DE2365769B2

DE2365769B2 - Kulturmedium für Wachstum und Wachstumanzeige von Candida Albicans

Info

Publication number: DE2365769B2
Application number: DE19732365769
Authority: DE
Inventors: Clifton Creve Coeur Aldridge Jun.; Sandra F. St. Ann Gibson; James T. Florissant Holen; Paul W. St. Charles Jones; George F. St. Louis Keyser; Michael C. Belleville Ill. Meyer; Richard D. St. Charles Vannest
Original assignee: McDonnell Douglas Corp
Current assignee: McDonnell Douglas Corp
Priority date: 1972-05-22
Filing date: 1973-05-21
Publication date: 1980-04-24
Also published as: BE799798A; CA1015644A; FR2185685B1; DE2326262A1; DK138664C; LU67631A1; DE2365769C3; DE2365769A1; DK138664B; NO137707B; DE2326262B2; IT1016011B; NL7307158A; JPS4951998A; NO137707C; JPS5410632B2; GB1435582A; FR2185685A1

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch genannte Kulturmedium. Das Identifizieren von Mikroorganismen ist Ziel vieler medizinisch ausgerichte- 2" ter Wissenschaften, doch war dies bisher eine schwierige und zeitraubende Prozedur, die ein fachlich sehr versiertes Personal erforderte. Das herkömmliche Verfahren zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen erfordert insbesondere das Entneh- 2~> men einer Probe mit einem Abstrichstäbchen und dann das Bestreichen des Abstrichstäbchens auf der Oberfläche eines Nährmediums, das mit den zu bestimmenden Mikroorganismen verträglich ist. Nach der 24- bis 48stündigen Inkubation des Kulturmedi- jo ums wird die ilultur auf reine Kolonien hin geprüft. In einigen Fällen können die -einen Kolonien durch bloße mikroskopische Untersuchung identifiziert werden, doch häufig vermittelt -das Aussehen einer Kolonie nur einen Hinweis auf den speziellen Orga- r> nismus. Auf jeden Fall muß die reine Kolonie isoliert und noch weiter bebrütet werden, damit zur Bestätigung der Identifizierung biologische Tests durchgeführt werden können.

Um eine Auszählung der Mikroorganismen zu erreichen, wird die Probe auf die Oberfläche eines Nährmediums gebracht, das hoch selektiv ist, so c'aß es bewirkt, daß eine Art sich abhebt und eindeutig von anderen Arten durch Farbe oder ein anderes Merkmal unterscheidbar ist. Nach der Inkubation 4> wachsen die Mikroorganismen der ausgewählten Art zu Kolonien zusammen, die leicht bestimmt und ausgezählt werden können. In manchen Fällen ergibt die Anfangsinkubation eine große Masse von Lebewesen. Dann müssen von den Proben Reihenverdünnungen >ii vorgenommen werden und muß jede Verdünnung bebrütet und geprüft werden, bis eine Verdünnung erhalten wird, die unterscheidbare Kolonien enthält. Diese Kolonien werden dann ausgezählt, und die Gesamtzahl wird dann durch Multiplizieren des Betrags v> mit dem Verdünnungsfaktor ermittelt. Wiederum sind lange Zeitspannen für die Inkubation erforderlich, und auch die Auszählung erfordert eine beträchtliche Zeit. Beispielsweise beträgt eine Zeitspanne zwischen ilcm Entnehmen der Probe und der Identifizierung mi 2 bis 3 Tage. Dieser Zeitverlust ist für einen schwer erkrankten Patienten häufig kritisch.

lis war bisher unmöglich, Proben von Raumfahrern /u analysieren, um deren Krankheit mit einem gewissen Genauigkeitsgrad zu diagnostizieren. Die Erfin- <,-, dung ermöglicht das Entnehmen und die Inkubation von Proben im Raumfahrzeug. Die Ergebnisse können zur Erde übertragen wercK n, um eine Analyse, Diagnose und Verordnung für eine Behandlung zuzulassen.

Das Kulturmedium der Erfindung ist für Candida albicans hoch selektiv und unterliegt einer Änderung, die nach dem Wachstum des darin befindlichen Mikroorganismus optisch wahrnehmbar ist; es besitzt eine lange Haltbarkeitsdauer.

Die Anwendung des erfindungsgemäf-en Kulturmediums wird nachstehend mit der in der Patentanmeldung P 2326262.6-41 beschriebenen Analysenvorrichtung zum Feststellen, Identifizieren und zahlenmäßigen Bewerten bzw. Auszählen von medizinisch wichtigen Mikroorganismen erläutert.

Fig. 1 der Zeichnung ist eine perspektivische Darstellung einer Patrone für eine mikrobiologische Probe. Diese Patrone ist für eine Beschickung mit dem Kulturmedium der Erfindung vorgesehen.

Fig. 2 ist eine perspektivische Darstellung einer Kassette, die Teil der Patrone für die Probe ist.

Fig. 3 is eine typische, mit einem elektronenoptischen Anzeigegerät erhaltene Kurve für die Bestimmung von Candida albicans.

Die genannte Vorrichtung enthält grundsätzlich eine Patrone 2 für die mikrobiologische Probe. In diese Patrone wird eine Probe, von der angenommen wird, daß sie bestimmte Mikroorganismen enthält, eingetragen. Diese Patrone hat mehrere herausnehmbare Kassetten 4, von denen jede einer optisch wahrnehmbaren Änderung unterliegt, wenn in ihr ein bestimmter Mikroorganismus wächst. Außerdem enthält die Vorrichtung ein elektronenoptisches Anzeigegerät (nicht dargestellt), das den Mikroorganismus in den Kassetten 4 bebrütet, nachdem die Kassetten 4 aus dem Körper der Patrone 2 herausgenommen worden sind, und darin stattfindende Änderungen hinsichtlich der Lichtdurchlässigkeit feststellt und aufzeichnet.

Die Patrone 2 für die Probe enthält (Fig. I) ein im allgemeinen T-förmiges Gestell 10, das aus einem Endteil 12 und einem Verteiler 14 besteht, der mit dem Endteil 12 verbunden ist und von dessen Mittelpunkt aus vorspringt. Der Endteil 12 hat einen nach oben sich öffnenden Hohlraum 16, der sich praktisch über die gesamte Länge des Endtcils erstreckt, und dieser Hohlraum 16 enthält einen Kunststoffaußenbeutel 18, der an seinen beiden Seitenrändern und auch an dem einen Endrand geschlossen ist. Das andere Ende des Kunststoffaußenbeutels 18 wird offengelassen, um einin Zugang zu dem Inneren des Beutels zu ermöglichen. In dem Kunststoffaußenbeutel 18 befindet sich ein Verdünnungsmittelvorratsbehälter 20, der praktisch aus einem anderen Beutel besteht and vollständig verschlossen und mit einem bekannten Volumen Verdünnungsmittel, das für das Wachstum von Mikroorganismen geeignet ist, gefüllt ist. Destilliertes Wasser ist für diesen Zweck besonders gut geeignet.

Der Verteiler 14 hat einen hohlen Innenraum, der mit dem Innenraum des Kunststoffaußenbeutels 18 durch ein Ventil 22, das sich an dem T-förmigen Gestell 10 an dem Verbindungspunkt von dem Verteiler 14 und dem Endteil 12 befindet, zusammenhängt und dadurch einen Durchflußkanal bildet, der von dem Kunststoffaußenbcutel 18 ausgeht. An seinem entgegengesetzten Ende hat der Verteiler 14 eine Membran bzw. Scheidewand 24, die normalerweise das Ende des Verteilers 14 verschließt, aber einen Zugang zu dem Innenraum des Verteilers 14 zuläßt, wenn sie mit einem scharfen Gerät, wie /. H. einer Hohlnadel,

durchstochen wird. Wenn das zum Durchstechen benutzte Gerät zurückgezogen wird, schließt sich die Scheidewand 24 natürlich von selbst wieder. Der Verteiler 14 ist entlang jeder Seite mit Führungsstiften bzw. Steckstiften26 versehen, die paarweise angeordnet sind, und zwischen den Führungsstiften 26 von jedem Paar ist der Verteiler 14 außerdem mit Scheidewänden 28 versehen. Die Scheidewände 28 lassen gleichfalls einen Zugang zu dem Innenraum des Verteilers zu, wenn sie durchstochen werden. Auf der einen Seite des Verteilers 14 hat die Seite des Endteils 12 einen Arretierungsanschlag oder Sperrkegel 30 und auf der anderen Suite eine Arretierungsaussparung 32.

Die Patrone 2 zur Aufnahme der Probe nimmt ein Abstrichstäbchen 34 auf, dessen Spitze die zu analysierende Probe enthält. Im einzelnen wird das Abstrichstäbchen 34 in das offene Ende des Kunststoffaußenbeutels 18 eingeführt, und dann wird der Stiel des Stäbchens abgebrochen, so daß nur die Spitze des Abstrichstäbchens und die Probe in dem Kunsts'.offaußenbeutel 18 zurückbleiben. Dann werden die einzelnen Endränder des Kunststoffaußenbeutels durch Erwärmen miteinander verschweißt, so daß die Probe in dem Kunststoffaußenbeutel 18 völlig verschlossen vorliegt.

Die Kassetten 4 (Fig. 2) sind Teile der Patrone 2 für die Probeentnahme und bestehen aus einem klaren Kunststoff, wie z. B. aus Polycarbonat oder aus Polyäthylen hoher Dichte. Sie haben eine rechteckige Form und ähneln kleinen Chips oder Spänen. Es ist festgestellt worden, daß Kassetten mit Abmessungen von 2,5 x 1,8 X 0,3 cm in der Praxis ideal geeignet sind.

Jede Kassette 4 hat ein Paar Führungslöcher 40. die sich von einem Ende nach außen erweitern, und diese Führungslöcher haben eine solche Größe und sind in einem solchen Abstand voneinander angeordnet, daß sie die Führungsstifte 26 von irgendeinem Paar, die von dem Verteiler 14 des T-förmigen Gestells 10 hervorspringen, aufnehmen. Jede Kassette 4 ist ferner mit einer Einlaßöffnung 42 versehen, die sich längs in der Kassette erstreckt und nach außen hin zu einem der nächsten Führungslöcher 40 hin offen ist. Die Einlaßöffnung 42 enthält eine hohle Impfnadel 44, die nach außen vorspringt und eine gerade Linie mit der Scheidewand 28 zwischen einem Paar der Führungsstiftc 26 bildet, wenn diese Führungsstifte 26 mit den Führungslöchcrn 40 ausgerichtet worden sind. In dem Maße, in dem die Kassette 4 gegc'i den Verteiler 14, und zwar mit den Führungsstif-IeI¹126 in den Führungslöchcrn 40, gedrückt wird, wird so die hohle Impfnadcl 44 die Scheidewand 28, die sich auf ihrem Weg befindet, durchstochen und eine Verbindung zwischen dem Innenraum des Verteilers 14 und der Einlaßöffnung 42 geschaffen.

Außer der Einlaßöffnung 42 ist die Kassette 4 mit 4 Transportrohren oder -bohrungen 46 versehen, die parallel zueinander und senkrecht zu der Einlaßöffnung 42 verlaufen, Die Transportrohrc 46 erstrecken sich so quer durch die Kassette 4. Das stromaufwärtsgerichtete Ende jedes Transportrohrs 46 erweitert sich nach außen durch die Seiten der Kassette 4, und diese Enden sind mit einem geeigneten Verschlußmaterial verstöpscli. Das stromabwärtsgerichtetc finde jedes Transportrohres 46 ist erheblich verkleinert und bildet ein verkleinertes Endstück 48. das ebenfalls verstöpsclt ist. Die Einlaßöffnung 42 öffnet sich zu dem stromaufwärtsgerichteten Ende des ersten Transponrohres 46 hin, während das verkleinerte Endstück 48 dieses ersten Rohrs sich in die Seitenwand einer Nachweis- oder Beobachtungszelle 50 hin öffnet. Die gegenüberliegende Seitenwand dieser Nachweiszelle 50 öffnet sich in das stromaufwärtsgerichtete Ende des zweiten Transportrohres 46 hin. In gleicher Weise sind das stromabwärtsgerichtete Ende des zweiten Transportrohres 46 und das stromaufwärtsgerichtete Ende des dritten Transportrolle 46 durch eine andere Nachweiszelle 50 und auch das stromabwiirtsgerichtete Ende des dritten Rohrs 46 mit dem stromaufwärtsgerichteten Ende des vierten Rohrs 46 miteinander verbunden. Auf diese Weise bilden die Transportrohre 46 gemeinsam mit den verbindenden Nachweiszellen 50 einen serpentinförmigen Durchflußkanal durch die Kassette 4. Die Nachweiszellen 50 stellen praktisch Bohrungen oder Rohrseekn dar, die sich völlig durch die Kassette 4 erstrecken und so ausgerichtet sie...·, daß ihre Achsen parallel zueinander und senkrecht zi. der Ebene, in der die Achsen für die Transportrohre 46 liegen, verlaufen. Anstelle einer Öffnung in das stromaufwärtsgerichtete Ende eines anderen Transportrohres 46 hin öffne·, sich die Seite der vierten Nachweiszelle 50 /u einem Überlaufreservoir 52. das eine andere Bohrung oder Rohrseele darstellt, die an ihrem Ende verstöpselt ist und parallel zu den Transportrohren 46 verläuft. Die Enden der Nachweiszellcn 50 sind durch transparente Bandstreifen 54 abgedeckt und verschlossen, die auf den oberen und unteren Oberflächen der Kassette 4 haften.

Jede Kassette 4 hat ferner eine Versehlußauss,jarung 56 auf einer seiner Seitenvorderfiächen und einen Verschlußanschlag oder Verschlußsperrkegel 58 auf der entgegengesetzten Vorderfläche, und die Verschlußaussparungen 56 und Verschlußsperrkegel 58 von benachbarten Kassetten 4 greifen ineinander, wenn sie sich auf dem Verteiler 14 in der geeigneten Lage befinden. Außerdem rastet die Verschlußaussparung 56 der innersten Kassette 4 auf der einen Seite des Verteilers 14 in den Sperrkegel 30 an dem Endteil 12 ein, während der Verschlußsperrkegel 58 der Kassette 4 auf der entgegengesetzten Seite des Verteilers 14 in die Arretierungsaussparung 32 des Endteils 12 einrastet.

Vor dem Verstöpseln der Enden der Transportrohrc 46 werden diese Rohre mit kleinen runden Filtern 64 versehen, die unmittelbar vor den verjüngten ι Endstücken 48 angebracht sind. Aus Asbestfasern bestehende Filter 64 sind günstig, und die Porengröße und Filterlänge sollte so sein, daß 90^rr der für die Kassette entnommenen Mikroorganismen von jedem Filter 64 entfernt werden. So wird für jedes Filter 64 cine I ig-Verminderung in Rechnung geteilt. Es ist festgestellt worden, daß die gleiche Filtergröße und Filterlänge zu einer 9()%igen Verminderung bei allen das Filter passierenden Mikroorganismen führen, unabhängig davon, ob diese bakterielle oder pilzliche Organismen sind, Obwohl folglich die Filter 64 für alle Kassetten die gleichen sind, sind die verschiedenen Kassetten 4 dennoch gegenüber unterschiedlichen Mikroorganismen selektiv.

Das in dem Kassettenfiltet^ystem verwendete Filtermaterial besteht aus annähernd 0,001 g Asbestfaser^ in jedem Transportrohr 46. Die Fasern wurden von einem Asbestfaserkissen erhalten. In einem KaIalog tür wi.^enschaftliche Produkte ist i.mgeg< Kn. daß

ein liltci kissen vim ungefähr Λ mm cine l'orengröße in clem 2-|im-Bereich hat. Hs wird angenommen, daß die Verdünnung vnn Organismen durch Absorption und nicht durch Nitration bewirkt wird. Daher ist die Forengröße unwesentlich.

Außer einem Filter 64 enthält jedes Transportrohr 46ein Bett oder eine Füllung 66 aus einem Kulturmedium, und dieses Bett ist darin stromaufwärts von dem Filter 64angeordnet. Das Kulturmedium ist am besten gefriergetrocknet, und jedes Bett 66 wird nach (.lern Durchgang von Wasser durch das Transportrohr 46. in dem sich das Bett 66 befindet, erneut hydratisiert, b/w. mit Wasser versehen. Das Kulturmedium ist für Mikroorganismen in dem Sinne hoch selektiv, daß es vom optischen Standpunkt aus einer wahrnehmbaren Änderung nur dann unterliegt, wenn ein bestimmter Typ von Mikroorganismen, d. h. der begünstigte Mivon tier Haut herstammen, und in Rachen- bzw. l.uftrührenproben gefunden und kann Soormykose verursachen. Die Candida albicans wächst in einem selektiven Kulturmedium, das folgendermaßen hergestellt wird: In 1.0 I Wasser werden die folgenden Bestandteile eingetragen:

10 g mit Papain verdautes Sojamehl

10 g Dextrose
0.4 g Cyclohexamid
0.05 g Chloramphenicol

Die vorstehend angegebenen Bestandteile werden, um eine lösung zu erzielen, leicht erwärmt, der pH-Wert wird mit Phosphat auf (S,^l> eingestellt und die Bestandteile werden durch Filtrieren steril gemacht. Dann werden 25 mg Colymycin pro Liter und 25 mg Nalidixinsäurc pro Liter zugegeben.

Das Medium soll in dem ersten, zweiten, drit-

KTrgniliSmüS. ΰαΠΓι aii ,jO Ίί p

Änderung in den vier Beobachtungs- oder Nachweiszellcn 50 in der Kassette 4 festgestellt, wobei diese optische Änderung im allgemeinen mit dem Verlauf der Zeit progressiv stärker wird, vorausgesetzt natürlich, daß der entnommene Mikroorganismus in der Kassette 4 wächst. Die Änderung kann iini dein unbewaffneten Auge oder mit dem elektronenoptische!! Anzeigegerät beobachtet werden.

Das Kulturmedium für jede Kassette 4 ist verschieden. Zur Bestimmung von Candida albicans wird ein Kulturmedium der anspruchsgemäßen Zusammensetzungverwendet. Der größte Teil des Kulturmediums wird für jede Kassette 4 vor dem ersten Filter 64 konzentriert, weil das Kulturmedium sonst, wenn es in Lösung geht, seine größte Konzentration in der vierten oder letzten Nachweiszellc 50 erreichen würde. Bezüglich der meisten entwickelten Kulturmedien ist empirisch festgestellt worden, daß 50 Gew.-T des Mediums für die Kassette 4 in dem ersten Transportrohr 46. 25 Gew.-^ri in dem zweiten Rohr 46 und 12.5 Gcw.-^r^ in dem dritten und auch in dem vierten Rohr 46 vorhanden sein sollten. Wenn das Kulturmedium in derartigen Anteilen vorliegt, sind die Konzentrationen des Kulturmediums in jeder Nachweiszelle 50 nach der folgenden Hydratation des Kulturmediums, wenn Wasser durch dieses geleitet wird, etwa gleich.

Jede Kassette 4 enthält ein anderes selektives Kulturmedium, und jedes Medium bevorzugt eine Art von Mikroorganismen in dem Sinne, daß die bevorzugten Mikroorganismen in dem Medium nach einer spezifischen Gesetzmäßigkeit wachsen und dadurch dessen Lichtdurchlässigkeit ändern. Die Änderung ist im allgemeinen das Ergebnis eines sich bildenden Präzipitats oder stellt eine Farbänderung dar. In jedem Fall erhöht die Änderung die relative optische Dichte der Lösung und kann bei den Nachweiszellen 50 beobachtet werden. Die Änderung wird leicht in Licht mit einer Wellenlänge von 665 nm festgestellt. Außerdem können die gesamten Nährmedien gefriergetrocknet werden, und die Medien haben, wenn sie so getrocknet worden sind, eine Haltbarkeit beim Lagern von mindestens 6 Monaten. Außerdem sind die Kulturmedien empfindlich genug, um das Wachstum zu fördern, wenn die Bakterien- oder Pilzpopulationen so gering sind, daß diese nur 1000 Mikroorganismen je ml entsprechen.

Zum Nachweis von Candida albicans ist das folgende Medium geeignet.

Candida albicans wird hauptsächlich in Proben, die ILl (LII IVtIIlLII t »V

ι τι,ιι ι "ι

diese tier Reihe nach 50Gew.-%, 25Gew.-^ri. 12.5 Gew.-'r und 12,5 Gew.-% enthalten.

Die Bestandteile liegen also (in Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Trockenbestandteile) in Bereichen Min 45 bis 50Tf mit Papain verdautes Sojamehl. 45 Ins 50^r, Dextrose, 2,0 bis 3,0% Cyclohexamid. 0.2 bis 0..Vr Chloramphenicol, 0,1 bis 0,15% CoIymyein und 0.1 bis 0.15'/f Malidixinsäure vor.

I> ■ pH-Wert der Lösung liegt zwischen 6 und 7,S.

Wie oben angegeben ist. wird die zu analysierende Probe auf ein Abstrichstäbchen 34 gebracht, und das Abstrichstäbchen wird dann ir den Kunststoffaußenbeutel lSdurchdasoffenc Ende desselben eingeführt. Darauf wird der Stiel des Stäbchens abgebrochen, so daß die Spitze des Abstrichstäbchens in dem Kunststoffaußenbeutel 18 zurückbleibt. Dann werden die einzelnen Ränder an der Öffnung des Kunststoffaußenbeutels durch Erwärmen miteinander verschweißt, so daß die Probe in dem Kunststoffaußenbeutel 18 völlig verschlossen vorliegt.

Abgesehen von dem Eintragen der Probe in die Patrone 2 bestimmt der Benutzer, auf welche Mikroorganismen er seine Analyse ausrichten soll und welche bestimmten Kassetten 4. die in bezug auf diese Mikroorganismen selektiv sind, zu verwenden sind. Diese Kassetten 4 werden auf dem Verteiler 14 durch genaues Ausrichten von deren Führungslöchern 40 mit den Führungsstiften 26 und anschließendes Driikken derselben gegen den Verteiler 14 angebracht. Dieses bewirkt natürlich, daß die Impfnadel 44 der Kassetten 4 durch die Scheidewände 28 in dem Verteiler 14 stoßen, was wiederum bewirkt, daß Jer Innenraum des Verteilers 14 mit den Einlaßöffnungen 42 der Kassetten 4 in Verbindung steht.

Sobald die Probe in dem Kunststoffaußenbeutel 18 verschlossen vorliegt und die gewählten Kassetten 4 längs den Seiten des Verteilers 14 sich an Ort und Stelle befinden, wird das Ventil 22 geöffnet, und eine Hohlnadel (nicht dargestellt), die mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. wird durch die Scheidewand 24 an dem Ende des Verteilers 14 eingeführt. Die Vakuumpumpe evakuiert Luft aus dem Verteiler 14 und dem Kunststoffaußenbeutel 18. sowie auch aus der Einlaßöffnung 42, den Transportrohren 46. den Nachweiszellen 50 und dem Überlaufreservoir 52 jeder Kassette 4. Dann wird die Vakuumhohlnadel aus

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VlLI JVIIVIUtnuuu Μ0-Ψ 1.UIULIVgUZAJgClI. UIlU VlCl3 VClItIl 22 wird geschlossen. Dann wird der Beutel, der den Verdiinnungsmittelvorratsbehälter 20 darstellt, durch Drücken demselben mit der Hand gegen die Wand am

Hmlen des Hohlraums 16 zum Platzen gebracht, und dieses bewirkt, daß das bekannte Wasscrvolumen aus diesem Beutel heraus und in den Kunslstoffaußcnbeutel 18 flicH'. Die Patrone 2 wird dann geschüttelt, um die Probe mit dein Wasser in dem Kunststoffbeutcl 18 gründlich zu vermischen. Dann wird das Ventil 22 geöffnet, und das Wasser-Probengemisch fließt in den Imvnraum des Verteilers 14 und dann durch die Impmadel 44 in clic Kassetten 4.

'ti jeder Kassette 4 fließt das Gemisch von Wasser und Probe zunächst in das erste der v'.er Transportrohrc 46, wo das Wasser das trockene Kulturmedium, das in dem ersten Bett 66 darin enthalten ist, löst oder rehydratisiert. Die so gebildete Lösung passiert das erste Filter 64, wo irgendwelche teilchenförmigen Stoffe aus der Probe entfernt werden. Das erste Filter 64entfernt außerdem 90% der Mikroorganismen und insbesondere W/e des Typs, für den das spezielle Kulturmedium gewählt worden ist, so daß die Konzentration der Mikroorganismen auf 10% der in dem Verteiler 14 vorhandenen Konzentration beim Eintreten der Lösung in die erste Nachweiszelle 50 verringert wird. Dann löst die Lösung das Bett 66 aus trockenem Kulturmedium, das in dem zweiten Transportrohr 46 vorhanden ist, und fließt ebenfalls durch das Filter 64 in dieses. Das zweite Filter 64 entfernt weitere 90% der Mikroorganismen, so daß die Konzentration der Mikroorganismen in der zweiten Nachweiszelle 50 10% der in der ersten Zelle 50 vorhandenen Konzentration und I ^r/r der in dem Verteiler 14 vorhandenen Konzentration ausmacht. Die Lösung fließt dann dutch das dritte Bett 66 aus Kulturmedium, wo sie noch mehr Kulturmedium löst, und durch das dritte Filter 64. wo weitere 90% der Mikroorganismen entfernt werden. So enthält die in die dritte Nachweiszclle 50 gelangende Lösung nur noch 10% der Mikroorganismen der Lösung von der zweiten Nachwciszelle 50. Die Lösung löst noch mehr Kulturmedium, indem sie durch das vierte Bett 66 aus Kulturmedium strömt, und weitere 90% der selektiven Mikroorganismen werden entfernt, wenn die Lösung durch das vierte Filter 64 gelangt. Dann fließt die Lösung in die vierte Nachweiszclle 50 und von dort in das uberlaufrescrvoir 52.

Durch Verteilen des Kulturmediums in der oben angegebenen Weise, d. h., daß sich die größte Menge in dem Bett 66 des ersten Transportrohrs 46 befindet, ist es möglich, daß die Stärke der Kulturlösungen in den vier Nachweiszcllen 50 an dem Zeitpunkt, an dem das Überlaufreservoir 52 gefüllt wird, im wesentlichen gleich ist. Daher sind die Bedingungen zum Fördern des Wachstums der Mikroorganismen in jeder Nachweiszelle 50 ebenfalls gleich. Außerdem entspricht die 90%ige Verringerung der Anzahl der selektierten Mikroorganismen bei jedem Filter 64 einer zehnfachen Reihenverdünnung. Wenn folglich 1O⁴ von den selektierten Mikroorganismen in einem gegebenen Wasservolumen in dem Verteiler 14 vorliegen, liegen 10' in der gleichen Wassermenge in der ersten Nachweiszelle 50 vor, obwohl das Wasser in der Nachweiszelle 50 das Bett 66 des Kulturmediums in sich gelöst enthält, um das Wachstum der Mikroorganismen zu fördern. Bei Weiterverfolgung dieses Beispiels ergibt sich, daß das Wasservolumen in der zweiten Nachweiszelle 10² der selektierten Mikroorganismen enthält, während das gleiche Wasservolumen in der dritten und der vierten Nachweiszelle 50 10 bis 1 der selektierten Mikroorganismen enthält.

/.tiniichst ist die Lösung, die das gelöste Bett 66 des Kulturmediums und die Mikroorganismen enthält, klar und transparent. Wenn jedoch die Kassette 4 erwärmt wird, wird der Mikroorganismustyp, der durch das Kulturmedium gefördert wird, wachsen und die Lichtdurchlässigkeit der Lösung ändern. Diese Änderung findet in Form einer Farbveränderung oder auch in Form einer Präzipitatbildung statt, und zwar je nach dem Kulturmedium und dem Mikroorganismus, und diese Änderung ist bei den vier Nachweiszellcn 50 mit dem Auge wahrnehmbar. Weil in den meisten Fallen die eiste Nachwciszellc 50 die größte Konzentration von den begünstigten Mikroorganismen enthält, wird diese Zelle weniger Licht durchlassen als die übrigen Zellen 50. Keine Änderung hinsichtlich der Lichtdurchlässigkeit einer Zelle 50 zeigt das Fehlen des Mikroorganismus, der durch das Kulturmedium begünstigt wird, oder vielleicht eine ungenügende Anzahl von dem Mikroorganismus an .Sollten rinior aber nicht all«: Nachweiszellcn 50 eine Änderung hinsichtlich der Lichtdurchlässigkeit ergeben, dann kann die Gesamtzahl des begünstigten Mikroorganismus in der Probe innerhalb eines Bereichs, der durch nachfolgende Faktoren von 10 abgegrenzt ist, bestimmt werden, weil das Gesamtvolumen des Verdünnungsmittels oder Wassers bekannt und gleichfalls so der Verdünnungsfaktor bekannt sind.

Die Nachweiszellen 50 von den Kassetten 4 können während der Inkubation mit dem unbewaffneten Auge beobachtet werden, doch kann das elektronenoptische Anzeigegerät Änderungen in der Lichtdurchlässigkeit mit weit größerer Genauigkeit feststellen. Das elektronenoptische Anzeigegerät kann ferner die relative optische Dichte der Zellen in Zahlen übertragen, die zur Bestimmung des Änderungsgrades und der Änderungsgeschwindigkeit der Lichtdurchlässigkeitskennwerte verglichen werden können.

Weil das Kulturmedium für jede Kassette 4 einen verschiedenen Mikroorganismus begünstigt, wird die Probe auf die Anzahl und die Art der Mikroorganis men hin entsprechend der Anzahl und der Art der Kassetten 4. die mit dem Verteiler 14 verbunden sind, analysiert.

Beim Betrieb werden die Kassetten 4. nachdem sie von dem Verteiler 14 getrennt worden sind, in den optischen Meßkopf eingeführt, und. wie in der Stammanmeldung ausführlich beschrieben, werden Werte abgelesen, die für Änderungen der optischen Eigenschaften nach dem dort stattfindenden Wachstum von Mikroorganismen typisch sind.

Die von den optischen Nachweiszellen erhaltenen Ablesungswerte werden auf kartesischen Koordinaten aufgetragen, und im allgemeinen werden die Ablesungswerte von vier Nachweiszellen 50 einer einzelnen Kassette 4 auf einem einzigen Diagramm aufgetragen, so daß sich bei jedem Diagramm vier Kurven bilden. Die Kurven für jeden Mikroorganismus sind für den betreffenden Mikroorganismus charakteristisch oder stellen, mit anderen Worten ausgedrückt, eine einmalige zeitabhängige Kennzeichnung des Organismus dar. Wenn eine der Kassetten 4, die ein Kulturmedium enthält, das Candida albicans begünstigt. Diagramme ergibt, die den früheren für diesen speziellen Organismus aufgenommenen Diagrammen entsprechen, dann ist die Anwesenheit des Mikroorganismus in den Proben bestätigt. Wenn andererseits die optische Dichte für die vier Nachweiszellen 50 für

eine besondere Kassette 4 unverändert bleibt, wird das Fehlen des Mikroorganismus, dessen Wachstum durch das Kulturmedium begüngstigt wird, für die betreffende Kassette bestätigt.

Sollte die optische Dichte der Lösung in einigen der Nachweiszcilen 50 für eine besondere Kassette 4 sich ändern, aber nicht die übrigen, so zeigt dieses an, daß eine nichtsignifikante Anzahl Mikroorganismen in den unveränderten Zellen 50 existieren. Weil das Gesamtvolumen des Wassers von dem Verdünnungsmittelvorratsbehälter 20 bekannt ist, wie auch der Verdünnungsfaktor durch die Filter 64 für die Kassetten 4 kann die Gesamtzahl der Mikroorganismen in der Probe bestimmt werden, zumindest zwischen zwei aufeinanderfolgenden Faktoren von K).

Heispiel

Eine der Kassetten 4 wurde mit einer Probeentnahme aus dem Rachen nach den oben angegebenen Verfahren beimpft. Diese Kassette enthielt das erfin-

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dungsgemäße Kulturmedium, das das Wachstum von Candida begünstigt. Diese Kassette wurde anschließend in einem elektronenoptischen Anzeigegerät angeordnet, und es wurde das in der Fig. 5 wiedergegebene Diagramm erhalten. Dieses Kulturmedium hat sich also so hoch selektiv erwiesen, daß nur Candida albicans in weniger als 16 Stunden gewachsen war. Selbst nahe verwandte Candidaarten ergeben keine Diagramme, die eine signifikante optische Dichte anzeigen. Der Unterschied oder Trennungsgrad zwischen den Zellen 1 und 2 aufgrund der Diagramme ist bei langsam wachsenden Organismen, wie z. B. Pilzen (Candida) am größten, und zwar im Gegensatz zu den schnell wachsenden Bakterien.

Es ist ersichtlich, daß Proben ohne Schwierigkeiten und zeitraubende Verfahren, wie sie früher angewendet wurden, analysiert werden können. Außerdem sind keine langen Zeitspannen für die Inkubation des Mikroorganismuserforderlich und werden Methoden, die zu Versuchsfchlern führen, vermieden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Kulturmedium für das Wachstum und Anzeigen des Wachstums von Candida albicans, dadurch gekennzeichnet, daß es einen pH-Wert zwischen 6 und 7,8 hat und, bezogen auf das Gewicht der Trockenbestandteile, 45 bis 50% mit Papain verdautes Sojamehl, 45 bis 50% Dextrose, 2,0 bis 3,0%Cyclohexamid, 0,2 bis 0,3%Chloramphenicol, 0,1 bis 0,15% Colymycin und 0,1 bis 0,15% Nalidixinsäure enthält.