft unter vermindertem Druck zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 44 g eines Harzes, das man in 330 ecm Methanol löst und mit 90 ecm 0,5n-Chlorwasserstoffsäurelösung versetzt. Man erhitzt die in dieser Weise erhaltene Lösung während 45 Minuten zum Sieden am Rückfluß, damoft unter vermindertem Druck zur Trockne ein, nimmt mit Wasser auf und extrahiert mit Methylenchlorid. Man filtriert, trocknet das FiItrat und dampft es zur Trockne ein. In dieser Weise erhält man 34 g eines Harzes, das man chroma'tographisch reinigt.

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Man erhält 24 g des Produktes, das man rait 2 Volumen Essigsäureanhydrid und 2 Volumen Pyridin über Nach bei Raumtemperatur acetyliert. Nach der üblichen Behandlung und chromatographischen Reinigung erhält man 14,3 g des Diacetats des 17ß-Hydroxy-3-oxo-östra-4-en-7a-undecanols.

UV-Spektrum (Äthanol):

Max. 240 nm E \ ^% 312 fc= 16 500

j. cm

304 nin E J *, 2

Stufe III; 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7g-undecanol

Man löst unter einer Stickstoffatmosphäre 14,3 g des Diacetats des 17ß-Hydroxy-3-oxo-östra-4-en-7oc-undecanols in 430 ecm Essigsäure. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 21,5 g Bleitetraacetat, erhitzt die in dieser Weise bereitete Lösung während 4 Stunden auf 110°C, destilliert dann zur Trockne, nimmt den Rückstand mit Wasser auf und extrahiert ihn. Man wäscht, trocknet und destilliert. Man erhält in dieser Weise 16,2 g eines braunen Harzes, das man in 500 ecm Essigsäure löst und mit 80 g Kaliumacetat versetzt. Man erhitzt die Mischung über Nacht zum Sieden am Rückfluß, destilliert dann die Essigsäure ab, nimmt mit Wasser auf und extrahiert. Man chromatographiert das so erhaltene Harz und gewinnt 5,6 g eines Produktes, das man mit 10 Volumen Methanol und 1 Volumen Natronlauge während 15 Minuten am Rückfluß verseift. Das dabei erhaltene Produkt wird chromatographiert, und man erhält 3,24 g amorphes 3,l7ß-Dihydroxy-östra-1,3,5(I0)-trien-7a-undecanol.

UV-Spektrum (Äthanol);

Infl. 220 nm E J ^ 163

230 nm E \ ^% 114
1 cm

Max. 280 nm E , * 52 £,= 2300

1 cm

Infl. 287 nm E \ ^% 46 £= 2050

l cm

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Stufe IV: 3-Monobenzoat des 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(IQ)-trien-7g-undecanols

Zu einer Mischung aus 15 ecm In-Natriumhydroxydlösung und 7 ecm Aceton gibt man 3,2 g 3,17ß-Dihydroxy~östra-l,3,5(10)-trien-7aundecanol. Man kühlt die Lösung in einem Eisbad ab und gibt unter Rühren tropfenweise 2,3 ecm Benzoylchlorid zu. Man rührt während 15 Minuten, verdünnt dann mit Wasser und extrahiert. Man chromatographiert den Rückstand der organischen Phase und erhält 2,64 g des 3-Monobenzoats des 3,17ß-Dihydroxy-östra-1,3,5 (10)-trien-7oc-undecanols.

Stufe V; Benzoat der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3₇5(lO)-trien-7g-undecansäure

Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in 130 ecm Aceton. Zu der gerührten und auf +5 C abgekühlten Lösung gibt man im Verlauf von 15 Minuten 4,1 ecm eines 8n-Heilbron-Oxydationsreagens. Nach 5 Minuten weiteren Rührens gibt man Methanol zu, verdünnt mit Wasser, engt unter vermindertem Druck ein und extrahiert mit Äthylcetat. Man wäscht die Extrakte, trocknet sie und bringt sie zur Trockne. Man erhält in dieser Weise den Benzoesäureester der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-1,3,5(10)-trien-7a-undecansäure.

Stufe VI: 3,l7ß-Dihydroxy-östra-l_t3,5(10)-trien-7g-undecansäure

Man löst den Benzoesäureester der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-1,3,5(10)-trien-7a-undecansäure in 50 ecm Methanol, gibt zu er erhaltenen Lösung 10 ecm 2n-Natriumhydroxydlösung, kühlt nach Ablauf einer Stunde mit einem Eisbad und gibt 1,5 g Natriumborhydrid zu. Man rührt während 1 Stunde, säuert auf einen ρ -Wert von 1 an und extrahiert. Man wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man chromatographiert über SiIiciumdioxyd und gewinnt in dieser Weise 1,61 g der 3,l7ß-Dihydroxy-östra-1,3 ,5 (10)-trien-7oc-undecansäure.

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UV-Spektrum (Äthanol):

Infl.	219	nm	7	E	1 1	cm	160
	229	nm	E	1 1	cm	115
Max.	280	nm	E	1 1	cm	46
Infl.	286	nm	E	1 1	cm	42
Beispiel

= 2100

7-Carboxymethoxyimino-östra-1,3,5(10)-trien-3,17ß-diol

Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom löst man 2 g 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7-on und 2 g Aminoessigsäure-hemihydrochlorid in 18 ecm ln-Natriumhydroxydlösung. Man erhitzt die erhaltene Lösung zum Sieden am Rückfluß und hält sie während 1 Stunde unter einem Stickstoffstrom. Dann kühlt man die Reaktionsmischung auf 0°C ab, gibt 9 ecm ln-Chlorwas~ serstoffsäurelösung und 100 ecm Wasser zu. Man extrahiert mit Äthylacetat, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 2,735 g eines Produktes, welches man chromatographiert. In dieser Weise erhält man 2,44 g 7-Carboxymethoxyimino-östra-1,3,5(10)-trien-3,I7ß-diol.

IR-Spektrum:

C=0-rBande 1727 cm"¹

-1

Aromaten-Banden 1618 cm

n" -1

1592 cm"*¹

1506 cm

Beispiel 8

7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-17-on

Zu 122 ecm Aceton gibt man 2,44 g 7-Carboxymethoxyimino-östral,3,5(10)-trien-3,17ß-diol. Man kühlt auf 0°C ab und gibt tropfenweise 0,84 ecm einer 8n-Bromsäureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu (Heilbron-Jones-Lösung). Man rührt während

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30 Minuten bei O⁰C und gibt erneut O,84 ecm der Heilbron-Jones-Lösung zu. Nach Ablauf von 3 Stunden gibt man 0,41 ecm der Heilbron-Jones-Lösung zu, rührt erneut während 30 Minuten und gibt erneut tropfenweise 2 ecm Methanol und schließlich 10 ecm einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung zu. Man saugt ab, wäscht mit Aceton, engt ein und gibt 200 ecm Äthylacetat zu. Man wäscht, trocknet und engt zur Trockne ein. Man erhält 2,135 g eines Harzes, das man chromatographisch reinigt. Man gewinnt in dieser Weise 1,848 g 7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-17-on.

Analyse; C₂₀H₂₃O₅N

Berechnet: C 6 7,21 H 6,48 N 3,91 %
Gefunden: 67,1 6,7 3,6 %

Beispiel 9

4'-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3_t17ß-dihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-7-ons

Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom gibt man zu 10,2 ecm Methanol 1,8 g N-Carboxyhydrazidoglycinsäure-kaliumsalz und 8,9 g einer methanolischen Lösung, die 43 mg Chlorwasserstoff säure pro ecm enthält. Man erhitzt die erhaltene Suspension unter Stickstoff zum Rückflußsieden und gibt 1,020 g 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7-on zu. Nach 3 Stunden kühlt man ab, saugt ab und wäscht. Man erhält in dieser Weise 2 g eines Harzes, zu dem man 50 ecm einer Lösung von Diazomethan in Methylenchlorid (Titer 12,1 g pro 1) zusetzt. Man beläßt während 1 Stunde bei 0 C, saugt dann den gebildeten Niederschlag ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man erhält 1,926 g eines Harzes, das man chromatographiert, wobei man 825 mg eines Produktes erhält, das man in 8 ecm Methanollöst. Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 3 ecm In-Natriumhydroxyd— lösung. Man beläßt die Reaktionsmischung während 20 Minuten bei Raumtemperatur, kühlt dann mit Eis und gibt 3 ecm In-Chlorwasserstoffsäurelösung und 5 ecm Wasser zu. Man saugt ab, wäscht und trocknet die erhaltenen Kristalle. In dieser Weise

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erhält man 3,43 mg 4^l-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7-ons.

Beispiel.10

Triäthylaminsalz des 7-Carboxymethoxyimino-östra-l,3,5(10)-trien-3,17ß-diols

Zu 10 ecm Äthanol gibt man 1 g 7-Keto-östra-l,3,5(lO)-trien-3,17ß-diol (hergestellt nach der in der US-PS 2 418 603 beschriebenen Verfahrensweise). Dann gibt man 1 g Aminooxyessigsäure-hemihydrochlorid zu. Zu der erhaltenen Suspension gibt man 8 ecm In-Natriumhydroxydlösung, läßt die erhaltene Lösung sich im Verlauf von 3 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen, setzt 8 ecm ln-Chlorwasserstoffsäure zu, verdünnt und extrahiert mit Äthylacetat. Man wäscht, trocknet und destilliert. Man erhält 1,23 g eines Harzes.

IR-Spektrum (Äthanol):

C=0-Bande 1748 cm"¹
OH-Bande 3607 cm"¹

Man gibt die 1,23 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Harzes zu 10 ecm Äthylacetat und gibt zu der erhaltenen Lösung 0,5 ecm Triäthylamin und 4 ecm Methanol. Man engt die Lösung durch azeotropes Abdestillieren des Methanols ein und hält durch Zugabe von Äthylacetat ein konstantes Volumen aufrecht. Nach dem Vertreiben des Methanols gibt man 0,2 ecm Triäthylamin zu, kühlt mit Eis, saugt ab und wäscht. Man erhält 1,4 g eines Produktes, das man umkristallisiert. In dieser Weise ergeben sich 0,990 g des Triäthylaminsalzes des 7-Carboxymethoxyimino-östra-1,3,5(10)-trien-3,17ß-diols, F = etwa 195°C, [a]p° = +21° (1 % Äthanol).

Anwendung 1

Konjugat aus Rinderserumalbumin und 3-Hydroxy-17-oxo-östra-1,3,5(10)-trien-llß-buttersäure

Man bringt 178 mg 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-llß-

Dioxan ein. Danr

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buttersäure in 5 ecm Dioxan ein. Dann gibt man bei 12 C

0,23 ml Tri-n-butylamin und 0,063 ml Chlorameisensäureisobutylester zu. Man hält die Temperatur der erhaltenen Lösung während 20 Minuten bei 12°C. Dann gibt man zu der erhaltenen Lösung bei 0°C eine Lösung, die 0,770 g Rinderserumälbumin in 22 ecm Wasser enthält. Nach der vollständigen Auflösung gibt man bei O⁰C 22 ecm Dioxan und 0,74 ecm einer ln-Natriumhydroxydlösung zu. Man beläßt die Lösung während 4 Stunden bei 0 C. Dann dialysiert man die Lösung während 18 Stunden durch eine Membran· Man fällt die Lösung, indem man sie mit Hilfe einer 2n-Chlorwasserstoffsäurelösung auf einen p_H-Wert von 4,2 einstellt. Man kühlt die Lösung während 68 Stunden auf -20 C.

Man läßt den Eisklumpen schmelzen und dekantiert dann das Produkt. Den erhaltenen Niederschlag löst man in 50 ecm einer l%-igen Bicarbonatlösung unter Eiskühlung. Man dialysiert die Lösung erneut während 48 Stunden durch eine Membran. Dann extrahiert man die Lösung mit Chloroform und isoliert das erhaltene Produkt durch Gefriertrocknung. Man erhält 720 mg des Konjugats aus Rinderserumalbumin und 3-Hydroxy-17-oxoöstra-1,3,5(10)-trien-llß-buttersäure.

UV-Spektrum (Äthanol):

Infl. 262 nm e|^ 6,6

Infl. 270 nm E J ^_m 9

Max. 281 nm E } ^ 11,8

1 cm

Anwendung 2

Konjugat aus Rinderserumalbumin und 3,17ß-Dihydroxy-östra-1_f 3,5(10)-trien-llß-buttersäure

In gleicher Weise, wie bei der Anwendung 1 beschrieben, bereitet man das Konjugat aus 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trienllß-buttersäure und Rinderserumalbumin, indem man das durch Umsetzen von 3,17ß-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-llß-buttersäure und Chlorameisensäureisobutylester erhaltene gemischte Anhydrid einsetzt.

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UV-Spektrum (Wasser + Dioxan): Inf1. 270 nm ^E 1 cm ⁸

Max. 279 nm E } ^% 11

1 cm

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Claims

Patentansprüche 1.) Steroid-Haptene der allgemeinen Formel (I)

in der

.OH X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel ζ ,

"H

Y ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe und

entweder R^ eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH₂) COpH, in der a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3 darstellt, in der η O, 1 oder 2 bedeutet,

und _p

R~ eine Gruppe der Formel C

* *H

oder R. ein Wasserstoffatom und

/CH₂ )_b CO₂H Rp eine Gruppe der allgemeinen Formel/

worin b eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 18 darstellt,

oder R₂ eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel =NZ-(CH₂)_C CO₂H, in der Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen,

bedeuten.
2.) Haptene der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R^ eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH₂) CO₂H, in der a die in Anspruch 1 angegebene Bedeu-

, H tung besitzt und R_? eine Gruppe der Formel ζ

bedeuten.

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3.) Haptene der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R^ ein Wasserstoffatom und R₂

^"(CH₂)_b CO₂H eine Gruppe der allgemeinen Formel C - , in der

b die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, bedeuten.
4.) Haptene der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe R₁ ein Wasserstoffatom und die Gruppe R₂ eine Gruppe der allgemeinen Formel S=NZ-(CH₂) CG₂H, worin Z und c die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen,, bedeuten.
5.) Verfahren zur Herstellung der Haptene gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)

^K ^¹ OL

in der K und K' in Form des Ketals blockierte Ketogruppen und L eine Acylgruppe bedeuten, der Einwirkung eines Epoxydierungsmittels und dann der Einwirkung eines Verseifungsmittels unterzieht, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (III)

<fcr^0H ■■■■■

erhält, die man mit einem Allylmagnesiumhalogenid zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (IV)

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CH=CH₂

ic

(IV)

umsetzt, die man mit einem Deketalisierungsmittel und dann mit einem Cyclisierungsmittel umsetzt, so daß man eine Verbindung der Formel (V)

(V)

erhält, die man mit einem Aromatisierungsmittel zu einer Verbindung der Formel (VI)

-OH

(VI)

umsetzt, deren Hydroxygruppen man in Form des Esters blokkiert, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (VII)

KC=CK^

I ~

L¹O

ÖL·¹

(VII)

erhält, in der L' eine Acylgruppe bedeutet, wonach man die Verbindung der allgemeinen Formel (VII) einer Ozonolysereaktion unterzieht, so daß man eine Verbindung der allgemei-

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nen Formel (VIII)

L'O

- 39 -

CH=O

(VIII)

erhält, die man mit einem Dialkylphosphonocarbonsaurealkylester der folgenden allgemeinen Formel

R₁O

P-CH₂(CH=GH)_n

in der R>, R- und R^, die gleichartig oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten und η die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, und dann mit einem Verseifungsmittel umsetzt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (IX)

(IX)

erhält, die man mit einem Hydrierungsmittel zu einem Hapten der allgemeinen Formel (I) umsetzt, in der R^ eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH₀) CO₀H, worin a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3 bedeutet und η die in An- . spruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, X eine Gruppe der

^0H
Formel ^ , Y ein .Wasserstoffatom und F

^-H

Formel

j eine Gruppe der bedeuten, das man gewünschtenfalls mit einem

Oxydationsmittel zu einem Hapten der allgemeinen Formel (I)

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umsetzt, in der R. eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CHp) COpH, worin a eine ganze Zahl mit einem Wert von 2n + 3 darstellt, in der η die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, X ein Sauerstoffatom, Y ein Wasserstoff-

atom und R_? eine Gruppe der Formel c bedeuten.

^N*H
6.) Verfahren zur Herstellung der Haptene gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XII)

(XII)

in der L eine Acylgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

Hai Mg (CH₂)_b CH₂OM

in der Hai ein Chlor- oder Brom-Atom und OM eine in Form des Äthers blockierte Hydroxygruppe bedeuten und b die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt, das erhaltene Produkt mit einem sauren Mittel und das dann anfallende Produkt mit einer Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D eine Acylgruppe darstellt, oder einem funktioneilen Derivat dieser Säure umsetzt, so daß man eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (XIII)

erhält, die man mit einem Verseifungsmittel zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (XIV)

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(XIV) ·

umsetzt, worauf man diese Verbindung mit einem Oxydationsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XV)

(CK₂)

₂)_b

umsetzt, die man mit einem Dehydratisierungsmittel behandelt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XVI)

:0

(XVI)

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel (I), in der R. ein Wasserstoffatom, X ein Sauerstoffatom, Y ein Wasserstoffatom und R₂ eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel * (CH₂), CO₂H

, in der b eine ganze Zahl mit einem Wert

von 3 bis 18 darstellt, bedeuten, erhält, die Verbindung der allgemeinen Formel (XVi;) entweder mit einem Reduktionsmittel zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel (XVII)

-OH

_b CO₂H

(XVII)

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d.h. einem Hapten der allgemeinen Formel (I), in der R₁ ein Wasserstoffatom, X eine Gruppe der Formel * , Y ein

Wasserstoffatom und Rp eine Gruppe der allgemeinen Formel

)J₃ CO₂H

, in der b eine ganze Zahl mit einem Wert

^* H

von 3 bis 18 darstellt, bedeuten, umsetzt

oder mit einem Alkohol der allgemeinen Formel TOH, in der T eine Alkylgruppe bedeutet, oder einem funktioneilen Derivat dieses Alkohols zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel(XVIII)

.(XVTII)

(CH₂;_b ^₂ ¹ ■ : ' ·

umsetzt, die man mit einer Säure der allgemeinen Formel VOH, in der V eine Acylgruppe darstellt, oder einem funktio eilen Derivat dieser Säure zur Veresterung der Hydroxygruppen in der3-Stellung und der enolischen Hydroxygruppe in der 17-Stellung umsetzt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XIX)

erhält, die man mit einem Epoxydierungsmxttel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XX)

(XX)

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umsetzt, welche man hydrolysiert, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XXI)

erhält, die man mit einem Reduktionsmittel und dann mit einem Verseifungsmittel umsetzt, wobei sich eine Verbindung der allgemeinen Formel (XXII)

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel (I) ergibt, in der

Ry. ein Wasserstoff atom, X eine Gruppe der Formel *^ , Y eine OH-Gruppe, Rp eine Gruppe der allgemeinen Formel ), COpH

, worin b eine ganze Zahl mit einem Wert

von 3 bis 18 darstellt, bedeuten.
7.) Verfahren zur Herstellung der Haptene gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (XXIII)

^ OH

(XXIII)

mit einer Verbindung der allgemeinen Formel

HpN Z (CHp) COpH

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in der Z und c die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, umsetzt, so daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XXIV)

(XZIY)

HZ(ClI₂) _c.CO₂H

d.h. ein Hapten der allgemeinen Formel (I) erhält, in der

^GH
R₁ ein Wasserstoffatom, X eine Gruppe der Formel ^ j

Y ein Wasserstoffstom und R₂ eine Gruppe der allgemeinen =NZ (CHp) COpH, in der Z ein Sauerstoffatom oder eine
Gruppe der Formel -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen, bedeuten, die man gewünschtenfalls mit einem Oxydationsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XXV)

d.h. einem Hapten der allgemeinen Formel (I) umsetzt, in der R^ ein Wasserstoffatom, X ein Sauerstoffatom, Y ein Wasserstoffstom und R~ eine Gruppe der allgemeinen Formel =NZ (CH₀) CO_nH- in der Z ein Sauerstoffatom oder eine
Gruppe der Formel -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen, bedeuten.

A OT- H:

stellung von Antigenen, dadurch gekeiinzeiehrr^E^ daß man ein Hapten der allgemeinen^EoÄirsT^Tl) mit einem Halogenameisen säur ealk^Lee-teirzu einem gemischten Anhydrid umsetzt,

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