DE2429040C2 - Steroid-Haptene, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

Steroid-Haptene, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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DE2429040C2
DE2429040C2 DE2429040A DE2429040A DE2429040C2 DE 2429040 C2 DE2429040 C2 DE 2429040C2 DE 2429040 A DE2429040 A DE 2429040A DE 2429040 A DE2429040 A DE 2429040A DE 2429040 C2 DE2429040 C2 DE 2429040C2
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Description

in der Z und c die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, umsetzt, und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XXIV)
(XXIV)
HO NZ(CH2)CCO2H
mit einem Oxydationsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XXV)
HO
NZ(CH2)CCO2H
umsetzt.
6. Verwendung der Haptene der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung von Antigenen.
Die Erfindung betrifft Steroid-Haptene der allgemeinen Formel I
HO
in der
X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel OH
20
(XXV)
30
35
40
45
50
60
Y ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gmppe und
65
R1 eine Gruppe der Formel -(CH2)^CO2H, worin α eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 η + 3, worin η 0,1
oder 2 bedeutet, darstellt, und
R2 eine Gruppe der Formel
H
H -
ίο oder : - ■ ■_
R1 ein Wasserstoffatom und
R2 eine Gruppe der Formel
(CH2VCO2H
\
H
in der b eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 18 darstellt,
oder
R2 eine Gruppe der Formel = NZ-(CH2)^CO2H, worin Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe -NHCONH- und c eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen,
bedeuten.
Die Gruppe der Formel -(CH2)^CO2H steht vorzugsweise für den Rest der Buttersäure oder der Hexansäure.
Die Gruppe der Formel -(CH2)0CO2H steht vorzugsweise für den Rest einer Alkancarbonsäure mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie den der Buttersäure, der Isobuttersäure, der Pentansäure, der Undecansäure oder der Dodecansäure.
Die Gruppe der Formel -(CH2)^CO2H stellt vorzugsweise den Rest einer aliphatischen Carbonsäure mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen dar, z. B. den Rest der Essigsäure, der Propionsäure, der Buttersäure, der Isobuttersäure oder der Pentansäure.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Haptene der allgemeinen Formel I, in der R[ eine Gruppe der Formel -(CH2)eCO2H, in der α die oben angegebene Bedeutung besitzt und R2 die Gruppe der Formel
bedeuten.
Als besonders bevorzugte Haptene kann man insbesondere nennen die3,17jff-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trienlljff-buttersäure und die 3-Hydroxy-17-oxoöstra-l,3,5(10)-trien-llj8-buttersäure.
Die Erfindung betrifft ferner die Haptene der allgemeinen Formel I, in der die Gruppe R, ein Wasserstoffatom und die Gruppe R2 eine Gruppe der Formel
(CHj)6CO2H
in der b die oben angegebene Bedeutung besitzt, darstellen.
Bevorzugte Haptene dieser Art sind insbesondere:
3,17/3-Dihy droxyöstra-1,3,5( 10)-tricn-7 «-buttersäure,
3 -Hydroxy-17-oxoöstra-1,3,5( 10>trien-7 «-buttersäure,
3,16ff,17j8-Trihydroxyöstra-13,5(10>trien=7e-buttersäufe und
3,17/J-Dihydroxyöstra-1,3,5(10)-trien-7 a-undecansäure.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Haptene der allgemeinen Formel I, in der die Gruppe R1 ein Wasserstoffatom und die Gruppe R2 eine Gruppe der Formel = NZ-(CH2)CCO2H, in der c und Z die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, bedeuten.
Von diesen Haptenen sind insbesondere die folgenden zu nennen:
7-Carboxymethoxyiminoöstra-13,5(10)-trien-3,17jS-diol,
7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxyöstra-1^4(10)-trien-17-on und
das 4'-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3,17j8-Dihydroxyöstra-l^^(10)-trien-7-ons. >
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Haptene der allgemeinen Formel I zur Herstellung von Antigenen.
Insbesondere die Verwendung der Haptene der allgemeinen Formel I zur Herstellung von Antigenen, die dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Hapten der allgemeinen Formel I mit Hilfe eines Halogenameisensäurealkylesters und insbesondere des Chlorameisensäureisobutylesters in ein gemischtes Anhydrid überfuhrt und dieses Anhydrid auf dem Albumin von Rinderserum fixiert.
Ein Beispiel für die Herstellung eines derartigen Antigens ist weiter unten in den Beispielen beschrieben. Ausgehend von diesen Antigenen, ist es möglich, nach den klassischen Methoden und insbesondere nach dem Verfahren von Erlanger (»J. Biol. Chem.«, 228, 7 13) Antikörper zu bereiten.
Die in dieser Weise erhaltenen Antikörper sind für Steroide der allgemeinen Formel I spezifisch, in der B1, X, Y und R2 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen. Sie können z. B. spezifisch sein für Östron, Östradiol oder Östriol. Dieses spezifische Verhalten wird nach klassischen Verfahrensweisen nachgewiesen und insbesondere nach der Gleichgewichtsdialysemethode. Dieses spezifische Verhalten macht die in dieser Weise bereiteten Antikörper als Bestimmungsmittel für die Produkte der allgemeinen Formel I, und insbesondere für Östran, Östradiol oder Östriol geeignet, wobei ein besonderes Interesse dafür besteht, den Östriolspiegel im Blut und im Harn von schwangeren Frauen zu bestimmen, was es möglich macht, gegebenenfalls gewisse Anomalien des Fötus festzustellen. _
Gegenüber dem aus Steroids (21) 2 (19Ii), S. 259 bis 283 bekannten, strukturell ähnlichen 3,16a,17jS-Trihydroxy-östra-lr3,5(10)-trien-6-(O-carboxymethyl >oxim zeichnen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen nach ihrer Überführaag in das Rinderserumalbuminkonjugat durch eine höhere Sensibilität gegenüber Östradiol aus.
Die Erfindung betrifft femer ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel Ia
HO2C-(CH2),
da)
in der α und X die oben angegebene Bedeutung besitzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II
(Π)
10
15
20
25
30
35
40 45
in der K und K' eine in Form des Ketals blockierte Ketofunktion und L eine Acylgruppe bedeuten, der Einwirkung eines Epoxydierungsmittels und dann der Einwirkung eines Verseifungsmittels unterzieht, daß iaan die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel III
OH
(UI)
mit einem Allylmagnesiumhalogenid umsetzt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel IV
60 65
mit einem Deketalisierungsmittel und dann mit einem Cyclisierungsmittel behandelt, und die Verbindung der Formel V
CH=CH2 CH2
OH
10
20 25 30 35
OH
die Hydroxygruppen in Form des Esters blockiert und den Ester der allgemeinen Formel VII HC = CH2
CH2 OL'
45
(W)
mit einem Acylhalogenid odf r Essigsäureanhydrid und anschließend einem Verseifungsmittel behandelt, daß man in der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel VI
OH
50 55 60 65
LO
(VII)
in der die Gruppe L'eine Acylgruppe darstellt, einer Ozonolyse unterwirft, daß man den erhaltenen Aldehyd der allgemeinen Formel VIII
(VIII)
L'O
mit einem Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester der allgemeinen Formel
RiO O
Ml
P-CH2-(CH=CH)11CO2R3
R2O
in der R,, R2 und R3, die gleichartig oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten und η die oben angegebene Bedeutung besitzt, und anschließend mit einem Verseifungsmittel umsetzt, und daß man die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel IX
(CH=CH)n+1CO2H H2C OH
15
20
hydriert und gewünschtenfalls die OH
-Gruppe
zur Carbonylgruppe oxidiert.
Die Substituenten K und K', die gleichartig oder verschieden sein können, stellen vorzugsweise cyclische Alkylketalgruppen mit 2 bis 4 kohlenstoffatomen und insbesondere die Athylenketalgruppe oder die Propylenketalgruppe oder eine Dialkylketalgruppe, z. B. die Dimethylketalgruppe oder die Diäthylenketalgruppe, dar.
Die Gruppe L bedeutet vorzugsweise den Acylrest einer aliphatischen oder cycloaliphatische^ gesättigten oder ungesättigten Säure und insbesondere den Rest einer Alkancarbonsäure, wie der Essigsäure, der Propionsäure, der Buttersäure, der Isobuttersäure oder der Undecansäure, oder den Rest einer Cycloalkylcarbonsäure oder einer Cycloalkylalkancarbonsäure, wie z. B. den Rest der Cyclopropancarbonsäure, der Cyclopentancarbonsäure oder der Cyclohexancarbonsäure, der Cyclopentanessigsäure, der Cyclopentanpropionsäure, der Cyclohexanessigsäure oder der Cyclohexanpropionsäure, der Benzoesäure oder den Rest einer PhenylaJkancarbonsäure, wie den Rest der Phenylessigsäure oder der Phenylpropionsäure, oder den Rest einer Aminosäure, wie den Rest der Diäthylaminoessigsäure, der Asparaginsäure oder der Ameisensäure.
Als Epoxydierungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Persäure, z. B. die Peressigsäure, die Perphthalsäure oder die m-Chlorperbenzoesäure.
Als Verseifungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Alkalibase, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-butylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin, wobei man die Verseifungsreaktion vorzugsweise in Gegenwart eines niedrigmolekularen Alkohols, wie Methanol oder Äthanol, durchführt.
Als Allylmagnesiumhalogenid setzt man vorzugsweise Allylmagnesiumchlorid oder Allylmagnesiumbromid ein.
Das verwendete Deketalisierungsmittel ist vorzugsweise ein saures Mittel, z. B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Citronensäure oder p-Toluolsulfonsäure. Diese Deketalisiening kann in Gegenwart so sines oder mehrerer Lösungsmittel, wie eines Alkohols, wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol, eines Ketons, wie Aceton, oder eines Kohlenwasserstoffs, wie Benzol oder Toluol, erfolgen.
Als Cyclisierungsmittel kann man ein saures oder basisches Mittel verwenden, wobei man vorzugsweise ein basisches Mittel und insbesondere ein Alkalimetallalkoho'at, -/Av Natriummethylat, Natriumäthylat, Natriumtert.-butylat oder Kalium-tert.-butylat einsetzt.
Als Acylhalogenid verwendet man z. B. ein Acctylhalogenid, vorzugsweise Acetylbromid, oder auch Essigsäureanhyrid, wobei man anschließend als Verseifungsmittel vorzugsweise eines der oben erwähnten anwendet.
Als Veresterungsmittel verwendet man vorzugsweise eine Säure oder ein funktionelles Derivat der Säure, beispielsweise ein Säurehalogenid, z. B. ein Säurebromid oder ein Säurechlorid oder auch ein Anhydrid der Säure.
Die für L bevorzugten Bedeutungen sind auch für die Gruppe L' bevorzugt.
Als Mittel für die Ozonolyse verwendet man Ozons wobei man die Ozonolyse bei einer Temperatur zwischen -500C und -1000C durchführt.
Der verwendete Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester der folgenden allgemeinen Formel
65
RiO O \ll
P-CH2-(CH = CH)nCO2R3
R2O
ist vorzugsweise eine Verbindung, in der die Gruppen R, und R2 identisch sind und Alkylgruppen mit 1 bis ( Kohlenstoffatomen darstellen und die Gruppe R3 eine Alkylgruppe mit ebenfalls 1 bis 6 KohlenstofTatomei bedeutet.
ίο Das verwendete Verseifungsmittel ist vorzugsweise eine Alkalimetallbase, wie Natriumhydroxyd ode Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-butylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin.
Als Hydrierungsmittel verwendet man vorzugsweise Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators, wie ζ. Β Palladium.
Als Oxydationsmittel setzt man vorzugsweise Chromsäureanhydrid, Silbercarbonat, Silbersilicat oder Blei tetraacetat ein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung der genann ten Haptene verwendet man
als Epoxydierungsmitte! die Perphthaisäure,
als Allylmagnesiumhalogenid Allylmagnesiumbromid,
als Deketalisierungsmittel Schwefelsäure,
als Cyclisierungsmittel Natriumhydroxyd,
als Aromatisiemngsmittel Essigsäureanhydrid,
als Verseifungsmittel nach der Aromatisierung Natriumhydroxyd,
als Veresterungsmittel Benzoylchlorid,
als Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester Diäthylphosphonoessigsäuremethylester,
als Hydrierungsmittel Wasserstoff in Gegenwart von Palladium,
als Verseifungsmittel Kaliumhydroxyd und
als Oxydationsmittel Chromsäureanhydrid.
Die als Ausgangsmaterialien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formel II können nach der in der FR-PS 14 97 593 beschriebenen Methode hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel I b
r it r " ν
HO' " " (CH2)6CO2H
in der b, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XII
(XID
in der L eine Acylgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
HaIMg —(CH2)4 CH2O M
in der Hai ein Chlor- oder Brom-Atom und OM eine in Form eines Äthers blockierte Hydroxygnippe bedeuten und b die oben angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt und das erhaltene Produkt mit einem sauren Mittel umsetzt, das gebildete Produkt mit einer Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D eine Acylgruppe bedeutet, oder einem funktioneilen Derivat dieser Säure umsetzt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XIII
(XUD
O (CHj)4CH2OD
mit einem Verseifungsmittel behandelt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XIV
OH
10
(XIV)
(CHj)4CH2OH
mit einem Oxydationsmittel behandelt und die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XV
■>
20
(XV) 25
(CH2J6CO2H
der Einwirkung eines Dehydrierungsmittels unterzieht, und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der allgf meinen Formel XVI
35
HO (C H2)^CO2H
entweder mit einem Reduktionsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel XVII
OH
HO
(XVE)
(CH2), CO2H
umsetzt,
oder die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XVl mit einem Alkohol der allgemeinen Formel TOH, in der T eine Alky!gruppe bedeutet, oder einem funktioneilen Derivat dieses Alkohols umsetzt, in der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel XVm
(XVffl)
HO
45
50
55
60
(CH2XCO2T
mit einer Säure der allgemeinen Formel VOH, in der V eine Acylgruppe bedeutet, oder einem funktionellen Derivat dieser Säure die Hydroxygruppe in der 3-Stellung und die enolische Hydroxygruppe in der 17-Stellung verestert, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XIX
OV
(XIX)
VO (CH2)^CO2T
mit einem Epoxydierungsmittel umsetzt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XX
OV
(XX)
VO (CHi)11CQjT
hydrolysiert und die erhaltene Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XXI
(XXD
OH
HO (CH2)6CO2T
zu einer Verbindung der allgemeinen Formel XXII
OH
HO
(ΧΧΠ)
OH
(CH2). CO2H
reduziert und verseift.
Die Gruppe L besitzt die gleichen bevorzugten Bedeutungen, wie sie weiter oben angegeben sind. Hai stellt ein Chlor- oder Brom-Atom dar. Bei der Gruppe M handelt es sich vorzugsweise um eine Benzylgruppe oder eine Tetrahydropyranylgruppe.
Als saures Mittel verwendet man vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Citronensäure, Essigsäure oder p-Toluolsulfonsäure; als Veresterungsmittel benützt man vorteilhafterweise eine Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D irgendeine der oben angegebenen Bedeutungen von L besitzen kann, oder ein funktionelles Derivat einer derartigen Säure. Als Verseifungsmiitel sind die oben erwähnten Verseifungsmittel bevorzugt, insbesondere eine Alkalimetallbase, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, Natriumamid, Kalium-tert.-butylat oder Lithiumacetylid in Äthylendiamin, wobei die Verseifungsreaktion in einem niedrigmolekularen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol durchgeführt wird. Als Oxydationsmittel setzt man die oben erwähnten Oxydationsmittel und insbesondere Chromsäureanhydrid ein. Die Dehydrierung erfolgt vorzugsweise auf biochemischen Wege, insbesondere durch die Anwendung des Bacteriums »Arthrobacter Simplex«. Das Reduktionsmittel der Wahl ist Wasserstoff, den man in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladium, einsetzt. Als Veresterungsmittel für die Verbindung der allgemeinen Formel XVI verwendet man vorzugsweise einen Alkohol der allgemeinen Formel TOH, in der T eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet. Das Veresterungsmittel, das in der Lage ist, die Hydroxygruppe in der 3-Stellung und die enolische Form der Ketofunktion in der 17-Stellung zu verestern, ist vorzugsweise ein Säureanhydrid, beispielsweise Essigsäureanhydrid oder ein Derivat der folgenden allgemeinen Formel
OR4
H3C-C=CH2
in der R4 eine Acylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, darstellt. Als Epoxydierungsmittel setzt man vorzugsweise eine Persäure, wie Perchlorsäure oder Perphtfaalsäure, oder Hexafluoracetonhydroperoxyd ein. Die Hydrolyss bewerkstelligt man in saurem Medium, insbesondere in schwefelsaurem oder essigsaurem Medium. Als Reduktionsmittel benützt man mit Vorteil ein gemischtes Hydrid, beispielsweise Natriumborhydrid oder Lithiumborhydrid. Als Verseifungsmittel kann man irgendeines der oben
erwähnten Verseifungsmittd einsetzen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des genannten erfindungsgemäßen Verfahrens
stellt L eine Acetylgruppe dar,
bedeutet Hai ein Chloratom,
stellt M eine Tetrahydropyranylgruppe dar,
verwendet man als Säure die Chlorwasserstoffsäure,
benützt man als Veresterungsmittcl Essigsäureanhydrid,
setzt man als Veresterungsmittel methanolisches Kaliumhydroxyd ein, verwendet man als Reduktionsmittel Natriumborhydrid,
bewirkt man die Veresterung der Säurefunktion vorzugsweise mit Äthylalkohol, verwendet man als Veresterungsmittel für die Hydroxygruppe in der 3-Stellung und die enolische Form des Ketons in der 17-Stellung Essigsäureisopropenylester,
benützt man als Epoxydierungsmittel Hexafluorar.etonhydroperoxyd,
bewirkt man die Hydrolyse in schwefelsaurem Medium, is
wendet man als Hydrierungsmittel Natriumborhydrid an und
bewerkstelligt man die Verseifung mit Kaliumhydroxyd in methanolischem Medium.
Die als Ausgangsmaterialien Ringp-sctztcn Verbindungen der allgemeinen Forme! XII können nach der in der FR-PS 11 8C-907 angegebenen Methode bereitet werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Haptene der allgemeinen Formel Ic
HO
(Ic)
worin X, Z und c die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel XXIII
OH
(ΧΧΠΓ)
HO O
mit einer Verbindung der folgenden all5iiueinen Formel
H2NZ-(CH2)cCO2H
umsetzt, in der Z und c die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel XXTV
(XXIV)
HO NZ(CH2^CO2H
mit einem Oxydationsmittel zu einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel XXV
25
30
35
40
45
(XXV)
NZ(CHj)cCO2H
60
65
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man die Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
H2NZ-(CH2^CO2H
in der Z und c die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in Form des Hydrochlorids, während man als Oxydationsmittel irgendeines der oben erwähnten Oxydationsmittel, vorzugsweise Chromsäureanhydrid, einsetzt Das als-Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte 7-Ketoöstradiol kann nach der in der US-PS 24 18 603 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt werden, ίο Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
Beispiel 1 Herstellung der3,17J/8-DihydroxyÖ3tra-l,3,5(10)-trien-lljff-buttersäure
Stufe I
Bis-3 β ,5,5-äthylendioxy-9 a,\ 1 a-epoxy-4,5-seco-östra-17jff-ol Stufe A
In 220 ecm Tetrahydrofuran bringt man 21,9 g des Benzoesäureesters des Bis-S^^^-äthylendioxy-^^-secoöstra-9(l l)-en-17^-ols (das man nach dem in der FR-PS14 97 593 beschriebenen Verfahren hergestellt hat) ein. Dann gibt man unter Rühren und bei 200C 22 g Monoperphthalsäure zu, läßt die Reaktionsmischung während etwa 16 Stunden stehen und gießt sie dann in eine gesättigte Bicarbonsäurelösung. Man saugt ab und wäscht den erhaltenen Niederschlag. In dieser Weise erhält man 22,2 g eines bei 1600C schmelzenden Produktes, das man io, wie es ist, in der nächsten Stufe verwendet.
Stufe B
Man bringt 31,98 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes in 130 ecm Methylalkohol ein. Zu der erhaltenen Suspension gibt man 130 ecm einer methanolischen l,74n-Kaliumhydroxydlösung. Man erhitzt während 1 Stunde zum Sieden am Rückfluß, kühlt ab, verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Methylenchlorid. Man trocknet und engt die organische Phase ein. In dieser Weise erhält man 23,6 g eines Harzes, das man aus Isopropyläther umkristallisiert. Es ergeben sich 22,3 g Bis-S^^^-äthylendioxy^e.lle-epoxy-^^-seco-östra-Πβ-ol. F = 148°C.
Stufe II Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-l lß-al\y\-4£-seco-ösUa.-9a,nß-diol
Unter Rühren und unter Einleitung von Stickstoffbringt man 32,4 g Bis-3,3,5 ,5-äthylendioxy-9 a,\ 1 a-epoxy-4,5-seco-östra-17jS-ol in 1105 ecm einer 0,65m-Allylmagnesiumbromidlösung in Tetrahydrofuran ein. Man erhitzt die Lösung während 4 Vi Stunden auf 600C, läßt dann abkühlen und über Nacht bei Raumtemperatur unter Stick-
stoff stehen. Dann kühlt man auf 00C ab und gibt langsam 45 ecm Methanol und 100 ecm Äther zu. Anschließend setzt man 5 ecm Wasser zu und gießt die Reaktionsmischung in 1000 ecm einer gesättigten Ammoniumchloridlösung. Man dekantiert und extrahiert mit Äther. Man trocknet und destilliert unter vermindertem Druck zur Trockne. Man erhält 45 g eines kristallisierten Produktes, das man mit einer Äther-Petroläther(Siedepunkt 60 bis 68°C)-Mischung anteigt. Man saugt ab und wäscht das erhaltene Produkt mit dem genannten
Petroläther. Man erhält 34 g BisO^.S.S-äthylendioxy-lljJ-allyM^-seco-östra^ar.njS-diol. F = 1400C.
Stufe III
1 ljS-Allyl-17^-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on
Stufe A
Hydrolyse 60
Unter Rühren gibt man zu einer Mischung aus 340 ecm Aceton und 68 ecm 1 n-Schwefelsäure 34 g Bis-3,3,5,5-äthylendioxy-ll^-allyl-4,5-seco-östra-9ii:,17jß-diol. Man rührt während 4 Stunden bei Raumtemperatur, gibt dann 0,5 1 Wasser zu und extrahiert mit Methylenchlorid. Man erhält 38 g eines Produktes, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt. 65
Stufe B
Cyclisierung
Unter Rühren und unter Einleiten von Stickstoff bringt man die 3 8 g des in der vorgehenden Stufe erhaltenen Produktes in 760 ecm wasserfreies Methanol ein. Man kühlt die Lösung anter Einleiten von Stickstoff und gibt bei einer Temperatur unterhalb 200C 85 g Kaliumhydroxyd zu. Man läßt die Reaktionsmischung anschließend während 4 Stunden unter Einleiten von Stickstoff bei Raumtemperatur stehen. Dann setzt man 100 ecm Essigsäure zu, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Methylsnchlorid und erhält 25 g des Produktes, das man chromatographiert, wobei man 1 Iß-Allyl-17jJ-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on erhält
■ -
UV-Spektrum (Äthanol):
Max. 215 nm £*{*n 171
Max.238nm£{*„157
Infl. 248nm£jLl48 ls
Max. 305 nm E]In 491 ε: 15 300
Stufe IV ,„
1. Aromatisierung
Unter Rühren und unter Einleiten von Stickstoffgibt man zu 125 ecm Essigsäureanhydrid 25 g \\ß- Ally 1-1Ίβ-hydroxy-östra-4,9-dien-3-on. Man erhitzt die Lösung während 2 Stunden auf 1000C, kühlt die Lösung anschließend ab und gibt tropfenweise bei einer Temperatur unterhalb 1O0C 62,5 ecm Acetylbromid zu. Man läßt die Umsetzung während 2 Stunden bei 200C ablaufen, gießt auf Eis, extrahiert mit Methylenchlorid und wäscht mit Wasser. Man trocknet und destilliert zur Trockne, wobei man 36 g eines Produktes erhält, das man über Siliciumdioxyd chromatographiert, wobei sich 27 g eines Harzes ergeben, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.
2. Verseifung
Bei 25°C und unter Einleiten von Stickstoff löst man 27 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Harzes in 540 ecm Methanol. Dann gibt man 27 ecm Natronlauge zu, läßt die Mischung während 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, setzt 16 ecm Essigsäure und 24 1 Wasser zu, saugt ab, wäscht den erhaltenen Niederschlag, trocknet und erhält 19,65 g eines bei 195°C schmelzenden Produktes. Nach dem Anteigen mit Dichloräthan am Rückfluß erhält man 1 l/-AUyl-östra-U,5(10)-trien-3,17j8-diol. F = 2000C. ^
Stufe V
3,17-Dibenzoat des ll>Allyl-östra-l^,5(10>trien-3,17^-diols
Unter Rühren gibt man 9,286 g ll/?-Allyl-östra-l,3,5(10)-trien-3,17j8-diol zu 93 ecm wasserfreiem Pyridin. Man setzt 9,3 ecm Benzoylchlorid zu, rührt während 4 Stunden bei Raumtemperatur und gibt bis zu einem Gesamtverdünnungsvolumen von 250 ecm Wasser zu. Man saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet die erhaltenen Kristalle. Man erhält 12,6 g des 3,17-Dibenzoats des ll/?-Allyl-östra-l,3,5(10)-trien-3,17./5-diols. F = 198°C.
Stufe VI
3,17-Dibenzoat des 1 L£-[2'-Oxoäthyl]-östra-l,3,5(10)-trien-3,17./?-diols
Unter Rühren und unter einem Stickstoffatom bringt man in370 ecm Methylenchlorid 12,3 g des3,17-dibenzoats des 1 Ij5-Allyl-östra-1 ^,5(10>trien-3,17^-diols ein. Man kühlt die erhaltene Lösung auf -65°C und leitet während 1 lä Stunden 0,2 bis 0,3 1 ozonisierten Sauerstoff pro Minute ein. Dann gibt man 25 g Zinkpulver und 50 ecm Essigsäure zu. Man läßt die Reaktionsmischung sich auf Raumtemperatur erwärmen und rührt während weiterer 30 Minuten. Man filtriert das Zink ab, wäscht das Filtrat, trocknet es und destilliert es zur Trockne, wobei man 12,89 g eines Harzes erhält, das man über Siliciumdioxyd chromatographiert. Hierbei erhält man 11,15 g des 3,17-Dibenzoats des lL«-[2'-Oxoäthyl]-östra-l,3,5(lO)-trien-3,17j0-diols. F = 148°C,
Stufe VII
3,17j8-Dihydroxy-östra-1^,5(10)-trien-1 Iß- crotonsäure
Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom gibt man zu 20 ecm wasserfreiem Tetrahydrofuran 1,2 g einer 50%igen Dispersion von Natriumhydrid in Öl. Man kühlt die Suspension auf 15°C ab und gibt tropfenweise, ohne 2O0C zu übersteigen, 5 ecm Diäthylphosphonoessigsäuremethylester zu. Man läßt 1A Stunde reagieren und setzt tropfenweise 1,305 g des 3,17-Dibenzoats des 1 l/?-[2'-Oxoäthyl]-östra-l,3,5(10)-trien-3,17jß-diols, jn Form
einer Lösung mit 20 ecm Tetrahydrofuran, zu. Man rührt während 40 Minuten bei Raumtemperatur, gibt Wasser zu und extrahiert mit Äthylacetat Man wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet sie und destilliert sie im Vakuum, wobei man 2,23 g eines Harzes erhält Man gibt zu den 2,23 g des Harzes 20 ecm ln-Natriumhydroxydlösimg und 10 ecm Äthanol, erhitzt während I1A Stunden zum Sieden am Rückfluß, kühlt die Reaktionsmischung ab und extrahiert mit Chloroform und schließlich mit Äthylacetat Man wäscht die organischen Phasen lind trocknet sie, teigt sie mit Äther an, saugt ab, wäscht die erhaltenen Kristalle und erhält 830 mg der 3,V7j8-Dihydroxy-östra-M,5(10>trien-llj8-crotonsäure. F = 272°C.
ίο Stufe
3,17j8-Dihydroxy-östra-l,3,5(10>trien-ll£-buttersäure
' 1. Hydrierung
Man gibt 726 mg 3,17JS-Dihydroxy-östra-lr3^(10>trien-llJS-crotonsäure zu einer Lösung, die 30 ecm Methylalkohol und 2 ecm Chloroform enthält Man setzt 150 mg Aktivkohle, die 10% Fdlladium enthält, zu und rührt unter Wasserstoffbis zur Sättigung. Man filtriert dann den Katalysator ab und verdampft das Filtrat, wobei 750 mg eines Harzes zurückbleiben.
2. Verseifung
Man löst die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen 750 mg des Harzes in einer Mischung aus 7,5 ecm
Methylalkohol und 0,75 ecm Kalilauge. Man erhitzt die Reaktionslösung zum Sieden am Rückfluß, säuert an,
verdünnt mit Wasser und extrahiert mit Äthylacetat Dann wäscht man mit Wasser, trocknet und destilliert im Vakuum zur Trockne. Man erhält 674 mg eines kristallisierten Produktes, das man umkristallisiert, wobei sich 604 mg 3,17j?-Dihydroxy-östrti-l,3,5(10)-trien-llyS-buttersäure ergeben. F ^ 262°C.
Beispiel 2
3-Hydroxy-17-oxo-östra-lß^(10)-trien-llj9-buttersäure
Man bringt 2,1 g 3,17j8-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-l ljS-buttersäure in 100 ecm Aceton ein, bringt die in dieser Weise erhaltene Suspet-ion auf 00C und setzt 25 ecm einer 8n-Chromsäureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu. Nach .Ablauf von 3 0 Minuten gibt man 400 ecm Wasser zu, saugt ab, wäscht das erhaltene kristallisierte Produkt mit Wasser t \d erhält in dieser Weise 1,386 g eines Produktes, das bei 2400C schmilzt. Man extrahiert die Mutterlaugen mit Äthylacetat und erhält 0,580 g eines bei 2400C schmelzenden Produktes. Die in dieser Weise erhaltenen cnargen werden aus Isopropanol umkristallisiert, wobei 770 mg 3-Hydroxy-17-oxoöstra-l,3,5(10)-trien-ll/?-buttersäure erhalten werden. F = 256CC.
Beispiel 3
3-Hydroxy-17-oxo-östr&-l,3,5(10)-trien-7 «-buttersäure
Stufe I
Diacetat des 7or-[4'-Hydroxybutyl]-17./Miydroxy-östra-4-en-3-ons
Man gibt 575 ecm einer 0,62m-Lösung der Magnesiumverbindung des ^-Chlorbutanoltetrahydropyranyläthers zu Tetrahydrofuran. Man kühlt diese Lösung unter Stickstoff auf-300C und gibt 2,6 g Kupfer-(I)-chlorid zu. Man rührt während 20 Minuten und gibt dann im Verlauf von 1 Stunde und 10 Minuten eine Lösung von 95 g o-Dehydro-liJ-nortestosteronacetat in 300 ecm Tetrahydrofuran zu. Man beläßt die Lösung dann während 1 Stunde bei -3O0C und gibt 40 ecm Essigsäure und 300 ecm Wasser zu. Dann extrahiert man mit Äther, wäscht die organische Phase mit Wasser, trocknet sie und verdampft sie unter vermindertem Druck zur Trockne. Man erhält in dieser Weise 174 g eines Öls, das man mit 350 ecm Methanol und 88 ecm O.Sn-Chlorwasserstoffsäure versetzt. Dann erhitzt man 2 Stunden zum Sieden am Rückfluß, kühlt ab, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Methylenchlorid, wäscht, trocknet und destilliert. Man erhält 122 g eines Harzes, das man chromatographiert, wobei man ein Produkt erhält, das man über Nacht bei Raumtemperatur mit 2 Volumen Essigsäureanhydrid und 2 Volumen Pyridin umsetzt. Man engt die erhaltene Reaktionsmischung ein und erhält in dieser Weise das Diacetat des 7ar-[4'-Hydroxybutyl]-17^-hydroxy-östra-4-en-3-ons. F = 113°C.
Stufe II
7tf-[4'-Hydroxybutyl]-17^-hydroxy-östra-4-en-3-on
Man beschickt 10 ecm Methanol mit 5 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produktes. Dann gibt man zu der sich ergebenden Lösung unter Einleiten von Stickstoff 12 ecm 2n-methanolische Kaliumhydroxydlösung. Nach Ablauf einer halben Stunde neutralisiert man mit Essigsäure, verdünnt und extrahiert mit Methylenchlorid. In dieser Weise erhält man 43 g 7«-[4'-Hydroxybutyl]-17^-hydroxy-östra-4-en-3-on, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt
Stufe ΠΙ
3,17-Dioxo-östra-4-en-7e-buttersäure
Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in 250 ecm Aceton, rührt beiÖ°C und gibt 10 ecm einer 8n-Chromsäureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu. Man rührt während einer weiteren haiben Stunde, setzt Methanol und dann Wasser zu. Man vertreibt das Aceton durch Destillation im Vakuum, kühlt mit Eis ab, saugt ab, wäscht mit Wasser und trocknet. Man erhält in dieser Weise 3 ,9 g3,17-Dioxo-östra-4-en-7abuttersäure, die nach der Umkristallisation aus Äthanol (95°) bei 2500C schmilzt.
stufe rv
3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-irien-7ir-buttersäure
Unter Rühren und unter Einleiten von Luft gibt man zu 1500 ecm einer auf einen pH-Wert von 7 gepufferten Lösung, die man durch Neutralisieren einer Lösung von 19 g Monokaliumphosphat in 1450 ecm destilliertem Wasser mit ln-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7 und Verdünnen mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 2800 ecm erhalten hat, 3 g Kieselgur (Hyflosupercel). Dann gibt man 3 g 3,17-Dioxo-östra-4-en-7ff-buttersäure und schließlich 30 mg Menadion und 30 g eines acetonischen Arthrob-icter-Pulvers und 35 crm Methanol zu. Man beläßt die Suspension während 112 Stunden bei 34°C, wobei man nach Ablauf von 65 Stunden 15 g des acetonischen Pulvers zusetzt. Nach Ablauf von 112 Stunden bringt man die Lösung durch Zugabe einer konzentrierten Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 14, gibt 500 cm Äthylacetat zu und filtriert. Man säuert das Ritrat mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an, sättigt mit Ammoniumsulfat, dekantiert, reextrahiert mit Äthylacetat, wäscht die Extrakte, trocknet sie und dampft sie zur Trockne ein. Die unlösliche Frakion wird mit Methanol und Wasser gewaschen. Man bringt das Filtrat durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 1 und dampft zur Trockne ein. Die beiden trockenen Extrakte werden chromatographisch gereinigt. In dieser Weise erhält man 1,92 g 3-Hydroxy-17-oKc-östral,3,5(10)-trien-7a-buttersäure, die nach der Umkristallisation ^us wäßriger Essigsäure bei 2060C schmilzt.
IR-Spektrum (Chloroform):
17-C = O des Ketons 1733 cm"1
Säure 1710 cm"1
freie OH-Gruppe 1710 cm"1
Aromaten-Banden 1613 cm"1
1589 cm"1
1499 cm"1
Beispiel 4
3,17jff-Dihydroxy-östra-l ,3,5(10)-trien-7 ar-buttersäure
Zu 6 ecm O,5n-Natriumhydroxydlösung und 1 ecm Methanol gibt man 900 mg 3-Hydroxy-17-oxo-östral,3,5(10)-trien-7ff-buttersäure. Man rührt, leitet Stickstoff em, kühlt ab und gibt 100 mg Natriumborhydrid zu. Nach Ablauf 1 Stunde gibt man erneut 100 mg Natriumborhydrid zu, rührt während weiterer 30 Minuten und setzt dann 4 ecm 2n-Chlorwasserstoffsäure zu. Man verdünnt, extrahiert und wäscht. Man trocknet und bringt unter vermindertem Druck zur Trockne. Dann reinigt man den Rückstand chromatographüsch und orhält 815 mg 3,17jS-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7a-buttersäure in Form eines amorphen Produktes.
IR-Spektrum
C = O-Bande 1706 cnT1 Aromaten-Bande 1610 cm"1
1584 cm"1
1503 cm"1
Beispiel 5
3,16a,17^-Trihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7 «-buttersäure
Stufe I
3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-7ör-buttersäureäthylester
Man bringt 100 mgS-Hydroxy-n-oxo-östra-U.SflOJ-trien^ff-buttersäure in 3 ecm Äthanol ein. Man leitet bis zur Sättigung gasförmigen Chlorwasserstoff ein und bringt während 1 S.unde zum Sieden am Rückfluß. Dann destilliert man unter vermindertem Druck zur Trockne und nimmt mit Äthylacetat auf. Man wäscht, trocknet und bringt zur Trockne. Man chromatographiert den erhaltenen Rückstand und erhält in dieser Weise 81 mg des 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l^,5(10>trien-7a-buttersäureäthylesters in Form eines amorphen Produktes.
Stufe II 3,17-Diacetoxy-östra-1 β ,5( 10)-, 16-tetraen-7 «-buttersäureäthy lester
Man bringt 1,41g S-Hydroxy-n-oxo-östra-U.SOOMrien^tf-buttersäure-äthylester in 30 ecm mehrfacl S destillierten Essigsäureisopropenylester ein. Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man ISO mg ρ Toluolsulfonsäure-monohydrat. Man bringt zum Sieden am Rückfluß und destilliert, wobei man durch Zugabt
von Essigsäureisopropenylester ein konstantes Volumen aufrechterhält. Nach 8stündiger Destillation bring man die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur, gibt eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung zu, extrahier mit Methylenchlorid und wäscht. Man trocknet und bringt zur Trockne, wobei man 1,1g eines Produktes erhält das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.
Stufe III 3,17jS-Diacetoxy-16ff,17ff-epoxy-östra-U,5(10)-trien-7ö'-buttersäureäthylester
Man löst 926 mg des in der vorhergehenden Scufe erhaltenen Produktes in 10 ecm Methylenchlorid, setzt zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung einen Tropfen Pyridin und dann im Eisbad im Verlauf von 15 Minuten 2,5 ecm einer 1,2-molaren Lösung von Hexafluoraceton-hydroperoxyd in Methylenchlorid zu. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansieigcn und rührt während ~rh Stunden unter einer Stickstofiatmosphäre. Dann verdünnt man mit Methylenchlorid, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält 1 g eines
Produktes, das man so, wie es ist, in der nächsten Stufe einsetzt.
Stufe IV 3,16-a-Dihydroxy-17-oxo-östra-U,5(10)-trien-7a'-buttersäuremethylester
Zu 10 ecm Methanol gibt man 1 g des S.n^-Diacetoxy-loe.ne-epoxy-östra-l^.SilOHrien^ar-buttersäureäthylesters. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 1 ecm 6n-Schwefelsäure, rührt die erhaltene Lösung während 30 Minuten bei Raumtemperatur und bringt sie dann während 2 Stuuuen zum Sieden am Rückfluß. Man kühlt auf Raumtemperatur ab, verdünnt mit Wasser, extrahiert mit Äthylacetat, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 882 mgSJour-Dihydroxy-n-oxo-östra-l^.SilOHnen^cr-buttersäuremethyle-
Stufe V 3,16 a, 17j(?-Trihy droxy-östra-13,5(10>trien-7 «-buttersäure
Man löst die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen 882 mg des Harzes in 10 ecm Methanol und gibt dann unter Einleiten von StickstofF900 mg Natriumborhydrid zu. Nach Ablauf von ! Stunde und 15 Minuten setzt man 450 mg Natriumborhydrid zu. Man beläßt während 1 weiteren Stunde bei Raumtemperatur und gibt dann 1 ecm destilliertes Wasser und 1 ecm Kalilauge zu. Man erhitzt während 15 Minuten zum Sieden am Rückfluß, bringt auf Raumtemperatur, verdünnt mit Wasser, säuert mit Hilfe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an,
extrahiert mit Äthylacetat und wäscht. Dann trocknet man und bringt zur Trockne. Man erhält 795 mg eines Harzes, das man chromatographisch reinigt. In dieser Weise isoliert man 575 mg 3,16a,17^S-Trihydroxy-östra-U,5(10>trien-7ar-buttersäure, die bei 160 bis 1700C schmilzt. [a]2 D° = +42° (c = 1%, Äthanol).
Beispiel 6
3,17,0-Dihydroxy-östra-1,3,5(10>trien-7 a-undecansäure Stufe I
Herstellung einer Lösung der Magnesiumverbindung des Tetrahydropyranyläthers von 11-Bromundecanol
Man bringt 5 g Magnesiumspäne in 40 ecm Tetrahydrofuran ein. Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man im Verlauf von 2 Stunden eine Lösung, die 65 g des Tetrahydropyranyläthers des 11-Bromundecanols in 200 ecm Tetrahydrofuran enthält. In dieser Weise bereitet man eine 0,4molare Lösung der Magnesiumverbindung des Tetrahydropyranyläthers des 11-Bromundecanols.
Stufen Diacetat des 17jS-Hydroxy-3-oxo-östra-4-en-7ff-undecanols
Man verdünnt 150 ecm einer O,4m-Lösung der Magnesiumverbindung des Tetrahydropyranyläthers des 11- Bromundecanols in Tetrahydrofuran mit 50 ecm Tetrahydrofuran. Man bringt die in dieser Weise erhaltene Lösung auf -300C und gibt 500 mg Kupfer-CO-chlorid zu. Man rührt die in dieser Weise erhaltene Lösung bei
-25 bis -300C und gibt im Verlauf von 5 Stunden eine Lösung von 16 g o-Dehydro-^-nortestosteronacetat in 150 ecm Tetrahydrofuran zu.
Die in dieser Weise erhaltene Lösung wird während 1 Stunde bei -300C gerührt, wonach man 10 ecm Essigsäure zugibt.
Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, gibt Wasser zu, dekantiert, extrahiert mit Diäthyl-
äther, wäscht, trocknet und dampft unter vermindertem Druck zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 44 g eines Harzes, das man in 330 ecm Methanol löst und mit 90 ecm 0,5n-Chlorwasserstoffsäurelösung versetzt. Man erhitzt die in dieser Weise erhaltene Lösung während 45 Minuten zum Sieden am Rückfluß, dampft unter vermindertem Druck zur Trockne ein, nimmt mit Wasser auf und extrahiert mit Methylenchlorid. Man filtriert, trocknet das Fillrat und dampft es zur Trockne ein. In dieser Weise erhält man 34 g eines Harzes, das man chromaiographisch reinigt.
Man erhält 24 g des Produktes, das man mit 2 Volumen Essigsäureanhydrid und 2 Volumen Pyridin über Nr».Mt bei Raumtemperatur acetyliert. Nach der üblichen Behandlung und chromatographischen Reinigung erhält man 14,3 g des Diacetats des n./J-HydroxyO-oxo-ostra^-en^a-undecanols.
UV-Spektrum (Äthanol):
Max. 240 nm E |?m 312 ε = 16 500 304nm£T*m2
Stufe III
3,17/7-Dihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-7 a-undecanol
Man löst unter einer StickstciTatmosphärc 14,3 g des Diacciats des 1 T/MIydroxy-j-üXü-östfa-H-en-? a-unuccanols in 430 ecm Essigsäure. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 21,5 g Bleitetraacetat, erhitzt die in dieser Weise bereitete Lösung während 4 Stunden auf 1100C, destilliert dann zur Trockne, nimmt den Rückstand mit Wasser auf und extrahiert ihn. Man wäscht, trocknet und destilliert. Man erhält in dieser Weise 16,2 g eines braunen Harzes, das man in 500 ecm Essigsäure löst und mit 80 g Kaliumacetat versetzt. Man erhitzt die Mischung über Nacht zum Sieden am Rückfluß, destilliert dann die Essigsäure ab, nimmt mit Wasser auf und extrahiert. Man chromatographiert das so erhaltene Harz und gewinnt 5,6 g eines Produktes, das man mit 10 Volumen Methanol und 1 Volumen Natronlauge während 15 Minuten am Rückfluß verseift. Das dabei erhaltene Produkt wird chromatographiert, und man erhält 3,24 g amorphes S.n
UV-Spektrum (Äthanol):
Infl. 220 nm E j*m 163
230 nm £i*m 114
Max. 280 nm E |*m 52 ε = 2300
Infl. 287 nm E |*m 46 ε = 2050
Stufe IV
3-Monobenzoat des 3,17^8-Dihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-7 a-undecanols
Zu einer Mischung aus 15 ecm ln-Natriumhydroxydlösung und 7 ecm Aceton gibt man 3,2 g 3,17^-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7a-undecanol. Man kühlt die Lösung in einem Eisbad ab und gibt unter Rühren tropfenweise 2,3 ecm Benzoylchlorid zu. Man rührt während 15 Minuten, verdünnt dann mit Wasser und extrahiert. Man chromatographiert den Rückstand der organischen Phase und erhält 2,64 g des 3-Monobenzoats des
3,17^-Dihydroxy-östra-1,3,5(10>trien-7 a-undecanols.
Stufe V
Benzoat der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-lr3,5(10)-trien-7iz-undecansäure
Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in 130 ecm Aceton. Zu der gerührten und auf +50C abgekühlten Lösung gibt man im Verlauf von 15 Minuten 4,1 ecm eines 8n-Heilbron-Oxydationsreagens. Nach 5 Minuten weiteren Rührens gibt man Methanol zu, verdünnt mit Wasser, engt unter vermindertem Druck ein und extrahiert mit Äthylacetat. Man wäscht die Extrakte, trocknet sie und bringt sie zur Trockne. Man erhält in dieser Weise den Benzoesäureester der 3-Hydroxy-17-oxoöstra-lA5(10>trien-7ar-undecansäure.
Stufe VI
3,17jS-Dihydroxy-östra-1 β ,5(10>trien-7 ar-undecansäure
Man löst den Benzoesäureester der 3-Hydroxy-17-oxo-östra-M^(10)-trien-7flr-undecansäure in 50 ecm Methanol, gibt zu der erhaltenen Lösung 10 ecm 2n-Natriumhydroxydlösung, kühlt nach Ablauf einer Stunde mit einem Eisbad und gibt 1,5 g Natriumborhydrid zu. Man rührt während 1 Stunde, säuert auf einen pH-Wert von 1 an und extrahiert. Man wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man chromatographiert über SiIiciumdioxyd und gewinnt in dieser Weise 1,61 g derS.njS-Dihydroxy-östra-l^^ilOHrien^a-undecansäure.
21
UV-Spektrum (Äthanol):
jv Infl. 219nm£i*m 160
229nm£l*m 115
Max. 28Onm£i?m 46 ε = 2100
Infi. 286 nm £j*m 42
Beispiel 7
7-Carboxymethoxyimino-östra-l,3,5(10)-trien-3,17_/?-diol
Unter Rühren und unter einem Stickstoffatom löst man 2 g 3,17j5-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7-on und 2 g Aminooxyessigsäure-hemihydrochlorid in 18 ecm ln-Natriumhydroxydlösung. Man erhitzt die erhaltene Lösung zum Sieden am Rückfluß und hält sie während 1 Stunde unter einem Stickstoffatom. Dann kühlt man die Reaktionsmischung auf O0C ab, gibt 9 ecm ln-Chlorwasserstoffsäurelösung und 100 ecm Wasser zu. Man extrahiert mit Äthylacetat, wäscht, trocknet und dampft zur Trockne ein. Man erhält in dieser Weise 2,735 g eines Produktes, welches man Chromatographien. In dieser Weise erhält man 2,44 g 7-Carboxymethoxyiminoöstra· U,5(10>trien-3,17jff-diol.
IR-Spektrum:
C = O-Bande 1727 cm"1
Aromaten-Banden 1618 cm"1
1592 cm"1
1506 cm"1
Beispiel 8
7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-17-on
Zu 122 ecm Aceton gibt man 2,44 g 7-Carboxymethoxyimino-östra-l,3,5(10)-trien-3,17j8-diol. Man kühlt auf 00C ab und gibt tropfenweise 0,84 ecm einer 8n-Bromsäureanhydridlösung in verdünnter Schwefelsäure zu (Heilbronn-Jones-Lösung). Man rührt während 30 Minuten bei O0C und gibt erneut 0,84 ecm der Heilbronn-Jones-Lösung zu. Nach Ablauf von 3 Stunden gibt man 0,41 ecm der Heilbronn-Jones-Lösung zu, rührt erneut während 30 Minuten und gibt erneut tropfenweise 2 ecm Methanol und schließlich 10 ecm einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung zu. Man saugt ab, wäscht mit Aceton, engt ein und gibt 200 ecm Äthylacetat zu. Man wäscht, trocknet und engt zur Trockne ein. Man erhält 2,135 g eines Harzes, das man chromatographisch reinigt. Man gewinnt in dieser Weise 1,848 g 7-Carboxymethoxyimino-3-hydroxy-östra-U,5(10)-trien-17-on.
Analyse: C20H23O5N
Berechnet: C 67,21 H 6,48 N 3,91%
Gefunden: C 67,1 H 6,7 N 3,6%
Beispiel 9
4'-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3,17>dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-7-ons
Unter Rühren und unter einem Stickstoffstrom gibt man zu 10,2 ecm Methanol 1,8 g N-Carboxyhydrazidoglycinsäure-kaliumsalz und 8,9 g einer methanolischen Lösung, die 43 mg Chlorwassersto.ffsäure pro ecm enthält. Man erhitzt die erhaltene Suspension unter Stickstoff zum'Rückflußsieden und gibt 1,020 g 3,17jS-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-7-onzu.Nach3 Stunden kühlt man ab, saugt ab und wäscht. Man erhält in dieser Weise 2 g eines Harzes, zu dem man 50 ecm einer Lösung von Diazomethan in Methylenchlorid (Titer 12,1 g pro 1) zusetzt. Man beläßt während 1 Stunde bei O0C, saugt dann den gebildeten Niederschlag ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein. Man erhält 1,926 g eines Harzes, das man chromatographiert, wobei man 825 mg eines Produktes erhält, das man in 8 ecm Methanol löst Zu der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 3 ecm ln-Natriumhydroxydlösung. Man beläßt die Reaktionsmischung während 20 Minuten bei Raumtemperatur, kühlt dann mit EisundgibtS ecm ln-ChlorwasserstoffsäurelösungundS ecm Wasser zu. Man saugt ab, wäscht und trocknet die erhaltenen Kristalle. In dieser Weise erhält man 3,43 mg 4'-Carboxymethyl-2'-semicarbazon des 3,17jff-Dihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien-7-ons.
Beispiel 10
Triäthylaminsalz des 7-Carboxymetooxyimino-östra-l,3,5(10)-trien-3,17jS-diols
Zu 10 ecm Äthanol gibt man 1 g 7-Ketc-östra-l,3,5(10)-trien-3,17j8-diol (hergestellt nach der in der US-PS 24 18 603 beschriebenen Verfahrensweise). Dann gibt man 1 g Aminooxyessigsäure-hemihydrochlorid zu. Zu der erhaltenen Suspension gibt man 8 ecm In-Natriuiruiydroxydlösung, läßt die erhaltene Lösung sich im Verlauf von 3 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen, setzt 8 ecm ln-Chlorwasserstoffsäure zu, verdünnt und extrahiert mit Äthylacetat. Man wäscht, trocknet und destilliert Man erhält 1,23 g eines Harzes.
[R-Spektrum (Äthanol):
C = O-Bande 1748 cm"1
OH-Bande 3607 cm"1
Man gibt die 1,23 g des in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Harzes zu 10 ecm Äthylacetat und gijt zu der Erhaltenen Lösung 0,5 ecm Triäthylamin und 4 ecm Methanol. Man engt die Lösung durch azeotropes Abdestillieren des Methanols ein und hält durch Zugabe von Äthylacetat ein konstantes Volumen aufrecht. NaCh dem Vertreiben des Methanols gibt man 0,2 ecm Triäthylamin zu, kühlt mit Eis, saugt ab und wäscht. Man erhält 1,4 g eines Produktes, das man umkristallisiert. In dieser Weise ergeben sich 0,990 g des Triäthylarninsalzes des 7-Car- ίο boxymethoxyimino-östra-U,5(10)-trien-3,17jS-diols, F = etwa 195°C, [ά\ο = +21° (1% Äthanol).
Anwendung 1
Konjugat aus Rinderserumalbumin und 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-ll/?-buttersäure
Man bringt 178 mg 3-Hydroxy-17-oxo-östra-l,3,5(10)-trien-l ^-buttersäure in 5 ecm Dioxan ein. Dann gibt man bei 12°C0,23 ml Tri-n-butylamin und 0,063 m! Chlorameisensäureisobutylester zu. Man hält die Temperatur der erhaltenen Lösung während 20 Minuten bei 120C. Dann gibt man zu der erhaltenen Lösung bei 00C eine Lösung, die 0,770 g Rinderserumalbumin in 22 ecm Wasser enthält. Nach der vollständigen Auflösung gibt man bei 00C 22 r.crn Dioxan und 0,74 ecm einer ln-Natriumhydroxydlösung zu. Man beläßt die Lösung während 4 Stunden Ni 00C. Dann dialysiert man die Lösung während 18 Stunden durch eine Membran. Man fällt die Lösung, indem man sie mit Hilfe einer 2n-Chlorwasserstoffsäurelösung auf einen pH-Wert von 4,2 einstellt. Man kühlt die Lösung während 68 Stunden auf -2O0C.
Man läßt den Eisklumpen schmelzen und dekantiert dann das Produkt. Den erhaltenen Niederschlag löst man in 50 ecm einer l%igen Bicarbonatlösung unter Eiskühlung. Man dialysiert die Lösung erneut während 48 Stunden durch eine Membran. Dann extrahiert man die Lösung mit Chloroform und isoliert das erhaltene Produkt durch Gefriertrocknung. Man erhält 720 mg des Konjugats aus Rindersenimalbumin und 3-Hydroxy-17-oxoöstra-l,3,5(10)-trien-lljS-buttersäure.
UV-Spektrum (Äthanol): so
Infl. 262nm£j*m 6,6
Infl. 270nm£J?m 9
Max. 281 nm E\*m 11,8
Anwendung 2
Konjugat aus Rinderserumalbumin und 3,17j8-Dihydroxy-östra-l,3,5(10)-trien-lljS-buttersäure
In gleicher Weise, wie bei der Anwendung 1 beschrieben, bereitet man das Konjugat aus 3,17.0-Dihydroxyöstra-l,3,5(10)-trien-ll_/8-buttersäure und R; erserumalbumin, indem man das durch Umsetzen von 3,Πβ-Dihydroxy-östra-l^,5(10)-trien-lljS-buttt ..e und Chlorameisensäureisobutylester erhaltene gemischte Anhydrid einsetzt.
UV-Spektrum (Wasser + Dioxan):
Infl. 270nm£iL 8
Max. 279 nm E\'£mU

Claims (5)

  1. Patentansprüche: 1. Steroid-Haptene der allgemeinen Formel (I)
    HO
    in der
    X ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel OH
    Y ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe und entweder R1 eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH2)^CO2H, in der α eine ganze Zahl mit einem Wert von
    2 η + 3 darstellt, worin π 0, 1 oder 2 bedeutet, und R2 eine Gruppe der Formel
    oder
    Ri ein Wasserstoffatom und R2 eine Gruppe der allgemeinen Formel
    (CHj)4CO2H
    H worin b eine ganze Zahl mit einem Wert von 3 bis 18 darstellt,
    R2 eine Gruppe der folgenden allgemeinen Formel = NZ-(CH2)CCO2H. in der Z ein Sauerstoffatom oder eine Gruppe der Formel -NHCONH- und c sine £anze Zahl mit einem Wert von 1 bis 8 darstellen,
    bedeuten.
  2. 2. 7-Carboxymethoxyimino-östra-1,3,5(10)-trien-3,17-diol.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung der Haptene gemäß Anspruch 1 der allgemeinen Formel (Ia)
    (Ia)
    HO
    worin α und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, dadurch gekennzeichnet, daB man eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)
    in der K und K' in Form des Ketals blockierte Ketogruppen und L eine Acylgruppe bedeuten, der Einwirkung eines Epoxydierungsmittels und dann der Einwirkung eines Verseifungsmittels unterzieht, daß man die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (ΠΙ)
    OH
    (ΠΙ)
    20
    mit einem Allylmagnesiumhalogenid umsetzt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (IV)
    (IV)
    mit einem Deketalisierungsmittel und dann mit einem Cyclisierungsmittel umsetzt, und die Verbindung der Formel (V)
    CH=CH2
    (V)
    mit einem Acylhalogenid oder mit Essigsäureanhydrid und anschließend mit einem Verseifungsmittel behandelt, daß man in der erhaltenen Verbindung der Formel (VI)
    HO
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    die Hydroxygruppen in Form des Esters blockiert, und den Ester der allgemeinen Formel (VII)
    65
    HC = CH2
    CH2
    OL'
    L'O
    in der L' eine Acylgruppe bedeutet, einer Ozonolyse unterzieht, daß man den erhaltenen Aldehyd der allgemeinen Formel (VUI)
    CH=O
    H2C
    OL'
    (vnn
    LO
    mit einem Dialkylphosphonocarbonsäurealkylester der folgenden allgemeinen Formel
    R1O O
    \ll
    P-CH2(CH=CH)nCO2R3
    R2O
    in der R1, R2 und R3, die gleichartig oder verschieden sein können, Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeuten und η die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, und dann mit einem Verseifungsmittel umsetzt, und daß man die erhaltene Verbindung der allgemeinen Forme! (IX)
    (CH=CH)n+1CO2H H2C OH
    (IX)
    HO
    hydriert und gewünschtenfalls die
    OH
    17<^ -Gruppe Ή
    zur Carbonylgruppe oxidiert.
  4. 4. Verfahren zur Herstellung der Haptene gemäß Anspruch 1 der allgemeinen Formel (I b)
    (Ib)
    HO
    (CHACO2H
    in der b, X und Y J;,e in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (XII)
    (XII)
    in der L eine Acylgruppe bedeutet, mit einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
    HaIMg(CHj)4CH2OM
    10
    in der Hai ein Chlor- oder Brom-Atom und OM eine in Form des Äthers blockierte Hydroxygruppe bedeuten und b die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt, das erhaltene Produkt mit einem sauren Mittel und das dann anfallende Produkt mit einer Säure der allgemeinen Formel DOH, in der D eine Acylgruppe darstellt, oder einem funktioneilen Derivat dieser Säure umsetzt, daß man die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XIII)
    OD
    O (CH2)^CH2OD
    mit einem Verseifungsmittel umsetzt, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XIV)
    OH
    (XIV)
    O (CHj)4CH2OH
    (XV)
    (CH2J0CO2H
    mit einem Dehydrierungsmittel behandelt, und gewünschtenfalls die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XVI)
    HO (CH2J6CO2H
    entweder mit einem Reduktionsmittel zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XVII)
    OH
    (XVD)
    HO (CH2)^CO2H
    umsetzt oder die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XVI) mit einem Alkohol der allgemeinen
    20
    30
    45
    50
    55
    60
    65
    10
    20
    30
    45 50 55 60 65
    Formel TOH, in der T eine Alkylgrupne bedeutet, oder einem funktionellen Derivat dieses Alkohols umsetzt, in der erhaltenen Verbindung der allgemeinen Formel (XVIII)
    (XVIID
    HO
    (CHACO2T
    mit einer Säure der allgemeinen Formel VOH, in der V eine Acylgruppe darstellt, oder einem funktionellen Derivat dieser Säure die Hydroxygruppe in der3-Stellung und die enolische Hydroxygruppe in der 17-Stellung verestert, die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (XIX)
    VO
    (XIX)
    (CHj)4CO2T
    mit einem Epoxydierungsmitte! umsetzt, die erhaltene Verbindung der Formel (XX)
    VO
    (XX)
    (CHACO2T
    hydrolysiert und die erhaltene Verbindung der allgemeinen formel (XAl)
    HO
    (XXD
    (CHACO2T
    zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (XXII)
    HO
    reduziert und verseift.
  5. 5. Verfahren zur Hersteilung der Haptene gemäß Anspruch 1 der allgemeinen Formel (Ic)
    (ΧΧΠ)
    HO
    ac)
    NZ-(CH2)rCO2H
    worin X, Z und c die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (XXIII)
    OH
    (XXIII)
    HO O
    mit einer Verbindung der allgemeinen Formel H2NZ(CH^CO2H
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