DE2326262C3

DE2326262C3 - Vorrichtung zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen in einer Probe

Info

Publication number: DE2326262C3
Application number: DE19732326262
Authority: DE
Original assignee: McDonnell Douglas Corp
Current assignee: McDonnell Douglas Corp
Priority date: 1972-05-22
Filing date: 1973-05-21
Publication date: 1977-09-22

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen in einer Probe, bei dem man die Probe mit einer Flüssigkeit verdünnt, das Gemisch von Flüssigkeit und Probe mit einem selektiven Nährmedium mischt und die relative optische Dichte dieses Gemisches zur Feststellung einer Änderung wiederholt mißt.

Das Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen ist eine wichtige Teilaufgabe vieler medizinisch ausgerichteter Wissenschaften. Doch war dieses bisher eine schwierige und zeitraubende Prozedur, die ein fachlich sehr versiertes Personal erforderte. Das herkömmliche Verfahren zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen erfordert insbesondere das Entnehmen einer Probe mit einem Abstrichstäbchen und dann das Abstreichen des Abstrichstäbchens auf der Oberfläche eines bestimmten Nährmediums. Nach der 24- bis 48stündigen Inkubation des Kulturmediums wird die Kultur auf reine Kolonien hin geprüft. In einigen Fäiien können die reinen Kolonien durch bioße mikroskopische Untersuchung identifiziert werden, doch häufig vermittelt das Aussehen einer Kolonie nur einen Hinweis auf den speziellen Organismus. In den meisten Fällen muß die reine Kolonie isoliert und noch weiter bebrütet werden, so daß zur Bestätigung der Identifizierung biologische Vergleichsversuche durchgeführt werden können.

Um eine Auszählung der Mikroorganismen zu erreichen, wird die Probe auf die Oberfläche eines Nährmediums gebracht, das hoch selektiv ist, so daß c; bewirkt, daß eine Art sich abhebt und eindeutig von anderen Arten durch Farbe oder ein anderes Merkmal ίο unterscheidbar ist. Nach der Inkubation wachsen die Mikroorganismen der ausgewählten Art zu Kolonien zusammen, die leicht und ausgezählt werden können. In manchen Fällen ergibt die Anfangsinkubation eine große Masse von Lebewesen. Dann müssen von den Proben Reihenverdünnungen vorgenommen werden und jede Verdünnung muü bebrütet und geprüft werden, bis eine Verdünnung erhalten wird, d'e unterscheidbare Kolonien enthält. Diese Kolonien werden dann ausgezählt, und die Gesamlzahl wird dann durch Multiplizieren des Betrags mit dem Verdünnungsfaktor ermittelt. Wiederum sind lange Zeitspannen für die Inkubation erforderlich, und auch die Auszählung erfordert eine beträchtliche Zeit. Beispielsweise beträgt eine Zeitspanne zwischen dem Entnehmen der Probe und der Identifizierung 2 bis 3 Tage. Dieser Zeitverlust ist für einen schwer erkrankten Patienten häufig kritisch.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen in einer Probe, mit der Mikroorganismen rascher und einfacher als bisher zur Feststellung ihrer Identität behandelt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei der eingangs genannten Vorrichtung gelöst durch eine Verdünnungseinrichtung zum Verdünnen der Probe in einer Flüssigkeit, wobei die Verdünnungseinrichtung einen verschlossenen Behälter mit einem darin befindlichen vorbestimmten Volumen Flüssigkeit sowie einen offenen Behälter zur Aufnahme der Probe und des vorbestimmten Volumens Flüssigkeit enthält, der offene Behälter über ein Ventil mit einem Verteiler verbunden ist, vom Verteiler mehrere Zweigbahnen ausgehend angeordnet sind, in denen jeweils ein einen bestimmten Mikroorganismus begünstigendes Näiirmedium angeordnet ist, daß anschließend an das Nährmedium eine die Änderung der Lichtdurchlässigkeitswerte zu beobachten lassende Nachweiszelle angeordnet ist, und durch eine Anzeigeeinrichtung zum Messen der optischen Dichte des Verdünnungsgemisches bei der Nachweiszelle, wobei dieses Anzeigegerät eine orientierte Lichtquelle zum Projizieren eines Lichtstrahls durch die Nachweiszelle und eine photoelektrische Zelle enthält, die auf dem Weg des Strahls jenseits der Nachweiszelle angeordnet ist, und ein elektrisches Signal so steuert, daß die Größe des Signals von der Intensität des auf die photoelektrische Zelle fallenden Lichts abhängig ist.

Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigeeinrichtung außerdem eine Uhr und einen Analog-Digital-Umsetzer zum Umsetzen eines von der photoelektrischen Zelle stammenden analogen Signals in ein Digitalsignal enthält.

Durch die Erfindung wird das Entnehmen und die Inkubation von Proben im Raumfahrzeug ermöglicht.

Die Ergebnisse können zur Erde übertragen werden, um eine Analyse, Diagnose und Verordnung für eine Behandlung durchzuführen.

Durrh die Erfindung wird ferner erreicht, daß kein nochqualifiziertes Fachpersonal erforderlich ist und sie ist in idealer Weise zur Analyse menschlicher, kimischer Proben geeignet. Schließlich sind die Mikroorganismen völlig in der Vorrichtung enthalten, so daß nur eine geringe Gefahr besteht, daß Mikroorganismen entweichen können.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.

Fig. 1 ist eine perspektivische Darstellung des mit der mikrobiologischen Probe im Zusammenhang stehenden Teils der Erfindung;

F i g. 2 ist eine perspektivische Darstellung eines Teils der F i g. 1;

Fig. 3 ist eine Blockzeichnung des optischen Anzeigegeräts zum Messen der relativen optischen Dichte der verschiedenen Zellen;

Fig.4 ist eine perspektivische Darstellung des einen Teil des optischen Anzeigegeräts bildenden Kopfes für die optische Messung;

Fig.5 ist ein Querschnitt entlang den Linien 5-5 von der F ig. 4 und

Fig.6 bis 13 sind typische von dem optischen Anzeigegerät herstammende Kurvendarstellungen.

Der Teil für die mikrobiologische Probe

Der Teil 2 für die Probe enthält (Fig. 1) ein T-förmiges Gestell 10, das aus einem Endteil 12 und einem Verteiler 14 besteht, der mit dem Endteil 12 verbunden ist und von dessen Mittelpunkt aus vorspringt. Der Endteil 12 hat einen nach oben sich öffnenden Hohlraum 16, der sich praktisch über die gesamte Länge des Endteils erstreckt, und dieser Hohlraum 16 enthält einen Kunststoffaußenbeutel 18, der an seinen beiden Seitenrändern und auch an dem einen Endrand geschlossen ist. Das andere Ende des Kunststoffbeutels 18 wird offengelassen, um einen Zugang zu dem Inneren des Beutels zu ermöglichen. In dem Außenbeutel 18 befindet sich ein Verdünnungsmittelvorratsbehälter 20, der praktisch aus einem anderen Beutel besteht und vollständig verschlossen und mit einem bekannten Volumen Verdünnungsmittel, das für das Wachstum von Mikroorganismen geeignet ist, gefüllt ist. Destilliertes Wasser ist für diesen Zweck besonders gut geeignet.

Der Verteiler 14 hat einen hohlen Innenraum, der mit dem Innenraum des Außenbeutels 18 durch ein Ventil 22, das sich an dem T-förmigen Gestell 10 an dem Verbindungspunkt von dem Verteiler 14 uno dem Endteil 12 befindet, zusammenhängt und dadurch einen Durchflußkanal bildet, der von dem Beutel 18 ausgeht. An seinem entgegengesetzten Ende hat der Verteiler 14 eine Membran bzw. Scheidewand 24, die normalerweise das Ende des Verteilers 14 verschließt, aber einen Zugang zu dem Innenraum des Verteilers 14 zuläßt, wenn sie mit einem scharfen Gerät, wie z. B. einer Hohlnadel, durchstochen wird. Wenn das zum Durchstechen benutzte Gerät zurückgezogen wird, schließt sich die Scheidewand 24 natürlich von selbst wieder. Der Verteiler 14 ist entlang jeder Seite mit Führungsstiften bzw. Steckstiften 26 versehen, die paarweise angeordnet sind, und zwischen den Führungsstiften 26 von jedem Paar ist der Verteiler 14 außerdem mit Scheidewänden 28 versehen. Die Scheidewände 28 lassen gleichfalls einen Zugang zu dem Innenraum des Verteilers zu, wenn sie durchstochen werden.

Auf der einen Seite des Verteilers 14 hat die Seite des Endteils 12 einen Arretierungsanschlag oder Sperrkegel 30 und auf der anderen Seile eine Arretierungsaussparung 32.

Der Teil 2 zur Aufnahme der Probe nimmt ein Abstrichstäbchen 34 auf, dessen Spitze die zu analysierende Probe enthält, !m einzelnen wird das Abstrichstäbchen 34 in das offene Ende des Beutels 18 eingeführt, und dann wird der Stiel dus Stäbchens abgebrochen, so daß nur die Spitze des Abstrichstäbchens und die Probe in dem Beutel 18 zurückbleibt.

Dann werden die einzelnen Endränder des Kunststoffbeutels durch Erwärmen miteinander verschweißt, so daß die Probe in dem Beutel 18 völlig verschlossen vorliegt.

Die Kassetten 4 (F i g. 2) sind Teile des Teils 2 für die

'5 Probeentnahme und bestehen aus einem klaren Kunststoff, wie z. B. aus Polycarbonat oder aus Polyäthylen hoher Dichte. Sie haben eine rechteckige Form und ähneln kleinen Chips oder Spänen. Es ist festgestellt worden, daß Kassetten mit Abmessungen

μ von 2,5 χ 1,8 χ 0,3 cm in der Praxis für die Erfindung ideal geeignet sind.

Jede Kassette 4 hat ein Paar Führungslöcher 40, die sich von einem Ende nach außen erweitern, und diese Führungslöcher haben eine solche Größe und sind in einem solchen Abstand voneinander angeordnet, daß sie die Fühlungsstifte 26 von irgendeinem Paar, die von dem Verteiler 14 des T-förmigen Gestells 10 hervorspringen, aufnehmen. Jede Kassette 4 ist ferner mit einer Einlaßöffnung 42 versehen, die sich längs in der Kassette erstreckt und nach außen hin zu einem der nächsten Führungslöcher 40 hin offen ist. Die Einlaßöffnung 42 enthält eine hohle Impfnadel 44, die nach außen vorspringt und eine gerade Linie mit der Scheidewand 28 zwischen einem Paar der Führungsstifte 26 bildet, wenn diese Führungsstifte 26 mit den Führungslöchern 40 ausgerichtet worden sind. In dem Maße, in dem die Kassette 4 gegen den Verteiler 14, und zwar mit den Führungsstiften 26 in den Führungslöchern 40, gedrückt wird, wird so die hohle Impfnadel 44 die Scheidewand 28, die sich auf ihrem Weg befindet, durchstochen und eine Verbindung zwischen dem Innenraum des Verteilers 14 imd der Einlaßöffnung 42 geschaffen.

Außer der Einlaßöffnung 42 ist die Kassette 4 mit 4 Transportrohren oder -bohrungen 46 versehen, die parallel zueinander und senkrecht zu der Einlaßöffnung 42 verlaufen. Die Transportrohre 46 erstrecken sich so quer durch die Kassette 4. Das stromaufwärtsgerichtete Ende jedes Transportrohrs 46 erweitert sich nach außen durch die Seiten der Kassette 4, und diese Enden sind mit einem geeigneten Verschlußmaterial verstöpselt. Das stromabwärtsgerichtete Ende jedes Transportrohres 46 ist erheblich verkleinert und bildet ein verkleinertes Endstück 48, das ebenfalls verstöpselt ist. Die Einlaßöffnung 42 öffnet sich zu dem stromaufwärtsgerichteten Ende des ersten Transportrohrs 46 hin, während das verkleinerte Endstück 48 dieses ersten Rohrs sich in die Seitenwand einer Nachweis- oder Beobr.chtungszelle 50 hin öffnet. Die gegenüberliegende Seitenwand dieser Nachweiszelle 50 öffnet sich in das stromaufwärtsgerichtete Ende des zweiten Transportrohrs 46 hin. In gleicher Weise sind das stromabwärtsgerichtete Ende des zweiten Transporlrohrs 46 das stromaufwärtsgerichtete Ende des dritten Transportrohrs 46 durch eine andere Nachweiszelle 50 und auch das stromabwärtsgerichtete Ende des dritten Rohrs 46 mit dem stromaufwärtsgerichteten Ende des vierten Rohrs 46 miteinander verbunden. Auf diese Weise bilden die Transportrohre 46 gemeinsam mit den

verbindenden Nachweiszellen 50 einen serpentinförmigen Durchflußkanal durch die Kassette 4. Die Nachweiszellen 50 stellen praktisch Bohrungen oder Rohrseelen dar, die sich völlig durch die Kassette 4 erstrecken und so ausgerichtet sind, daß ihre Achsen parallel zueinander und senkrecht zu der Ebene, in der die Achsen für die Transportrohre 46 liegen, verlaufen. Anstelle einer öffnung in das stromaufwärtsgerichtete Ende eines anderen Transportrohrs 46 hin öffnet sich die Seite der vierten Nachweiszelle 50 zu einem Überlaufreservoir 52, das eine andere Bohrung oder Rohrseele darstellt, die an ihrem Ende verstöpselt ist und parallel zu den Transportrohren 46 verläuft. Die Enden der Nachweiszellen 50 sind durch transparente Bandstreifen 54 abgedeckt und verschlossen, die auf den oberen und unteren Oberflächen der Kassette 4 haften.

Jede Kassette 4 hat ferner eine Verschlußaussparung 56 auf einer seiner Seitenvorderflächen und einen Verschlußanschlag oder Verschlußsperrkegel 58 auf der entgegengesetzten Vorderfläche, und die Aussparungen 56 und Sperrkegel 58 von benachbarten Kassetten 4 greifen ineinander, wenn sie sich auf dem Verteiler 14 in der geeigneten Lage befinden. Außerdem rastet die Aussparung 56 der innersten Kassette 4 auf der einen Seite des Verteilers 14 in den Sperrkegel 30 an dem Endteil 12 ein, während der Sperrkegel 58 der Kassette 4 auf der entgegengesetzten Seite des Verteilers 14 in die Aussparung 32 des Endteils 12 einrastet.

Vor dem Verstöpseln der Enden der Transportrohre 46 werden diese Rohre mit kleinen runden Filtern 64 versehen, die unmittelbar vor den verjüngten Endteilen 48 angebracht sind. Aus Asbestfasern bestehende Filter 64 werden am günstigsten verwendet und die Porengröße und Filterlänge sollte so sein, daß 90% der für die Kassette entnommenen Mikroorganismen von jedem Filter 64 entfernt werden. So wird für jedes Filter 64 eine Verminderung in Rechnung gestellt. Es ist festgestellt worden, daß die gleiche Filtergröße und Filterlänge zu einer 90%igen Verminderung bei allen das Filter passierenden Mikroorganismen führen, unabhängig davon, ob diese bakterielle oder pilzliche Organismen sind. Obwohl folglich die Filter 64 für alle Kassetten die gleichen sind, sind die verschiedenen Kassetten 4 dennoch gegenüber unterschiedlichen Mikroorganismen selektiv.

Das in dem Kassettenfiltersystem verwendete Filtermaterial besteht aus annähernd 0,001 g Asbestfasern in jedem Transportrohr 46. Die Fasern wurden von einem Asbestfaserkissen erhalten. In einem Katalog für wissenschaftliche Produkte ist angegeben, daß ein Filterkissen von ungefähr 3 mm eine Porengröße in dem 2^m-Bereich hat. Es wird angenommen, daß die Verdünnung von Organismen durch Absorption und nicht durch Filtration bewirkt wird. Daher ist die Porengröße unwesentlich.

Außer einem Filter 64 enthält jedes Transporlrohr 46 ein Bett oder eine Füllung 66 aus einem Kulturmedium, und dieses Bett ist darin stromaufwärts von dem Filter 64 angeordnet. Das Kulturmedium ist um besten gefriergetrocknet, und jedes Bett 66 wird nach dem Durchgang von Wasser durch das Transporlrohr 46, in dem sich das Bett 66 befindet, erneut hydratisicrt, bzw. mit Wasser verschen. Das Kulturmedium ist für Mikroorganismen in dom Sinne hoch selektiv, daß es vom optischen Standpunkt aus einer wahrnehmbaren Änderung nur dann iinlcrlicgl, wenn ein bestimmter Typ von Mikroorganismen, d. Ii. der begünstigte Mikroorganismus, darin wuchst. So wird eine optische Änderung in den vier Beobachtungs- oder Nachweiszellen 50 in der Kassette 4 festgestellt, wobei diese optische Änderung im allgemeinen mit dem Verlauf der Zeit progressiv stärker wird, vorausgesetzt natürlich, daß der entnommene Mikroorganismus in der Kassette 4 wächst. Die Änderung kann mit dem unbewaffneten Auge oder mit dem elektronenoptischen Anzeigegerät 6 beobachtet werden.

Das Kulturmedium für jede Kassette 4 ist verschieden. Schließlich wird darauf hingewiesen, daß der größte Teil des Kulturmediums für jede Kassette 4 vor dem ersten Filter 64 konzentriert wird, weil das Kulturmedium sonst, wenn es in Lösung geht, seine größte Konzentration in der vierten oder letzten Nachweiszelle 50 erreichen würde. Bezüglich der meisten Kulturmedien ist empirisch festgestellt worden, daß 50 Gew.-% des Mediums für die Kassette 4 in dem ersten Transportrohr 46, 25 Gew.-% in dem zweiten Rohr 46 und 12,5Gew.-% in dem dritten und auch in

ίο dem vierten Rohr 46 vorhanden sein sollten. Wenn das Kulturmedium in derartigen Anteilen vorliegt, sind die Konzentrationen des Kulturmediums in jeder Nachweiszelle 50 nach der nachfolgenden Hydratation des Kulturmediums, wenn Wasser durch dieses geleitet wird, etwa gleich.

Jede Kassette 4 soll mit dem Namen oder wenigstens mit einer Kodebezeichnung des Mikroorganismus, für den das darin befindliche Kulturmedium gewählt worden ist, beschriftet sein.

Anzeigegerät zum Messen der optischen Dichte
des Verdünnungsgemisches

Das elektronenoptische Anzeigegerät (Fig.3) enthält einen optischen Erkcnnungs- bzw. Meßkopf 80, der (F i g. 4 und 5) ein Paar Aluminiumblöcke 82 und 84 aufweist, die zusammenpassen und viele Aussparungen 86 enthalten. Jedes Paar von gegenüberliegenden Aussparungen 86 ist größenmäßig so bemessen, daß es eine Kassette 4 aufnehmen und dadurch diese Kassette 4 in einer vorbestimmten Lage zwischen den Blöcken 82 und 84 halten kann. Für jedes Paar von gegenüberliegenden Aussparungen haben die Blöcke 82 und 84 vier Sätze von ausgerichteten Ausbohrungen 88, die sich in die Aussparungen 86 öffnen, und diese Ausbohrungssätze 88 sind so angeordnet, daß sie in eine gerade Linie mit den Nachwciszellen 50 in der Kassette 4 gebracht werden, wenn die Kassette 4 in diesen Aussparungen 86 angeordnet wird. An dem äußeren Ende von jeder dieser Ausbohrungcn 88 ist der Block 82 mit einer Festemitterdiode 90 versehen, die Licht mit einer Wellenlänge von 665 nm emittiert und dieses Licht durch die Ausbohrung 88 und auch durch die gegenüberliegenden Aussparungen 86 und die ausgerichtete Atisbohrung 88 projiziert. An den iiußercn

SS Enden von jeder seiner Ausbohrungcn 88 ist der andere Block 84 mit einer Meßdiode 92 ausgestattet, die auch im festen Zustand vorliegt und das von der entsprechenden Emittcrdiodc projiziertc Licht messen kann. Die Mcßdiodc 92 ermöglicht, daß durch sie, wenn sie von Lieht von der Emittcrdiodc 90 getroffen wird, ein Strom fließt, und die Größe dieses Stroms ist der Lichtintensität, die auf die Mcßdiodc 92 fallt, proportional. So ist die Diode 92 im Effekt eine Photo/eile. Eine Klemmvorrichtung (nicht dargestellt) ist zum Aneinanderhalten

fi.i der Blöcke 82 und 84 vorgesehen.

Eingebettet in den Blöcken 82 und 84 sind elektrische Heizelemente 94 vorhanden, und diese Elemente leiten Strom durch eine I lei/drossd 96. Die Hcizdrossel %

hält die Blöcke 82 und 84 bei 35⁰C, und dementsprechend werden die Mikroorganismen in den Kassetten 4 bei dieser Temperatur bebrütet.

Die Festemitterdioden 90 zweigen Strom von einem Stromantriebsorgan 100 mit einem für jede der Dioden 90 zur Verfugung stehenden Kanal ab. Das Stromantriebsorgan 100 wiederum wird durch einen Takt- bzw. Zeitregler 102 gesteuert, der für jede der Emitterdioden 90 einen Kanal zur Verfügung stellt. Der Zeitregler 102 bewirkt u. a., daß das Stromantriebsorgan 100 einen <o pulsierenden Strom erzeugt, der eine Spur wie eine Rechteckwelle verfolgt. Als Ergebnis projiziert jede Emitterdiode 90 einen pulsierenden Lichtstrahl durch die Nachweiszclle 50, mit dem diese in einer Geraden liegt. Weil der Strahl pulsiert, pulsiert der Stromfluß durch die Gegenmeßelektrode 92 ebenfalls, und zwar mit der gleichen Frequenz. Der Zeitregler 102 schaltet die Emitterdioden 90 nacheinander an und aus, wobei er jede Emitterdiode 90 2 Minuten lang eingeschaltet läßt. So sind 8 Minuten für die Prüfung aller vier Nachweiszellen 50 einer einzelnen Kassette 4 erforderlich.

Die Meßdioden 92 nehmen die pulsierenden Lichtstrahlen von den Emitterdioden 90, die mit denen in einer Geraden liegen, auf, und ermöglichen, daß ein pulsierender Strom durch sie fließt. Die Größe dieses Stroms ist der Intensität des auf diese fallenden Lichts proportional. Die Dioden 92 sind mit einem Vorverstärker 110 verbunden, und dieser Vorverstärker enthält eine gesonderte oder zugeordnete Vorverstärkerschaltung für jede Diode 92. Diese Vorverstärkerschaltungen verstärken die pulsierenden Stromsignale, die von ihren entsprechenden Meßdioden 92 herkommen.

Die von den Meßdioden 92 herstammenden und durch die gesonderten Schaltungen des Vorverstärkers 110 verstärkten Ströme stellen analoge Signale dar. Diese Ströme werden in einem Datenselcktor und einem Verstärker 112, mit dem der Vorverstärker 110 verbunden ist, weiterverstärkt. Der Datenselektor und Regler 112 enthält einen einzelnen Verstärker und ist ferner mit einem Zeit- bzw. Taklregler verbunden, 4» durch den er gesteuert wird. Der durch den letzteren Geräleteil zur Verfugung gestellte Regler ermöglicht die Einzelverstärkung des Datcnselektors und des Verstärkers 112, um die einzelnen Signale, die nacheinander von den getrennten Schaltungen des Vorverstärkers 112 herstammen, zu verstärken, so daß der Abgabestrom von dem Gerät durch einen einzigen Kanal abgegeben wird. Dieser Strom ist ebenfalls ein analoges Signal.

Verbunden mit dem Datenselektor und dem Vcrstärkcr 112 und außerdem mil dem Zcitreglcr 102 ist ein Analog-Digital-Umsetzer 114, der das Verstärkcranalogsignal, das von dem Datenselektor und dem Verstärker 112 herstammt, in ein Digilalsignal umsetzt. Das Signal drückt den verstärkten Strom von der aktivierten Meßdiode 92 als eine Funktion der /.eil aus. Der Umsetzer 114 wendet die Auflauf-Konvcrsionstcchnik an.

Der Analog-Digital-Umsetzer H* 'M '«'» einem Aufzeichnungsantriebsorgan IHi verbunden, und dieses <* Auf/.cichnungbantricb.sorgan lift ist wiederum mil einem Datenschreiber 118 verbunden. Der crsterc wandelt die Digitalsignalc in eine Form um, die für die Schaltung des letzteren geeignet ist. Dur Schreiber 118 hat Indikatoren, die zahlenmäßig die Größe des ⁶S Digitalsignals in drei Dezimalstellen wiedergeben, und diese entspricht der Grölte des analogen Signals und der Große des durch die Mcßclcktrodcn 92 fließenden Stroms. Der Datenschreiber 118 gibt außerdem zahlenmäßig die verstrichene Zeit von einem gewählten Ausgangspunkt an wieder, wie z. B. sobald die Inkubation in dem Meßkopf 80 begonnen hat.

Der Zeitregler 102 ist ferner mit einem Dekadendekoder 120 verbunden, der wiederum verbunden ist mit und geregelt wird von einem aktiven Kanalschreiber 122. Der letztere zeigt an, welche der Emiiterdioden 90 erregt wird und daher welche der Kassetten 4 und welche Nachweiszelle in der betreffenden Kassette eine Lichtprojektion durch sich erfährt.

Sowohl das Aufzeichnungsantriebsorgan 116 als auch der Dekadendekoder 120 sind mit einem Meßwertdrukker 124, wie es auch der Zeitregler 102 ist, verbunden und dieser Geräteteil zeichnet die Größe des Digitalsignals, die entsprechende Zeit, zu welcher das Signal erscheint, und die Meßdiode, von der das Digitalsignal herstammt, auf.

Die von dem Meßwertdrucker 124 herstammenden Digitaldaten werden auf kartesische Koordinaten (F i g. 6) aufgetragen, und zwar das Digitalsignal auf der Ordinate und die Zeit auf der Abszisse, wobei vier Kurven für jede Kassette 4 erhalten werden, d. h. eine für jede darin enthaltene Nachweiszelle 50 (Fig.6 bis 13).

Beim Betrieb werden die Kassetten 4, nachdem sie von dem Verteiler 14 getrennt worden sind, in den optischen Meßkopf 80 eingeführt, indem sie in den Aussparungen 86 von Blöcken 84 angeordnet werden und dann die Blöcke 32 auf diesen befestigt werden. Die verstrichene Zeit zwischen dem Rehydratisieren des Kulturmediums 66 und dem Einführen der Kassetten 4 in den optischen Meßkopf 80 sollte eine Stunde oder zwei Stunden nicht überschreiten, weil die Mikroorganismen zu wachsen beginnen, wenn sie einmal in den Lösungen sind, die die Kulturmedien enthalten. Einmal werden alle Kassetten 4 in dem optischen Meßkopf 80 aufgestellt, der Zeitmesser des Zeitreglers 102 wird in Gang gesetzt, und die verstrichene Zeit wird auf dem Datenschreiber 118 registriert. Gleichzeitig stellt der Zeitregler 102 die erste Emitterdiode 90 an, und diese Diode projiziert einen Lichtstrahl durch die erste Nachweiszellc 50 in der ersten Kassette 4. Dieser Lichtstrahl fälli auf die erste Meßdiode 92, was ermöglicht, daß ein Strom fließt. Die Größe dieses Stroms ist der Intensität des Lichts, das die Nachweiszellc 50 verläßt, direkt proportional. Der zugeordnete Vorverstärker UO für die erste Meßdiode 92 verstärkt diesen Strom, und der Strom wird weiter durch den Datenselektor und den Verstärker 112 verstärkt, der durch den Zeitrcgler 102 angestellt worden ist. um nur den Strom von dem Vorverstärker zu der erstein Mcßdiodc zu leiten. Der so verstärkte Strom stellt ein analoges Signal dar, das an den Analog-Digital-Umsetzer 114 abgegeben wird, und dieser setzt den Strom in ein Digitalsignal um, das als /.wci Signale oder Ströme ungesehen werden kann, von denen einer die Intensität des auf die erste Meßdiode fallenden Lichts darstellt und der andere die Zeitspanne darstellt, in der der Strom existiert. Das Aiiizcichmingsantricb&organ 116 setzt das Digilalsignal in ein Format um,das für den Datenschrei· bcr 118 geeignet ist, der die verstrichene Zeit und die Intensität des Lichts anzeigt, wobei die letztere in drei Stellen angegeben wird.

Der Zeitrcgler 102 läßt die erste F.mitterdiodc 90 für /wci Minuten an. doch zeigt der Dalenschrcibcr nur die Lichtintensität während der letzten 45 Sekunden von dieser Zwciminutcnspannc an. Die erste Minute wird für

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einen Einschwingvorgang in dem Datenselektor und dem Verstärker 112 gebraucht, und während der nächsten 15 Sekunden stellt sich der Analog-Digital-Umsetzer 114 ein.

Die letzten 45 Sekunden stellen die tatsächliche Ablesung dar, die durch die erste Nachweiszelle 50, wie oben angegeben ist, vorgenommen worden ist. Der Kanalschreiber 122, der mit dem Zeitregler 102 durch den Dekadendekoder 120 verbunden ist, zeigt, daß die Ablesung von dem ersten Kanal oder spezieller von der ersten Meßdiode 92 herkommt, die der ersten Nachweiszelle 50 in der ersten Kassette 4 entspricht. Der Meßwertdrucker 124 zeichnet die vorstehende Information auf, wobei eine Eintragung für jede Verweilzeit von 2 Minuten bei einer einzelnen Nachweiszelle erfolgt.

Nach der Zweiminutenspanne für die erste Nachweiszelle 50 schaltet der Zeitregler 102 die erste Emitterdiode 90 ab und schaltet die zweite Emitterdiode an, und die gleiche Prozedur wird für die zweite Nachweiszelle 50 wiederholt. So wird die Intensität des durch die zweite Nachweiszelle 50 fallenden Lichts wie die Zeitspanne in der die besondere Intensität gegeben ist, aufgezeichnet. Die übrigen Kanäle werden in der gleichen Weise nacheinander abgelesen.

Wenn der Zeitregler von dem vierten Kanal zu dem fünften Kanal schaltet, beendet er die Ablesung für die erste Kassette 4 und beginnt mit den Ablesungen für die zweite Kassette 4, wobei der fünfte bis achte Kanal für die zweite Kassette 4 zur Verfügung stehen. So werden die Kassetten 4 nacheinander entsprechend den einzelnen Nachweiszellen 50 in den Kassetten 4 abgelesen.

Wenn alle Nachweiszellen 50 für alle Kassetten 4 abgelesen worden sind, wird die Folge wiederholt. Das gleiche Verfahren wird mit periodischen Intervallen von vielleicht 3 bis 10 Stunden und noch länger durchgeführt, und zwar je nach der Art der Mikroorganismen, nach denen gesucht wird. Während der gesamten Zeit bleiben die Heizelemente 94 in Betrieb und halten die Kassetten 4 bei 35° C.

Zunächst sind die Lösungen in den verschiedenen Nachweiszellen 50 klar, und daher wird das meiste des auf diese durch die Emitterdioden 90 projizierte Licht durchgelassen. Die Meßdioden 92 erhalten daher das meiste des von den Emitterdioden emittierten Lichts, und diese große Lichttransmission spiegelt sich in den Aufzeichnungen auf dem Datenschreiber wieder. So sind niedrige Werte für die Wiedergabe der Zeit im allgemeinen von hohen Werten für die Aufzeichnung der optischen Dichte begleitet. In dem Maße, in dem die Zeit verstreicht, wachsen die Mikroorganismen zu Kulturen oder erzeugen Prczipitale in den Lösungen in den Kassetten 4. Daher lassen die Nachweis/eilen 50 nicht so viel Licht hindurch, und dieses wird in Form eines niedrigeren Abluscwcrtcs für die optische Dichte auf dem Datenschreiber 118 registriert. Manchmal verringert sich die optische Dichte für eine Zelle 50 stark und erhöht sich dann für eine kurze Zeitspanne bevor sie erneut abfüllt. Im allgemeinen brauchen Pilzorganismen eine lungere Zeil, um eine Änderung der optischen Dichte zu verursachen als Haktciienori»anis men.

Auf jeden I⁷SiH werden die Ablesungen, die von dem Wert für die optische Dichte und von dem Zeitwert des Datenschreibers 118 herstammen, auf kartesischen Koordinaten aufgetragen, und im allgemeinen werden die Ablesungen von vier Nachweis/eilen 50 einer einzelnen Kassette 4 auf einem einzigen Diagramm aufgetragen, so daß sich bei jedem Diagramm vier Kurven bilden. Die Kurven für jeden Mikroorganismus siind für den betreffenden Organismus charakteristisch

5 oder stellen, in anderen Worten ausgedrückt, eine einmalige zeitbezogene Kennzeichnung für den Organismus dar. Wenn so eine Kassette 4, die ein Kulturmedium 66 enthält, das einen speziellen Organismus begünstigt, Diagramme ergibt, die den früheren für

ίο diesen speziellen Organismus aufgenommenen Diagrammen entsprechen, dann ist die Anwesenheit des Mikroorganismus in den Proben bestätigt. Wenn andererseits die optische Dichte für die vier Nachweis-J'.ellen 50 für eine besondere Kassette 4 unverändert bleibt, wird das Fehlen des Mikroorganismus, dessen Wachstum durch das Kulturmedium 66 begünstigt wird, für die betreffende Kassette bestätigt.

Sollte die optische Dichte der Lösung in einigen der Nachweiszellen 50 für eine besondere Kassette sich

ϊο ändern, aber nicht die übrigen, so zeigt dieses an, daß eine nichtsignifikante Anzahl Mikroorganismen in den unveränderten Zellen 50 existieren. Weil das Gesamtvolumen des Wassers von dem Reservoir 20 bekannt ist, wie auch der Verdünnungsfaktor durch die Filter 64 für

die Kassetten 4, kann die Gesamtanzahl der Mikroorganismen in der Probe bestimmt werden, zumindest zwischen zwei aufeinanderfolgenden Faktoren von 10.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern Ablesungen bzw. Skalenwerte, die von dem elektronenoptischen

Anzeigegerät 6 herstammen können, sowie die Schlußfolgerungen, die aus diesen Ablesungen oder Skalenwerten nach 16stündiger Inkubation und der Analyse gezogen werden können.

B e i s ρ i e I 1

Eine Kassette (Fig.4), die Ureasekullurmedium enthielt, das das Wachstum des Mikroorganismus Proteus begünstigt, wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren mit menschlischem Urin geimpft. Die

Kassette 4 wurde dann in dem elektronenoptische!! Anzeigegerät 6 analysiert, und am Ende der Analyse hatten die ersten beiden Nachweiszellcn 50 für die betreffende Kassette 4 eine signifikante optische Dichte während die dritte und die vierte Zelle 50 keine

signifikanten Änderungen aufwiesen. Die von dieser Nachweiszellcn herstammenden Diagramme sind in der ^Fig·6 wiedergegeben, und die Diagramme für die ersten beiden Zellen entsprechen den früheren Diagrammen für ilen Mikroorganismen Proteus. Diese;

bestätigt das Vorhandensein des Pmicus-Organismiis Die Tatsache, daß die Diagramme nur in Verbimluiif mit der ersten und zweiten Zelle 50 erscheinen, zeigt an daß die (iesanitanzalil der Mikroorganismen über IO^:

aber unter H)I lieiM.
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H c i s ρ i e I 2

Line andere Kassette 4 wurde mit einer aus ilen Wachen entnommenen Probe nach ilen oben iingegebc· neu Verfahren beimpft. Diese Kassette 4 einhielt diu Kulturmedium, das das Wachstum von Staphylococcus begünstigt. Die Kassette 4 wurde in dem elckironcnop tischen Anzeigegerät 6 angeordnet, und es wurde das ii «er Fig.4 dargestellte Diagramme erhalten, tönt schnelle Zunahme der optischen Dichte in der eistet s und der zweiten Zelle, und zwar in der vierten bis achtel Munde, zeigt die Anwesenheit von möglicherweise palhogcncm Coaguhise-positivcm SlaphylococcW «ureus an. Nieht-piitliogcne aber verwandte Organ*

men, die im allgemeinen durch Inocculation im menschlischen Rachen gebildet werden, erzeugen eine graduelle Änderung der Dichte, wie in Zellen 3 und 4 zu sehen ist. Es wird darauf hingewiesen, daß die positive Reaktion, die in den Zellen 1 und 2 beobachtet wird, anzeigt, daß die eingeimpfte Probe über 1000 Organismen von dem Coagulase-positivem S. aureus enthielt.

Beispiel 3

Noch eine weitere Kassette 4 wurde mit einer Probeentnahme aus dem Rachen nach den oben angebenen Verfahren beimpft. Diese Kassette enthielt das Kulturmedium, das das Wachstum von Candida begünstigt. Diese Kassette wurde anschließend in einem elektronenoptischen Anzeigegerät 6 angeordnet, und es wurde das in der F i g. 8 wiedergegebene Diagramm erhalten. Dieses Kulturmedium hat sich als so hoch selektiv erwiesen, daß nur Candida albicans in weniger als 16 Stunden gewachsen war. Auch nahe verwandte Candidaarten, die nicht Candida albicans sind, ergeben keine Diagramme, die eine signifikante optische Dichte anzeigen. Der Unterschied oder Trennungsgrad zwischen den Zellen 1 und 2 aufgrund der Diagramme ist bei langsam wachsenden Organismen, wie z. B. Pilzen (Candida) am größten, und zwar im Gegensatz zu den schnell wachsenden Bakterien.

Beispiel 4

Eine Kassette 4, die das Pseudomonas aeruginosa begünstigende Kulturmedium enthielt, wurde mit einer Urinprobe beimpft und dann mit dem elektronenoptischen Anzeigegerät 6 analysiert. Das in der F i g. 9 wiedergegebene Diagramm wurde erhalten. Das Maximum in den Kurven, das bei bestimmten Konzentrationen von Pseudomonas aeruginosa erscheint, ist auf einen Pigmentvorläufer zurückzuführen, der in dem Maße verbraucht wird, in dem das Wachstum fortschreitet. Dieses ist ein charakteristisches Merkmal von P. aeruginosa und ist zu sehen, wenn die Dichte der wachsenden Kultur mit Rotlicht gemessen wird. Der Hocker in dem Diagramm ist am größten, wenn die Konzentrationen der Organismen am größten sind, wie dem Diagramm von der Zelle 1 zu entnehmen ist.

Beispiel 5

Eine andere Kassette 4, die das Kulturmedium enthielt, das das Wachstum von Escherichia coli begünstigt, wurde mit einer SUihlprobe beimpft und dann mit dem elektronenoptische!! Anzeigegerät β analysiert. I is wurde das in der Fi g. 10 wiedergegebenc Diagramm erhallen. Die Diagramme /eigen eine rapide Uclitschwücluing (Erhöhung der Dichte) an, was nur zu beobachten ist, wenn Organismen der C'oliart vorhanden sind. Wie in allen vorhergehenden Diagrammen kann die in der eingeimpften Probe vorhandene Ciesamtanzahl von Coliarten ermittelt weiden. Das Wachstum in der Zelle 3 nach drei zehnfachen Verdünnungen zeigt, daß mehr als 10 000 Organismen der Coliart je ml der eingeimpften Probe vorhanden sein können.

B e i s ρ i c ! r>

Menschlicher Urin wurde in eine andere KassiMlu 4, die ein Kulturmedium enthielt, das das Wachstum von Salmonella typhosa begünstigt, eingetragen. Die Kassette 4 wurde dann in dem elektronenoptischen Anzeigegerät 6 angeordnet, und das in der Fig. 11 wiedergegebene Diagramm wurde erhalten. Wie bei den meisten vorhergehenden Beispielen zeigt die rapide Zunahme der Dichte das Vorhandensein von einer der pathogenen Salmonellenarten an.

Beispiel 7

Noch eine andere Kassette 4 wurde mit einer

ίο Entnahmeprobe aus dem Rachen nach den oben angegebenen Verfahren beimpft. Die Kassette enthielt das Kulturmedium, das das Wachstum von Streptococcus pyogenes (Typ A) begünstigt. Die Kassette 4 wurde dann in dem elektronenoptischen Anzeigegerät 6 angeordnet, und es wurde das in der Fig. 12 wiedergegebene Diagramm erhalten. Die Diagramme der ersten beiden Zellen sind charakterisitische Diagramme, wie sie erhalten werden, wenn beta hämolytische Streptococci in der eingeimpften Probe vorhanden sind. Die Maxima der Kurven, die in den ersten wenigen Stunden der Inkubation erscheinen, sind auf eine Zunahme der Lichtdurchiässigkeit zurückzuführen, die auftritt, wenn in dem Kulturmedium enthaltenes Fibrin durch die Aktivität der Streptococci aufgelöst wird. Durch eine hinreichende Vermehrung der Organismen nimmt jedoch die gesamte Lichtmenge bald ab, und es findet ein scharfer Abfall hinsichtlich der Lichtdurchlässigkeit statt. Inhibitoren in dem Kulturmedium verhüten das Wachstum von Organismen, die Fibrin aufzulösen vermögen, außer den beta hämolytischen Streptococci. Daher zeigt das charakteristische Maximum in dem Diagramm das Vorhandensein von beta hämolytischen Streptococci an. Den Diagrammen in der F i g. 12 ist zu entnehmen, daß beta hämolytische Streptococci in den ersten beiden Zellen und nicht in den Zellen 3 und 4 vorhanden sind. Die relative Anzahl der Streptococci, die in der eingeimpften Probe enthalten sind, kann daher wie in den vorstehenden Beispielen bestimmt werden.

Beispiel 8

Eine weitere Kassette 4 wurde mit einer Hautentnahmeprobe nach den oben angegebenen Verfahren beimpft. Die Kassette 4 enthielt das Kulturmedium, das das Wachstum von Hercllca vagincola begünstigt. Diese Kassette 4 wurde dann in dem elektronenoptische!! Anzeigegerät 6 angeordnet, und es wurde das in der Fig. 13 wiedergegebene Diagramm erhalten. Das für llerellea selektive Kulturmedium erlaubt ein schnelles Wachstum und daher eine schnelle Abnahme der l.iehtdurehlilssigkeii und zeigt daher das Vorhandensein von Itcrcllca vagincola an.

Aus ilen vorstehenden Beispielen ist ersichtlich, daß Proben ohne schwierige und /.eitriuibende Verfahren, wie sie früher angewendet wurden, analysiert werden können. Außerdem sind keine langen Zeitspannen für die Inkubation der Mikroorganismen erforderlich und weiden Methoden, die /u Versuchsfeldern führen, vermieden. Außerdom ist die Vorrichtung außerordent-

(κι lieh einfach zu bedienen, so daß kein hoch qualifiziertes Fachpersonal eingesetzt werden muß. Wenn ferner einmal der Beutel 18 der l'rüfpiitione verschlossen ist, sind die Mikroorganismen in diesem völlig eingeschlossen und können nicht entweichen, so daß die

iiS Vorrichtung nach der Erfindung sehr sicher ist.

Hierzu (1 BhII Zeiduiimgcn

Claims

23 2δ 262

Patentansprüche:

I. Vorrichtung zum Feststellen und Identifizieren von Mikroorganismen in einer Probe, bei dem man die Probe mit einer Flüssigkeit verdünnt, das Gemisch von Flüssigkeit und Probe mit einem selektiven Nährmedium mischt und die relative optische Dichte dieses Gemisches zur Feststellung einer Änderung wiederholt mißt, gekennzeichnet durch eine Verdünnnungseinrichtung zum Verdünnen der Probe in einer Flüssigkeit, wobei die Verdtinnungseinrichtung einen verschlossenen Behälter mit einem darin befindlichen vorbestimmten Volumen Flüssigkeit sowie einen offenen Behälter zur Aufnahme der Probe und des vorbestimmten Volumens Flüssigkeit enthält, der offene Behälter über ein Ventil mit einem Verteiler verbunden ist, vom Verteiler mehrere Zweigbahnen ausgehend angeordnet sind, in denen jeweils ein einen bestimmten Mikroorganismus begünstigendes Nährmedium angeordnet ist, daß anschließend an das Nährmedium eine die Änderung der Lichtdurchlässigkeitswerte zu beobachten lassende Nachweiszelle angeordnet ist, und durch eine Anzeigeeinrichtung zum Messen der optischen Dichte des Verdiinnungsgemisches bei der Nachweiszelle (50), wobei die Anzeigeeinrichtung eine orientierte Lichtquelle (90) zum Projizieren eines Lichtstrahls durch die NachweiszeMe und eine photoelektrische Zelle (92) enthält, die auf dem Weg des Strahls jenseits der Nachweiszelle angeordnet ist und ein elektrisches Signal so steuert, daß die Größe des Signals von der Intensität des auf die photoelektrische Zelle fallenden Lichts abhängig ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzeigeeinrichtung außerdem eine Uhr (102) und einen Analog-Digital-Umsetzer (114) zum Umsetzen eines von der photoelektrischen Zelle stammenden analogen Signals in ein Digitalsignal enthält.