DE1517746C - Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen sowie Vorrichtung zu seiner Durchführung - Google Patents

Description

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufzucht, Teilung und Nährmediumzugabe mehrmals wiederholt.

. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge" kennzeichnet, daß man bei jeder Teilung die weiteren Wiederholungen mit einer Hälfte der Zellkultur durchführt und die andere Hälfte ihren Kreislauf vollenden und zu weiterem Wachstum in einen Nachkreislauf eintreten läßt.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3, mit einem geschlossenen Aufzuchtgefäß zur Aufnahme einer Zellkultur, bestehend aus einer Zyklonkolonne, einem Umwälzbogen und einer Umwälzpumpe, mit einer Einrichtung zum Konstanthalten der Zellkulturtemperatur. mit einer eine l'umpe mit regelbarer Fördermenge/Zeit umfassenden Nährinediumzuführungseinrichtung sowie mit einer Alislaßeinrichtung für die mit Nährmedium gemischte Zellkultur in ein Sammelgefäß, gekennzeichnet durch ein zwischen die Nährmediumzufiilmmgseiniichtimg (33 bis 37) und das Aufzuchtgefäß (1) geschaltetes Dosiergefäü (21) mit einem automatischen Heber (22) für die Zugabe konstanter Volumina in vorherbestimmten Zeitumständen und einen zwischen die Aiislaßeinrichtung und das Aufzuchtgefäß (1) geschalteten automatischen Heber (40) für das Überleiten von mit den zugegebenen Nährmiltelvolumiiia gleichen Zellkiillurvolumina in das Sammclüefäß (39).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren /ur Züchtung von Zellkulturen, deren Zellen weitgehend in tier gleichen Entwicklungsphase vorliegen, sowie eine Vorrichtung zu seiner Durchführung.

Unter »in gleicher Entwicklungsphase befindlichen« oder »phasengleichen« Zellkulturen sind nachstehend /ellkiilturen zu verstehen, bei denen sich mindestens ein überwiegender Anteil der Zellen, gewöhnlich mindestens 70 bis 80%, in-einem entwicklimgsgkichen Zustand des Wachstums befinden, d. li. in ciiuiii übereinstimmenden Wachstiimsstad'ium ihres Zeilkreislaufs vorliegen.

Verfahren /ur Züchtung von Zellkulturen sind bekannt: es gibt im wesentlichen die urundlegiMukMi Allen einer kontinuierlichen und einer diskoiitinuiu · liehen Arbeitsweise.' Bekanntlich ist von den das Wachstum von Zellkulturen bestimmenden Umgebungseinflüssen insbesondere das Nährmedium von Einfluß auf die Wachstumsgeschwindigkeit, während Belüftung, ph-Wert und Temperatur von nachgcordneter Bedeutung sind.

Bei dem bekannten, diskontinuierlichen Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen läßt man die Zellkultur bei konstantem Volumen in einer gegebenen

ίο Menge an Nährmedium wachsen. Zunächst ist mehr Nährmedium vorhanden als für die maximale Wachs-Unnsgeschwindigkeit der Zellen erforderlich ist. Bei fehlender Zufuhr von Nährmedium von außen ändert sich infolge seines Verbrauchs seine Zusammensetzung mit zunehmender Anzahl der Zellen ständig, bis nach Aufbrauchen des Überschusses an Nährmedium eine ständige Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit eintritt und bei völligem Verbrauch einer'Nährstoffkomponente das Zellwachstum vollständig auf-

.20 hört.

Die ständige Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit bei diesem Verfahren — gegebenenfalls ausgenommen während des kurzen Zeitraumes exponentiellen Wachstums — macht eine Untersuchung der Stoflwechselprodukte oder Metabolite und damit des Stoffwechsels der Zellen äußerst schwierig. Es ist auch bereits ein kontinuierliches Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen bekannt (USA.-Patentschrift 2 822 319), bei welchem man die Zusammensetzung des Nährmcdiums und die Anzahl der Zellen in dein Nähnnedium konstant hält, so daß auch die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen in der Kultur im wesentlichen konstant bleibt. Hierzu führt man einerseits kontinuierlich Nährmedium zu und zieht andererseits kontinuierlich entsprechende Volumenanteile der Zellkultur ab, so daß sich ein Gleichgewichtszustand ergibt, der praktisch unbegrenzt aufrechterhalten werden kann. Durch vorherige Festlegung der Zusammensetzung des Nährmediums kann zusätzlich eine vorherbestimmte Wachstumsgesehwindigkeit eingestellt werden. Es läßt sich somit ein konstanter Stoffwechsel der Zellen mit konstanter Bildung von StofTwechselprodukten erreichen.

Sowohl bei der bekannten kontinuierlichen als auch bei der bekannten diskontinuierlichen Arbeitsweise liegen die einzelnen Zellen der Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt in ganz verschiedenen Entwicklungsphasen \or, d. h., es erfolgt keine Teilung der Zellen in einem einheitlichen Takt, da sich die Zellen der Kultur von Natur aus in statischer Verteilung entsprechend dem Gaußschen Wahrscheinlichkeitsgesetz teilen, nine Untersuchung des Zellstoffwechsels und ein Ernten der Stoffwechselprodukte der Zellen in Abhängigkeit von der Entwicklungsphase bzw. dem Zellkreislauf ist bei diesen bekannten Verfahren nicht möglich, da die Zellkultur zu jedem Zeitpunkt ein Mittel über den gesamten Zcllkreislauf darstellt und demgemäß weder irgendeine besondere Entwicklungsphase untersucht werden kann noch die darin erzeugten Produkte geerntet werden können. Sowohl bei dem diskontinuierlichen als auch bei dem kontinuierlichen Ziichtungsverfahlen wird daher wegen der Zuf'ailsverteilung der Zellen über alle Entwicklungsphasen jede Größe, die für eine bestimmte F.ntwicklungsphase charakteristisch ist. über die gesamte Kultur gemittelt und nivelliert. Dabei ergibt sich bei dem bekannten kontinuierlichen Züchtuniisv erfahren weizen tier konstanten Wartuims

ι. ο¹ ι ι ι -re\j

geschwindigkeit der Zellen lediglich ein höherer — aber dennoch nivellierter — Wert. ;

Es ist auch bereits bekannt (H. Lüers, »Die wissenschaftlichen Grundlagen von Mälzerei und Braueret«, 1950, S. 631), die Vermehrungsintensität von Hefen bzw. Mikroorganismen durch die Generationsdauer auszudrücken. In dieser Literaturstelle wird auch auf Möglichkeiten zur Kennzeichnung der ZeI-lenvermehrung hingewiesen.

Es ist auch bekannt (K. Le η se, »Katechismus der Brauerei-Praxis«, 1956, S. 229, Abs. 744), in einer Reinzuchtanlage eine Hefe-Zellkultur durch Gärung in einem Nährmedium sich vermehren zu lassen, das gebildete Gemisch aus Jungbier und dünnflüssiger Reinhefe bis auf einen Rest abzulassen und mit dem verbleibenden Rest wieder von neuem Reinhefe zu züchten.

Auch bekiesen bekannten Verfahren werden Zeilkulturen mit einer vollständig regellosen Zellteilung gezüchtet d. h solche Zellkulturen, in denen d_ie Zellen sich auf die verschiedenen Entwicklungsphasen entsprechend dem Gaußschen Wahrsche.nhchkeits-

gesetz verteilen .·,·,',..,

Es sind auch bere.ts d.skontinu.erhche Vertahreh zur Züchtung von ZeI kulturen bekannt, bei denen d.e Erzeugung phasengle.cher Zellen versucht wurde. D.e in dieser Weise hergestellten Kulturen werden im allgemeinen als synchrone oder synchronisierte KuI-türen bezeichnet, je nachdem, ob der herbeigeführte Prozeß als Zwangsbehandlung oder als eine Ausdehnung des normalen Wächstumsvorgangs anzusehen ist.

Bei dem Verfahren der Herstellung von synchronisicrten Kulturen werden auf die Kultur Zwangsbehandlungen angewendet, z. B. breitere Temperaturänderungen, Inhibitorzugaben und Nährstoffentfernungen, die das Zellwachstuin am Ende ihres Entwicklungskreislaufs anhalten; wenn der äußere Zwang von der Zellkultur entfernt wird, tritt eine gleichzeitige plötzliche Zunahme neuer Teilung ein. Dabei wurde gefunden, daß es möglich ist, die Zellen zu einer im wesentlichen in Phase erfolgenden Teilung während der nachfolgenden zwei oder drei Generationen zu veranlassen, bevor wieder eine vollständige Regellosigkeit der Teilung eintritt.

Bei der Methode zur Herstellung synchroner KuI-türen wird die normal gewachsene Kultur durch physikalische Methoden, wie Filtration oder Zentrifugieren. fraktioniert, wobei eine Fraktion kleiner Zellen abgetrennt wird; diese dient als Anfangsbestand oder Besiedlung für synchrones Wachstum. Es wurde gefunden, daß im Verlauf von drei bis fünf. Generationen wieder völlige Regellosigkeit vorliegt.

Bei diesen bekannten Verfahren zur Züchtung sowohI von synchronen als auch von synchronisierten Zellkulluren ergibt sich jedoch wegen der Diskontinuierlichkeit ein äußerst beschränkter Anwendungsbereich, und auch bei der diskontinuierlichen Arbeitsweise selbst ergeben sich beträchtliche Beschränkungen der Untersuchung der Zellen und des Erntens bestimmter Produkte, da ein .synchronisiertes oder synchrones Wachstum nur zeitweilig über eine sehr beschränkte Anzahl von Zellkreisläufen erzielt werden kann. Diese bekannten Arbeitsweisen eignen sich daher weder für eine Untersuchung der Zellen, noch für ein. Ernten der Nebenprodukte des Zellkreislaufs, die auf den Gebieten der Pharmacie, Biologie usw. von großem gewerblichem Interesse sein können.

Aufgabe der Eiliudung ist es daher, ein Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen zu schaffen, deren Zellen während einer praktisch unbegrenzten Zeit weitgehend in der gleichen Entwicklungsphase vorliegen. Das neue Verfahren soll kontinuierlich und 5 ohne nachteilige Einflüsse auf die Reinheit und den phasengleichen Entwicklungszustand der Kultur durchführbar sein. Weiter soll das Verfahren einfach und mit möglichst geringem apparativem Aufwand durchführbar sein; demgemäß soll auch eine einfache, brauchbare und zuverlässig arbeitende Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens angegeben werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur

Züchtung von Zellkulturen, deren Zellen weitgehend in der gleichen Entwicklungsphase vorliegen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

_{a) die ZellkuItur mit} vorherbestimmter Wachstümsgeschwindigkeit in einer solchen Menge eines Nährmediums aufzieht, die nur ausreicht, daß _{dig Ze}„_en ^. _dieser Wachstumsgeschwindigkeit

ao ^ _{ZeIlkreislauf einmal} „,„«.„&„ können?

_{b) die Zc}nkultur zu ihrer Yerdoppelungszeit in zwei gleiche Hälften teilt und

_{c) der Zellkultur vor} der Teilung oder jeder der _{beiden Hä},_{ften sovid weit}eres Nährmedium zu-

25- _{xm daß jede der Häjften de genügend} Nährmedium für eine Vollendung des Zellkreis_{laufs der darin} befindlichen Zellen enthält.

Die Erfindung schafft ein kontinuierliches Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen,' deren Zellen weitgehend in der gleichen Entwicklungsphase vorliegen und für Stoffwechselvorgänge, Extraktion der Zellen oder Gewinnung von Produkten herangezogen

· werden können, ohne nachteilige Beeinflussung der Reinheit oder des phasengleichen Entwicklungszu-

_{ stands der Kultur und unabhängig von der herrschenden Wachstumsgeschwindigkeit. .

Das vorliegende Verfahren beruht auf der Feststellung, daß das Wachstum einer Zelle von ihrer Umgebung gesteuert wird, und die Zellkreislaufcharakteristik für spezifische Bedingungen, die experimentell bestimmt und in dem Verfahren reproduziert werden können, kennzeichnend ist. Es wurde gefunden, daß sich der ZeIlkreislauf mit der Wachstumsgeschwindigkeit ändert und daß eine Zelle keine hinsichtlich der Zeit festliegende Lebensspanne aufweist, wie das bisher häufig im Schrifttum angenommen wurde, und daß weiterhin die Änderungen, die sich aus Abwandlungen des Kreislaufs ergeben, für alle Zellen der Kultur gelten und nicht, wie bisher gemeinhin angenommen wurde, auf einer Änderung des Mengenanteils an aktiven Zellen festliegender Aktivität, d. h. der Lebensspanne in der Kultur, beruhen. Während also bei den bisher bekannten Vcrfahren festgestellt wurde, daß man die Wachstumsrate der Zellen durch das Nährmedium regeln kann, wurde eine reproduzierbare Arbeitsweise für eine vorherbestimmte Regelung nicht gefunden, und die Änderung des Zellkreislaufs mit der Zusammenset-_Zung des Nährmediums wurde nicht als die wesentliehe Stufe für die Regelung der Wachstumsrate erkannt.

Während des Zellkreislaufs, d. h. im Verlauf der Reproduktions- oder Verdoppelungszeit der Zellen.

kann jedoch ein Gang des Stoffwechsels festgestellt werden, der für das Nährmedium. die Wachstumstieschwindigkcit und die Umgehungsbedingungen keiinzeichnend ist. Dies wurde in erster Linie am der

i öl/ /4b

Grundlage empirischer Analysen von intrazellularen Stoffwechselprodukten und Deoxyribonucleinsäure und Ribonucleinsäure und Proteinfraktionen, die in Zeitabständen während des Zellkreislaufs vorgenommen wurden, gefunden. Es wurde festgestellt, daß die anwesende Nährmediummenge, die nach den bisherigen Kenntnissen die Geschwindigkeit des Zellwachstums bestimmt, d. h. die Zeit, die die.Zelle zur Vollendung ihres Kreislaufs und zur Teilung braucht, in Wirklichkeit von den Zellen in einer auf ihren zyklischen Stoffwechsel abgestimmten ganz besonderen Weise verarbeitet wird, nicht aber in konstanter oder gleichbleibender Art, wie das bisher angenommen wurde, und daß eine Zelle für eine bestimmte Verdoppelungszeit eine Einheitsmenge an Nährmedium erfordert, die von der Zelle in eben dieser besonderen Weise verbraucht wird.

Als Zellkulturen können bei dem vorliegenden Verfahren nicht in phasengleichem Zustand befindliche Zellkulturen oder — vorzugsweise — Kulturen, in denen sich die Zellen in jeweils gleicher Entwicklungsphase befinden, verwendet werden. Wenn es sich bei der als Ausgangsmaterial verwendeten Zellkultur um eine nicht phasengleiche Zellkultur handelt, wird durch das Verfahren die Gleichheit der Entwicklungsphase der Kultur verbessert, d. h., die Regellosigkeit der Zellteilung wird verringert und schließlich annähernd beseitigt.

Hierzu wiederholt man gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung die Aufzucht, Teilung und Nährmcdiumzugabe mehrmals.

Gemäß einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Arbeitsweise kann man bei jeder Teilung die weiteren Wiederholungen mit einer Hälfte der Zellkultur durchführen und die andere Hälfte ihren Kreislauf vollenden und zu weiterem Wachstum in einen Nachkrcislauf eintreten lassen. Auf diese Weise wird jeweils eine Hälfte für die Erzeugung weiterer phasengleicher Zellkulturen benutzt, während die jeweils andere Hälfte zur Untersuchung oder Gewinnung von Stoffwechselprodukten dienen kann.

Da sich die Zellen normalerweise in regelloser statistischer Verteilung nach dem Gaußschen Wahrschcinlichkeitsgcsctz teilen,, teilt sich eine überwiegende Menge der Zellen, d. h. mindestens 70 bis 80⁰Ai der Zellen, innerhalb einer sehr kurzen Zeitspanne. Diese mittlere Zeit ist als Verdopplungszeit der Zellkultur anzusehen und ist experimentell steuerbar. Wenn die Zellkultur zu diesem Verdopplungszcitpunkt genau halbiert wird, befinden sich in jeder Hälfte der Zellkultur die gleiche Anzahl an Zellen, wie sie ursprünglich in der Kultur anwesend waren, wobei jedoch die Anzahl an sich langsam teilenden Zellen, die in der ursprünglichen Kultur anwesend waren und die sich zu dem Verdopplungszeitpunkt nicht geteilt hatten, halbiert worden ist. Da jedoch die sich schneller teilenden Zellen vom rein statistischen Gesichtspunkt selbst wieder sowohl langsam als auch schnell teilende Tochterzellen erzeugen, wird die Anzahl an sich langsam teilenden Zellen in irgendeinem besonderen Teil im wesentlichen die gleiche bleiben wie in der ursprünglichen Zellkultur. Durch Teilung der Zellen zum Vcrdopplungszeitpunkt ist es demgemäß möglich, einen gleichbleibenden Zustand aufrechtzuerhalten, wenn es sich bei der ursprünglichen Zellkultur selbst um eine phasengleiche Kultur handelte; wenn es sich bei der ursprünglichen Zellkultur nicht um eine phasengldche Kultur handelte,, steigt die Anzahl an phasengleichen Zellen nach Wachstum bis zur Verdopplungszeit wesentlich, bei wiederholten Teilungen der Zellkultur in dieser Art nimmt die Anreicherung ständig zu, und es wird bald eine phasengleiche Kultur erreicht.

Unter der Voraussetzung einer Teilung des Nährmediums zur Verdopplungszeit und der weiteren Voraussetzung, daß bei der Teilung der Kultur genügend Nährmedium zur Herbeiführung eines weiteren ZeIlkreislaufs zugegeben wird, läßt sich eine Regellosigkeit der Zellteilung im wesentlichen vollständig beseitigen. Da jedoch der Zellkreislauf hinsichtlich der Anzahl an Zellen von der Zusammensetzung des Nährmediums abhängig ist, soll — damit die nachfolgende. Verdopplungszeit mit der ursprünglichen Verdopplungszeit übereinstimmt — die Menge an Nährmedium in jeder Hälfte der geteilten Kultur die gleiche sein "wie die Menge an Nährmedium in der ursprünglichen Kultur vor deren Teilung. Wenn das nicht der Fall ist, ergibt sich ein unterschiedlicher ZcIIkrcislauf mit einer andc-ren Verdopplungszeit, und demgemäß wird ein 'abweichender Stoffwechsel der Zelle eintreten, und es werden sich andere Nebenprodukte aus der Zelle ergeben. '

25- Im einzelnen ist es besonders bequem und praktisch, unmittelbar vor der Verdopplungszeit das Nährmedium zu der Zellkultur vorzugsweise im gleichen Volumen zuzugeben und gleichmäßig mit der Kultur zu vermischen und unmittelbar darauf die Zellkultur in zwei gleiche Volumina zu teilen. Hierdurch gelingt es, in kontinuierlicher Weise eine phascngleichc Zellkultur mit genau den gleichen Eigenschaften und dem gleichen Zellkreislauf wie eine vorhergehend erzeugte Zellkultur herzustellen; diese kann dann für die Untersuchung ihrer Zellen, oder ihrer Produkte, intrazellular und extrazcllular, unzcrstört oder zer-¹ stört, herangezogen werden, so daß die Zellen, Stoffwechsclzwischenprodukte oder Produkte in jedem Kreislauf des Verfahrens immer wieder in einem gewünschten spezifischen Zustand erhalten werden können.

Wenn die Zelle einen Zellkrcislauf durchläuft, erzeugt sie in verschiedenen Stadien des Kreislaufs verschiedene Stoffwechselprodukte. Dabei kann es sich um nur vorübergehende und nachfolgend zu anderen Produkten umgewandelte Stoffwechselprodukte oder um Endprodukte handeln. Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht ein Ernten der gewünschten StofTwechselprodukte aus. der Zellkultur in der maximal möglichen Ausbeute. Der Grund dafür liegt darin, daß in der phasengleichen Zellkultur 70 bis 80% der Zellen dieser Kultur das besondere Stoffwechselprodukt zu ein und derselben Zeit erzeugen, und wenn die Ernte oder Gewinnung zu diesem Zeitpunkt vorgenommen wird, die maximal mögliche Ausbeute anfällt. Im Gegensatz hierzu erzeugt in einer Zellkultur, wie sie nach dem herkömmlichen kontinuierlichen Verfahren erhalten wird und in der regellos Zellen jeder Entwicklungsstufe vorliegen, nur ein kleiner Anteil der Zellen ein bestimmtes StofTwechselprodukt zu irgendeiner gegebenen Zeit, und demgemäß ist eine Gewinnung schwierig oder unmöglich, insbesondere wenn das Stofiwechsclprodukt einer weiteren Umwandlung unterliegt. Weiterhin kann erfindungsi.'cmäß aus jeder Kultur das gleiche SlofTwcchselpnxhikl «eeinlcl werden, da jede erzeugte Folgekultur bei Anwendung gleicher Volumina, an Nälum.cdium genau mit der umhergehenden Kuiiur über-

1 U 1

einstimmt. Andererseits kann gewünschtenfalls auch ein anderes Sloilwechselprodukt aus jeder Kultur gewonnen werden, einfach durch Ernten zu einer anderen Zeit. Um den geeigneten Erntezeitpunkt zu bestimmen, ist es nur notwendig, den Gang der Stoffwechseländerung in dem Zellkreislauf bei einer derartigen phasengleichen Kultur zu analysieren und festzustellen, wann das oder die gewünschten Stoffwechselprodukte erzeugt werden.

nung von Stoffwechselprodukten aus der in Phase befindlichen Zellkultur angestrebt wird, ist die Art des Nährmediums nicht von erstrangiger Bedeutung.

Durch Anwendung einer geeigneten Wachstumsgeschwindigkeit kann ein bestimmter und gewünschter Stoffwechselablauf erreicht werden. Die Änderungen im Verlauf des Zellkreislaufs können in einem vorhergehenden Kreislauf analysiert und dann in der gewünschten Weise bei jedem nachfolgenden Kreis-

Das vorliegende Verfahren ist jedoch auch sehr an- io lauf der gleichen Kreislaufdauer zur Gewinnung von paßbar; es ist möglich, nach Erzeugung einer phasen- Produkten*od. dgl. ausgenutzt werden, entweder bei

gleichen Zellkultur eines ersten Typs, die eine bestimmte Kreislaufzeit und einen bestimmten Stoffwechselgang aufweist, eine andere abweichende phasengleiche Zellkultur herzustellen, einfach durch Änderung der Zusammensetzung des Nährmediums oder der Zeitabslände zwischen den Nährmediumzugaben oder durch Änderung der Bruttemperalur der Kultur. Hierdurch kann man leicht andere Stoffwechselpiodukte und andere Zellen zur Untersuchung und Gewinnung erzeugen.

Das neue Verfahren ist anwendbar auf die Herstellung von wertvollen Chemikalien und Biochcmikalien sowie auf die Herstellung von natürlichen Vercinem bestimmten Punkt im Kreisprozeß aller nachfolgenden Kreisläufe oder an unterschiedlichen Punkten bei den nachfolgenden Kreisläufen. Weiterhin ist es möglich, durch Änderungen der Wachstumsgeschwindigkeit den Gang im Kreisprozeß zu ändern, so daß nach einem Zeitraum der Durchführung eines bestimmten Kreisprozesses gewünschtenfalls eine andere W.achstumsgeschwindigkeit und damit ein ande-

ao rcr Kreisprozeß herbeigeführt werden kann.

Durch Vornahme von Änderungen in dem Nährmedium oder durch Anwendung anderer Nährmedien können weitere Änderunge'n herbeigeführt werden, oder der Kreislauf kann durch TempcraUiränderun-

bindungen, z. B. Enzymen und komplexen Stoffen, 25- gen abgewandelt werden.

wie sie beispielsweise als Zwischenprodukte während Es ist bereits eine Vorrichtung für die Durchfüh

rung eines Verfahrens zur Züchtung von Zellkulturen bekannt (Canadian Journal of Microbiology, Bd. 9 [1963J₅ S. 671 bis 687), die ein geschlossenes Aufzuchtgefäß zur Aufnahme einer Zellkultur aufweist, bestehend aus einer Zyklonkolonnc, einem Umwälzbogen und einer Umwälzpumpe, mit einer Einrichtung zum Konstanthalten der Zcllkulturtcmperatiir, mit einer eine Pumpe mit regelbarer Fördermenge/ Zeit umfassenden Nährmediumzuführungseinrichtung, sowie mit einer Auslaßeinriclitung für die mit Nährmedium gemischte Zellkultur in ein Sammelgcfäß.
Die Erfindung schafft eine Vorrichtung dieser Art

des Zellwachstums erzeugt werden, z. B. datcnübcrnüttelnde Ribonucleinsäure; diese können für chemo-' therapeutische, prophylaktische, Herstellungs- oder Weiterverarbeitungszwecke und andere Anwendungen eingesetzt werden. Dabei handelt es sich vielfach um Materialien, die bisher übciliaupt nicht erkannt oder vernachlässigt wurden oder die bei den hohen Verdünnungen, in denen sie bei Anwendung herkömmlicher Methoden zum Aufziehen der Zellen vorkommen, nicht zu gewinnen waren. Das vorliegende Verfahren kann in jedem gewünschten Maßstab innerhalb der technologischen Gesichtspunkte, die normalerweise für das Aufziehen von Mikro

organismen und Zellen gelten, durchgeführt werden. 40 zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens, wel-

Die neue Arbeitsweise ist anwendbar auf Kulturen jeglicher frei lebenden Zellen, seien dies Mikroorganismen oder Gewebezcllen. Als Beispiele typischer ZellkuUurcn seien jene von Hefen, z. B. S. cerevisicae, S. rouxii, S. magnoliac, Bakterien, z. B. Strep, bovis, A. acrogenes, A. suboxydans, Pseudomonad sp. und anderen, wie Strcptomyces venezuleae und insbesondere Candida utilis sowie Pflanzenzellen und tierische Zellen genannt.

Zur Erhöhung der phasengleichen Anzahl an ZeI-lcn in der Zellkultur können, um beispielsweise 90 bis K)O⁰Zo der Zellen in gleicher Entwicklungsstufe zu haben, die bekannten Arbeitsmaßnahmen, die bei diskontinuierlichen Verfahren zur Züchtung von synchronen oder synchronisierten Kulturen angewendet worden sind, z. B. Temperaturünderimgcn und Inhibilorzugaben, auf die phasengleiche Kultur zu der Verdopplungszeit angewendet werden; hierdurch wird die Verdopplungszeit verlängert, und es können sich mehr Zellen teilen, während das weitere Wachstum der geteilten Zellen aufgehalten wird.

Bei dem Nährmedium kann ei; sich um ein chemisch Undefiniertes Nährmedium handeln, vorzugsweise wird jedoch ein chemisch definiertes Nährmedium verwendet. Wenn es erwünscht ist, die Zellen G5 hinsichtlich ihres Stoffwechsels zu untersuchen, ist es wichtig, die Natur der ursprünglich.anwesenden VerbmdiiMP.cn zu kennen: wenn daiicuen nur die (iewinche gekennzeichnet ist durch ein zwischen die Nährmediumzuführungseinrichtung und das Aufzuchtgefäß geschaltetes Dosiergefäß mit einem automatischen Heber für die Zugabe konstanter Volumina in vorher bestimmten Zeitabständen und einen zwischen die Auslaßeinrichlung und das Aufzuchtgefäß geschalteten automatischen Heber für das Überleiten von mit den zugegebenen Nährmittelvolumina gleichen ZcIlkulturvolumina in das Sammelgefäß.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnungen weiter erläutert; diese zeigen in

F i g. 1 in schematischer Darstellung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

F i g. 2 Diagramme, welche Änderungen (α) der prozentualen Fettsüurczusamincnsetzung und (b) der Gesamtfetlsäurcn einer C. utilis-Zellkultur wiedergeben, die bei einer Kreislaufzeit von 4 Stunden 15 Minuten in einem Glucosemedium nach dem Verfahren gemäß der Erfindung gezüchtet wurde,

Fig. 3A und 3B Gas-FKissigkeits-Chromato- . gramme von Aminosäuregemischen, die aus der C. utilis-Zellkultur der F i g. 2 bei Krcislaufzeitcn von bzw. 6.5 Stunden extrahiert wurden, und

Fig. 4 Gas-Flüssigkeits-Chromatogramme einer ansonsten wie in den F'ig. 3A und 3B, jedoch in einem (ilyceriiimedium mit einer Kreislaufzeit von 6,5 Stunden aufgezogenen C. utilis-Zellkullur.

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Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung umfaßt im tel 14 des Umwälzbogens Il abfließende Wasser

wesentlichen eine Apparategruppe 1 zur Herstellung durch eine Leitung 31 zu einer Schlange 21 b geleitet,

phasengleicher Entwicklungsstufe, nachstehend zur die in dem Dosiergel'äß 21 angeordnet ist; das Wasser

Vereinfachung als Aufzuchtgefäß bezeichnet, und ein Hießt schließlich aus der Schlange durch eine Lei-

Veraibeitungsgefäß 2. . 5 tung32 ab. Das Dosiergefäß 21 kann genauso ausge-

Das Aufzuchtgefäß 1 besteht aus einer Zyklonko- bildet sein, wie ein auf S. 67¹J der vorgenannten Verlonnc 10 und einem Umwälzbogen 11, der eine öfTentlichung erläuterter Kühler, mit der Ausnahme, Schleife bildet, durch die ein Gemisch aus Zellkultur daß die Rohrschlange in der vorstehend angegebenen und Nährmedium 12 zirkuliert wird; hierdurch wird Weise mit dem Wassermantel 14 und nicht mit einer die Homogenität des Gemisches aufrechterhalten. Die io Kältemittelanlage verbunden ist. Das Dosiergefäß 21 Zirkulation des Gemisches 12 erfolgt durch eine Um- ist ebenfalls mit einem Probenehmer 21α ausgestattet. wälzpumpe 13. Während dieser Zirkulation tritt das Die Verbindungen zwischen dem Kopf der Zyklon-Gemisch 12 in das Rohr der Zyklonkolonne 10 ein kolonne 10 und dem Kondensator 29 können so aus- und Hießt an den Seitenwänden zum Boden herab, gebildet sein, wie das in der vorgenannten Vervon wo es erneut von der Pumpe in der Pfeilrichtung 15 öffentlichung erläutert ist, dasselbe gilt für die in der umgewälzt wird. Eine geeignete Ausbildung von Zy- Vorrichtung angeordneten Probenehmer,
klonkolonne 10, Umwälzbogen 11 und Pumpe 13 ist Dem Dosiergefäß 21 wird aus Nährmediumvorratsauf S. 674 der Veröffentlichung von P. S. S. Dawson gefäßen 33 durch Leitungen 34 und 35 mittels einer in »Canadian Journal of Microbiology«, Bd. 9.(1963), Pumpe 36 ständig Nährmedium zugeführt. Die Leinochausführlicher erläutert. 20 tung 35 enthält einen Durchflußmesser 37 und ein

Die Temperatur des zirkulierenden Gemisches 12 Sterilfilter 38. Die Nähimediumvorratsgefäße 33 um-

wird in dem Aufzuchtgefäß 1 ^mittels eines Wasser- fassen ein Vorratsgefäß 33«, und das Nährmedium

mantels 14, der den Umwälzbogen 11 umgibt, im in diesem Vorratsgefäß wird ständig aus Mediumzu-

wesentlichen konstant gehalten; der Wassermantel - führungsbehältern 33ft und 33c· 'ergänzt. Letztere

wird durch Leitungen 15 und 16 mit einem Gemisch 25 sind durch Heber 33«* miteinander verbunden und

aus heißem und kaltem Wasser gespeist, wobei die stehen über Sterilfilter 33 c mit der Atmosphäre in

geeigneten Mengenverhältnisse an heißem und kaltem Verbindung. Der Durchfließmesser 37, die Pumpe 36

Wasser durch Solenoidventile 17 und 18 geregelt wer- und die Nährmediumvorratsgefäße33 können im ein-

den; letztere werden von einer in dem Umwälzbogen zelnen so ausgebildet sein, wie das in der genannten

11 angeordneten Thermistorsonde 19 über ein Re- 3° Veröffentlichung erläutert ist.

lais 20 betätigt. Die Temperatur des Gemisches 12 im Wenn das Nährmedium in dem Dosierungsgefäß Aufzuchtgefäß 1 wird mittels eines Thermometers Π a 21 eine vorherbestimmte Höhe erreicht, was natürbestimmt, das in dem Umwälzbogen 11 angeordnet lieh durch entsprechende Regelung genau zu dem ist. In dem oberen waagerechten Teil des Umwälz- Verdoppelungszeitpunkt der Zellen in dem Gemisch bogens 11 können eine Anzahl von seitlichen Stutzen 35 12 eintritt, überführt der automatische Heber 22 das zur Aufnahme weiterer Fühler verschiedener Meß- Nährmedium aus dem Dosiergefäß 21 in die Zyklonoder Regelinstrumente, wie pH-Elektroden, oder an- kolonne 10, und das Medium vermischt sich bei der dere Einrichtungen, wie beispielsweise angeordnet Eindosierung mit dem Gemisch 12 in der Kolonne nehmer life'oder eine Impfeinrichtung angeordnet 10. Wenn diese Zugabe (und auch der Mischvorgang) sein. Das Relais 20, die Solenoidventile 17 und 18, 40 abgeschlossen ist, wird die Hälfte des verdünnten das Thermometer Ha, der Probenehmer 11 b und Gernisches 12 aus der Kolonne 10 entweder durch der Thermistor 19 können im einzelnen ebenfalls so einen automatischen Heber 40 in ein Sammelgefäß 39 ausgebildet sein, wie das in der vorgenannten Ver- geleitet, oder es wird eine Klemme 41 in einer Ldöfientlichung beschrieben ist. ' tung 42 von Hand geölfnet, so daß ein gleiches Vo-

Das Aufzuchtgefäß 1 wird zum Verdopplungszeit- 45 lumen zn verdünntem Gemisch 12 zu dem oberen punkt aus einem Dosiergefäß 21 über einen automa- Ende einer Zyklonkolonne 10' des Verarbeitungsgetischen Heber 22, eine Nährmedium-Gaszuführungs- fäßes 2 Hießt. Wohin das Gemisch 12 im einzelnen -leitung 23 und seitliche Zuführungen 24 und 25 der geleitet wird, hängt von dem Phasenzustand des Ge-Zyklonkolonne 10 mit frischem Nährmedium ver- misches 12 in dem Aufzuchtgefäß 1 ab. Wenn das sorgt. Ein Gas, wie Luft oder Stickstoff, wird der 50 Gemisch 12 in dem Aufzuchtgefäß 1 aus einer phasen-Zyklonkolonne 10 aus einer nicht dargestellten Quelle gleichen Kultur gebildet worden ist und der Zweck über eine Leitung 26, die ein Sterilfilter 27 enthält, des Verfahrens darin besteht, Produkte daraus zu gedas Dosiergefäß 21, eine Leitung 28,-die Medium- winnen. wird das Gemisch durch die Leitung 42 in Gaszuführungsleitung 23 und die seitlichen Zufüh- das Verarbeitungsgefäß 2 abgeleitet. Wenn andererrungen 24 und 25 kontinuierlich zugeführt. Das Gas 55 seits das Gemisch 12 in dem Aufzuchtgefäß 1 aus tritt aus der Kolonne 10 durch einen Wasserdampf- nicht in Phase befindlichen Zellen gebildet wurde und kondensator 29 und ein Sterilfilter 30 kontinuierlich die Aufgabe darin besteht, eine phasengleiche Kultur aus. Die Anwesenheit des Kondensators 29 ist, wie zu gewinnen, wird das Gemisch über den Heber 40 in der vorgenannten Veröffentlichung im einzelnen in das Sammelgefäß 39 abgeleitet; das nicht phasendargelegt ist, zweckmäßig, um Kondensationswasser 60 gleiche Produkt hat im Rahmen der Erfindung keine aus dem abfließenden Gas zu entfernen und eine besondere Verwendung. Der Heber 40 ist ebenfalls Kondensatbildung in dem Filter 30 und einen daraus mit einem Probenehmer 40a versehen,
folgenden Rückdruck in die Zykloiikolonne 10 zu Das Verarbeitungsgefäß 2 ist in seiner Ausbildung vermeiden. Der Zufluß und der Abfluß des Gases dem Aufzuchtsgefäß 1 sehr ähnlich und umfaßt eine werden mittels Durchllußmeßeinrichtungen gemessen. 65 Zyklonkolonne 10', einen Umwäl/bogen 1Γ und eine Um das Nährmedium in dem Dosiergefäß 21 und Pumpe 13', welche das Gemisch 12' aus Zellkultur das Gemisch i2 in dem Aufzuchtgefäß 1 bei gleicher und Nährmedunn in der Pieilrichtim» durch den Temperatur zu halten, wird das aus dein Wassernuin- Uimväbbogen und die Kolonne zirkuliert. Der Um-

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wälzbogen 11' ist in ähnlicher Weise mit einem Wassermantel 14' ausgestattet, um die Temperatur des Gemisches 12' zu regeln, wobei der Fluß von heißem und kaltem Wasser durch Leitungen 15' und 16' durch Solenoidventile 17' und 18', welche von einem Thermistor 19' über ein Relais 20' betätigt werden, geregelt wird. Jedoch wird das aus dein Mantel 14' austretende Wasser fortgeleitet. Ein Gas, wie Luft oder Stickstoff, fließt zu dem Gemisch 12' in der Zyklonkolonne 10' aus einer nicht dargestellten Quelle über ein Sterilfilter 27', eine Leitung 23' und seitliche Zuführungen 25'; es tritt aus der Kolonne 10' durch eine Leitung 43 und ein Sterilfilter 30' aus. Der Umwälzbogen 11.' ist genauso ausgebildet wie in dem Aufzuchtgefäß 1 und enthält ein Thermometerllrt' und einen Probenehmer 11//.

Wenn der Gang des Stoffwechsels im Verlauf des Zellkreislaufs untersucht werden soll, werden in gleichmäßigen Abständen Reihenproben zur Analyse aus dem Probenehmer Hb abgezogen.

Wenn das Produkt aus dem Verarbeitungsgefäß 2 geerntet werden soll, wird die Kultur 12' durch Öffnen einer Klemme 44 über eine Leitung 45 in ein Sammelgefäß 46 geleitet, das durch ein. Sterilfilter 47 mit der Atmosphäre verbunden ist. 25"

Wie ersichtlich, ist die Vorrichtung an verschiedenen Stellen mit Probenehmern ausgestattet, so daß von dem Medium oder der Kultur an irgendeiner bestimmten Stelle der Vorrichtung Proben genommen werden können; zusätzlich zu den Probenehmern lib, Hb', 21a und 40« ist ein weiterer Probenehmer 35« in der Leitung 35 vorgesehen.

Zum Betrieb wird die leere Vorrichtung sterilisiert, z. B. durch Dämpfen oder Autoklavenbehandlung; zweckmäßig wird die Vorrichtung hierzu in verschiedene Abschnitte zerlegt. Eine geeignete Autoklavenbehandlung ist in der vorgenannten Veröffffentlichung im einzelnen beschrieben. Die Vorrichtung wird dann zusammengesetzt und das Nährmedium, das zuvor sterilisiert worden ist, zweckmäßig in ahnlicher Weise wie das auf S. 683 der vorgenannten Veröffentlichung erläutert ist, wird bis zu dem Umwälzvolumen in die Zyklonkolonne 10 eingeführt.

Ein Impfmaterial wird hergestellt, indem man einen geeigneten Kulturansatz wachsen läßt, bis die exponentiell Wachstumsphase erreicht ist. Die Zellkultur wird dann in das zirkulierende Medium eingeimpft, zweckmüßig nach einer der verschiedenen aseptischen Methoden, wie sie auf S. 684 der vorgenannten Veröffentlichung angegeben sind. ■

Der Nährmediumfluß von der Mediumquelle 33 zu .dem Dosiergefäß 21 wird dann begonnen; die Fließrate, d. h. die pro Zeit zufließende Menge, bestimmt die Ver'doppelungszeit des Verfahrens. Es wird willkürlich eine Vcrdoppelungszeit gewählt, beispielsweise 6 Stunden, und der Mediumfluß durch die Leitungen 34 und 35 zu dem Dosiergefäß 21 wird dann so geregelt, daß nach jeweils 6 Stunden das Nährmedium in dem Qosiergefäß 21 automatisch mittels des Hebers 22 in die.Zyklonkolonne 10 entleert wird. Die Zellkultur in dem Gemisch 12 nimmt dann eine Wachstumsgeschwindigkeit in Übereinstimmung mit dieser Verdoppelungszeit an, so daß , sich zum Zeitpunkt der Zudosierung des Nährmediums die Hauptmenge der Zellen in dem Gemisch 12 bei ihrer Verdoppelungszeit befindet. Praktisch sofort nach Vollendung der Zudosierung von frischem Nährmedium in die Zyklonkolonne 10 wird der automatische Heber 40 betätigt, und ein Volumen des Gemisches 12, das dem Volumen des in die Zyklonkolonne eindosierten Nährmediums gleich ist, wird zu dem Sammelgefäß 3? geleitet. Nach wiederholtem Zudosieren in die Zyklonkolonne 10 und wiederholtem Abziehen von gleichen Volumina Gemisch, und zwar alle 6 Stunden, erreichen die Zellen in dem Gemisch 12 einen phasengleichen Zustand. Dies erfordert im allgemeinen einen Zeitraum von einigen Tagen. Wenn es erwünscht ist, die Zellen in dem Gemisch 12 in einer anderen' Geschwindigkeit wachsen zu lassen, so wird hierzu die Fließrate des Nährmediums aus den Nährmediumvorratsgefäßen 33 zu dem Dosiergefäß 21 geändert, so daß sich eine neue willkürlich gewählte Verdoppelungszeit ergibt, beispielsweise 4,5 Stunden, und der Arbeitskreislauf aus Dosierung der Zyklonkolonne 10 und Abzug gleicher Volumina an. Gemisch 12 in-das Sammelgefäß 39 wird fortgesetzt, bis die Zellen in dem Gemisch 12 wieder ihr phasengleiches Wachstum erreicht haben. ": .

Wenn es sich bei der anfänglichen Zellkultur, die in das Nährmedium in der Zyklonkolonne eingeimpft wird, um eine phasengleiche Zellkultur handelt oder wenn die Zellen in dem Gemisch 12 ein phasengleiches Wachstum erreicht haben, kann das periodisch aus der Zyklonkolonne 10 abgezogene Gemisch für weitere Arbeitsmaßnahmen verwendet werden, z. B. Ernte und Gewinnung besonderer Stoffwechselprodukte und/oder Untersuchung der Zellen und ihrer Produkte. Hierzu wird das Gemisch 12 aus dem Umwälzbogen 11 durch Öffnen der Klemme 41 über die Leitung 42 zu dem Verarbeitungsgefäß 2 abgezogen, wo das Gemisch 12' mittels der Pumpe 13' durch den Umwälzbogen 1Γ und die Zyklonkolonne 10' zirkuliert wird; zu verschiedenen Zeitpunkten während dieser Zirkulation können Proben aus dem Probenehmer lift' abgezogen und untersucht werden, beispielsweise hinsichtlich des Stoffwechsels der Zellen und der hierdurch erzeugten Stoffwechselprodukte. Wenn ein besonderes Stolfwechselprodukt geerntat und gewonnen werden soll, wird der genaue Zeitpunkt der Erzeugung dieses Stoffwechselprodukts in einem früheren Kreislauf bestimmt, und zu diesem Zeitpunkt wird das zirkulierende Gemisch 12' durch Öffnen der Klemme 44 über die Leitung 45 in das Sammelgefäß 46 abgeleitet.

In dem Aufzuchtgefäß 1 werden Ablesungen und Aufzeichnungen von der Temperatur des Mediums in dem Dosiergefäß und von der Kultur sowie der Dosierungs- und Verdoppelungszeit und von den Arbeitsvolumina an Nährmedium und Gemisch 12 in der Vorrichtung gemacht. Weiterhin werden zweckmäßig die optische Dichte und der pH-Wert des Gemisches 12 unmittelbar vor und nach dem Dosieren bestimmt, um die Arbeitsweise der Vorrichtung zu überwachen.

Im Verarbeitungsgefäß 2 der Vorrichtung werden Proben der Kultur in Zeitabständen über den Kreislauf gesammelt und geeignete Analysen dieser Proben vorgenommen; gewöhnlich wird die Photomikrographie zur Aufzeichnung der Eigenschaften des Wachstumsvorgangs herangezogen. Das Gemisch 12' muß vor dem Ende des Zellkreislaufs aus dem Verarbeitungsgefäß abgezogen werden, da zu diesem Zeitpunkt frisches Gemisch 12' aus dem Aufzuchtgefäß 1 in das Verarbeitungsgefäß 2 geleitet wird.

Die Erfindung wird an Hand des nachstehenden Beispiels weiter veranschaulicht.

13 14

' BeiSDiel 77 ml/Sld., und eine unmittelbar darauffolgende Ent-

■ .. . fernung von 500 ml verdünnter Kultur aus der Zy-

I. Herstellung einer phasengleichcn Kultur klonkolonne 10 in das Sammelgefäß 39 sicher. Diese

Eine Vorrichtung gemäß F i g. 1 mit einem Arbeits- Betriebsweise wurde 4 Tage lang fortgesetzt. Der fassungsraum von 500 ml wurde in der beschriebenen 5 achtzehnte Ausfluß aus der Zyklonkolonne 10 wurde Weise zusammengestellt und sterilisiert. Die Vor- durch Handbetätigung der Klemme 41 in der Auslaßrichtung wurde benutzt, um Candida utilis Art Y. 900 leitung 42 zu dem Verarbeitungsgefäß 2 geleitet, wein phascngleicher Kultur bei 28° C auf einem ein- bei wiederum 500 ml der Kultur entfernt wurden, so fachen chemisch definierten Medium der nachstehen- daß ebenfalls 500 ml der Kultur weiter in dem Aufden Zusammensetzung aufzuziehen: 10 zuchtgefäß 1 zirkulierten. Der neunzehnte, zwanzigste V '. ■■'.......... -ion ^un<* ^e'^nundzwanzigsle Ausfluß aus dem Aufzucht-¹

Glucose 30,0 g _gefäß j _wurcj_en danach durch automalischen Abzug

MgSO₄ · 7 H₂O 0,5 g _{miUels des Hcbers} 40 _{in das} Sammelgefäß 39 abge-

'■ vHPn'■"""" ····'· 5^r⁵S führt; dasselbe gilt für alle nachfolgenden Entnahmen,

J^ri?^ Q⁴ _n ''■ in *5 ausgenommen jene, die zur Analyse oder zur Ver-

if/· V^{2 4} 1» " ' " Λ f arbeilung durch Handbetätigung der Klemme 41 zum

.- Winzlersalzlosung 10 ml Zeitpunkt 'der Vollendung - der Eindosicrung von

destilliertes Wasser 1 Liter Medium in das Aufzuchtgefäß 1 entfernt wurden. Die

Die Winzlersalzlosung enthielt je Liter: 10 ng zweiündzwanzigstc, sechsundzwänzigste und dreißigste

H₃PO₃; 10 ng ZnSO₄; 10 [ig MnGl₂; 5 ng FeCl₃; _ao Ernte,, und danach andere im Bedarfsfall, wurden

1 ng CuSO₄ · 5 H₂O; 1 ng KJ. Bei einigen Verfall- einzeln wie oben die achtzehnte Ernte zur Analyse

rensdurchführungen enthielt das Nährmedium 30,0 g in das Verarbeilungsgefäß 2 übergeführt.

Glycerin an Stelle der Glucose. Die durch die Leitung 42 in das Verarbcitungs-

500 ml eincsauf dem vorstehenden Medium wach-_ gefäß 2 geleitete 500-ml-Kiillur wurde dort unter den senden Kulturansatzcs von Cadida utilis Rasse Y. 900 ₂₅ gleichen Bedingungen wie in dem Aufzuchlgefäß 1 (N.R.R.L. Y.900) wurden erhallen durch Vereinigen weiter wachsen gelassen. Hierzu wurde die Kultur von 5· lOO-ml-SchüUelkolbenkülturen von 18 Stunden in der Kolonne 10' und dem Umwälzbogen 1Γ mit Inkubation bei 28° C und aseptische Einführung als der gleichen Geschwindigkeit (6 Lilcr/Min.) mittels Impfmaterial in das Aufzuchtgefäß 1 der Vorrichtung. der Pumpe 13' umgewälzt und mittels des Wasser-Alternativ wurden 500 ml Impfmaterial direkt in _3O mantels14' bei der gleichen Temperatur von 28''C einem Chemostat hergestellt (s. »Canadian Journal öl" gehalten; es wurde die gleiche Luftströmung (500 ml/ Microbiology«, Bd. 9 [1963], S. 671 bis 687), indem Min.) angewendet, dieseLuft trat durch das Filter 27' Candida utilis Rasse Y.900 auf dem gleichen Medium ein und floß durch das Auslaßlilter 30' ab. In rcgclbei 28'■' C und unter Anwendung einer Aufenthalts- mäßigen Zeitabständen während des Kreislaufs, (d. ii. zeit von 6 Stunden wachsen gelassen wurde. In jedem ₃₅ der Zeitspanne zwischen den Dosierungszcilen) wur^ Falle wurde nach der Impfung sofort die Zirkulation den Proben der zirkulierenden Kultur aus dem Probeder Kultur in der Zyklonkolonnc 10 und dem Um- nehmer 11 b' für Analysen, wie sie nachstehend bcwälzbogen 11 mittels der Umwälzpumpe 13 aufgc- schrieben werden, abgezogen. Nach Vollendung des nommen. Die Temperatur der zirkulierenden Kultur Kreislaufs wurde das Verarbeilungsgefäß 2 an der wurde mittels des Wassermantels 14 bei 28^r'C ge- 40 Luer-Lok-Vcrbindung 50 in der Leitung 42 zur Aushalten. Die Luftströmung durch die Zyklonkolonne 10 spülung und Reinigung abgetrennt und durch ein wurde mittels eines Durchflußmessers auf 500 ml/Min. neues steriles, leeres Verarbeitungsgefäß 2 ersetzt. Die eingestellt. Die Luft trat durch das Slerilfilter 27 in Kupplung an der Verbindung 50 erfolgte unter ascpdas Aufzuchlgefäß ein und verließ die Anlage durch tischen Bedingungen, das Auslaßfilter 30. ■ 45 Die Betriebsspanne (Kreislaufzeit) war für das

Das Nährmedium, das in der vorstehend beschrie- Aufzuchlgefäß 1 und das Verarbeitungsgcfäß 2 gleich

bencn Weise sterilisiert und in die Mediumvorrats- und entsprach der Zeitspanne zwischen Dosierungen;

gefäße 35,eingefüllt worden war, wurde nun mittels für einen Mediumfluß von 77 ml/St, betrug also bei

der Mediumpumpe 36 in das Dosiergefäß 21 geleitet. einem Volumen der Kultur von 500 ml die Krcislauf-

Die Pumpe arbeitete mit einer Fördermenge von 50 zeit 6,5 Stunden. :·

77ml/Sld.; das Dosiergefäß wurde durch die Schlange Änderungen der Betriebsweise können während des

21Λ bei einer Temperatur von 28° C gehalten. Nach Aufziehens von pliasengleichen Kulturen auf den

6,5 Stunden wurde der nunmehr 500 ml ausmachende bereits beschriebenen Wegen vorgenommen werden,

Nährmcdiuminhalt des Dosiergefäßes 21 durch den und in diesem Beispiel wurden verschiedene,Bctricbs-

automalischcn Heber 22 abgezogen und das Medium 55 weisen untersucht. Zur Herbeiführung dieser Ändc-

in dieser Weise durch die Leitung 23 und die seit- rungcn ist es nur erforderlich, die Mediunmifliißrate

liehen Zuführungen 24 und 25 in die Zyklonkolonne zu dem Dosiergefäß 21 in der gewünschten Weise zu

10 übergeführt. .Dort trat Vermischung mit der zirku- ändern, gefolgt von einer Periode der Anpassung der

licrcnden Kultur ein, wodurch das Volumen auf .Kultur an die neuen Bedingungen. Gewöhnlich wurde

1000 ml zunahm. Nach Abschluß der Zugabe wurde 60 gefunden, daß diese Anpassungsperiode nach zehn *

der automatische Heber 40 des Aufzuchlgcfäßcs 1 in Dosierungen, d. h. zehn Kreisläufen, beendet war.

Betrieb gesetzt, und 500 ml der zirkulierenden Kultur In dem Beispiel wurde nach mehreren Bclriebs-

wurdcn in das Sanimclgcfäß 39 abgehebert. Fort- monaten bei einer Krcislaufdaiicr von 6,5 Stunden,

gesetzter Betrieb der Mediumzuführungspumpe 36 d.h. einem Medienfluß von 77 ml/Sld., eine Ändc-

stelltc eine ständige Wiederholung dieser 500 ml 65 rung auf eine Krcislaufdaiicr von 2 Stunden vorge-

Mediuindosicrung aus dem Dosiergefäß 21 in die nommen, indem der Medienfluß zu dem Dosiergefäß

Zyklonkolonne 10 in gleichmäßigen Zcilabständcn, 21 auf 250 ml/Sld. eingestellt wurde. Die Iktricbs-

d. h. alle 6,5 Stunden bei einer Pumpleislung von Volumina, d.h. 5(K) ml Medium und 500 ml Kultur,

1 ö 17 /40

blieben unverändert. Nach 24 Stunden, d. h. nach zwölf Kreisläufen, wurden von Hand Überleitungen in das Verarbeitungsgefäß 2 zur Analyse der phasengleichen Kulturen vorgenommen. Die Analysen aufeinanderfolgender Kreisläufe zeigten, daß durch Wiederholung eines gleichbleibenden Gangs über den Kreislauf Phasengleichheit erreicht worden war; dies ist aus der nachstehenden Tabelle 11 ersichtlich. Es wurde kontinuierlicher Betrieb bei dieser neuen Rate über mehrere Wochen aufrechterhalten,,bevor weitere Änderungen auf andere Betriebsräten vorgenommen wurden, um phasenglcichcs Wachstum bei anderen Kreislaufzeiten herbeizuführen. Diese Betriebsdurchführungen sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle Γ

Änderungen der Kreislaufzeit — Anpassungsperioden für phasengleiche Kultur

Kreislaufzeit	Mediumfkiß	Stabilisiert nach	(b)
		(a)	Kreisläufe
Stunden	ml/Std.	Stunden	12
2,0	250	24	11
ν 2;5	200	. 24	11
4,2	120	48	11
6,5	77	72	9
8.3	60	72

II. Analysen der phascngleichen Kultur

25 ml der Kultur wurde in aseptischer Weise aus der Kolonne 10 des Aufzuclitgcfäßes 1 mittels des Probenehmers 11 b' abgezogen, und aliquote Teile dieses Materials wurden unmittelbar anschließend für verschiedene Analysen verwendet:

(a) 1 ml wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, und hiermit wurde eine indirekte Bestimmung des Trockengewichts an Zellen durch spcktrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte der Zellsuspension vorgenommen; die Werte wurden in üblicher Weise zu einer Eichkurve in Beziehung gesetzt. Ein mit dieser verdünnten Zellsuspchsion befeuchteter Objektträger wurde zur Bestimmung der Morphologie der Zellen durch Photomikroskopie unter Verwendung eines Zciß-Pholomikroskops benutzt.

Für direkte Zählungen der Zellen unter dem Mikroskop wurden Reihenverdünnungen unter Verwendung von 1 ml in einer Reihe von Rohren mit einem Inhalt von 9 ml destilliertem Wasser vorge_: nommen; diese wurden in der üblichen Weise gezählt, (b) 20 ml Kultur wurden zur Extraktion der Zellen nach Methoden, wie sie nachstehend erläutert sind, benutzt. Weiter wurden in der nachstehend beschriebenen Weise direkte Bestimmungen des Zclltrockengewichts an Hand voii gewaschenen Zellen vorgenommen.

EineAnzahl von Proben, gewöhnlich zwischen acht und zwölf, aber meistens neun oder zehn, wurden im Verlauf eines Kreislaufs analysiert: die Ergebnisse zeigen die Folge von Änderungen im Verlauf des Kreislaufs. Der Wachstumsfortschritl wurde (a) durch Untersuchung des Zcllwachslums im Verlauf des "Kreislaufs und (b) durch Untersuchung der Art der Änderungen in den Zellen im Verlauf des Kreislaufs verfolgt.

a) Das Zellwachslum in der Kultur wurde durch Messungen der Zellmassc (indirekte und direkte Werte für das Trockengewicht an Zellen) im Verlauf des Kreislaufs und durch direkte Zählungen am Anfang und am Ende des Kreislaufs, d. h. von Proben, die unmittelbar nach und unmittelbar vor aufeinanderfolgenden Dosierungen genommen wurden, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, wie aus den nachstehenden Tabellen II, III und IV ersichtlich ist, daß eine Verdoppelung während der Zeitspanne des Kreislaufs stattfindet und daß sich diese bei jedem Kreislauf wiederholt; dies geht sowohl aus der Zunahme der Zellmassc als auch aus der Anzahl an Zellen hervor.

Tabelle II

Zeitlicher Ablauf des phasengleichen Wachstums

Wachstum ausgedrückt als optische dichte in einer Verdünnung 2/25 bei 600 ηψ in 45minutigen Zeilabständen über den Kreislauf; Glucosemedium (N-begrenzt); Krauslaufdauer 6,5 Stunden

Datum	Zeit	Kreis	0	1	2	I	3	'robe	4 ·,	5	6 ■	0,71,	8
		lauf	_.	0,44	0,47	'0,50	0,54	0,65	0,69	0,72	0J6
19/11	8:30	18	0,43	0,45	0,48	0,51	0,55	0,65	0,69	0,72	0,76
20/11	10:30	22	0,44	0,46	0,48	0,52	0,55	0,66	0,68	0,72	0,75
21/11	12:35	26	0,43	0,45	0.47	0,53	0,54	0,66	0,68		0,75
22/11	14:35	30	0"	-..Vt	IV2	2V4	3	33/4 ..	4,5		6
Zeitpunkt (Stunden)

Tabelle III Phasengleiches Wachstum — Änderung des Zelltrockengewichts* im Verlauf des Kreislaufs

2,0 . Kreislaufzeit (Stunden)
3,25 I 6,50 I 3,25

4,25

Beginn des Kreislaufs
Ende des Kreislaufs ..

.0,20 0,39 0,30
0,56

Glucose

0,43
0,82

0,24
0,42

0,33
0,60

Medium

* Wachstum bestimm! a!s optische Dichte'in einer Verdünnung von ¹A.., bei 6(X) nvi.

Glycerin

309 614/21

17 18

T-h»lh IV Kreislaufs traten in verschiedenen Hauptgruppen der

Zellstotrwcchselprodukle Änderungen auf, welche für

Phasengleiches Wachstum - Glycerinmedium ^den Stoffwechsel der Zelle charakteristisch sind. Dies

•-■(4,25 Stunden.Kreislauf) __ waren folgende:

Anzahl an Zellen (0 Ninhydrin-positive Verbindungen (d.h. Amino-

ZU-Beginn des Kreislaufs 234 säuren usw.).

am Ende des Kreislaufs 446 (|j) Verbindungen, die Ultraviolett bei 260 mji ab-

■ sorbieren (d. h. Nucleotide usw.).

Untersuchungen der Änderung des Erscheinungs- io (iü) p-Nitranilin-positive Verbindungen (d.h. pheno-

bildes der Zellen im Verlauf des Kreislaufs zeigten, jisehe Säuren usw.).

daß sich zu jedem Zeitpunkt des Kreislaufs eine (iv) Verbindungen, die mit alkalischem Silbernitrat

überwiegende Menge der Zellen (70 bis 80%) im reagieren (d.h. Zucker und reduzierende Sub-

gleichcn Wachstunisstadium befanden. Dies" ist aus stanzen usw.). .

der Fig. 2 ersichtlich. Bei Durchführung des Vcr- 15 (v) Phosphatverbindungen (d.h. Phosphate usw.). fahrens in einem größeren technischen Maßslab ist

ein phasengleiches Wachstum von 80 bis 90% er- In Fig. .2 sind typische Änderungen, die bei

reicht worden. Festsloffkomponenten während des phasengleichen

Die Verdoppelung des Zellwachstums und die Wachstums auftraten, dargestellt, und zwar an Hand

Änderungen der Morphologie der Zellen wurden in 20 der Änderungen, die bezüglich der Gesamtfettsäuren

Beziehung gebracht zu dem Stoffwechsel im Verlauf und der Änderung der prozentualen Fettsäurezusam-

des Kreislaufs, und zwar durch Anwendung verschie- menselzung, bestimmt durch Gas-Flüssigkeits-Chro-

dener chemischer Analysen der Zellen, die zu ver- matographie, beobachtet wurden,

schiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Kreislaufs- 2. Änderungen des Stoffwechsels in Abhängigkeit

vorgenommen wurden. 25 von der Wachstumsgeschwindigkeit: Diese wurden

b) Insbesondere wurden folgende Untersuchungen ermittelt durch quantitative Gas-Flüssigkeits-Chrovorgenommen: Deoxyribonucleinsäure (DNA), Ribo- matographie der Aminosäuregemische, die aus den maleinsäure (RNA) und Protein — als Kenngrößen Zellen von phasengleichen Kulturen extrahiert wurmakromolekularer Bestandteile; Aminosäuren, Nu- den, welche bei unterschiedlichen Kreislaufzeilen cleotide (als Materialien, die bei 260 ηΐμ absorbieren), 30 wuchsen. Die Fig. 3 A und 3 B zeigen von oben nach Fettstoffe (lipids) und andere Substanzen — als Stoff- unten die erzielten Ergebnisse bei Anwendung von Wechselzwischenprodukte. Die Stoffe der letztgenann- Zellen, die in regelmäßige*!! Zeitabständen (d.h. ten Klasse, die Verbindungen geringerer Molekular- 30 Minuten bzw. 90 Minuten) von phasengleichen größe umfassen und aus dem weiten Bereich des Kulturen geerntet wurden, welche auf dem gleichen Zellstoffwechsels herrühren, wurden als emplind- 35 Medium unter übereinstimmenden Wachstumsbedinlicherc Indikatoren der StoH'wechseländerung gewählt, gungen aber bei verschiedenen Wachstumsgeschwin- und sie wurden, da sie Analysen leichler zugänglich digkeiten (d. h. 2 bzw. 6,5 Stunden) wuchsen. In der sind, intensiver uniersucht. Die Komponenten wurden Zeichnung sind die Chromatogramme der Analysen nach herkömmlichen Arbeitsweisen auf der Grund- angegeben; die Flächen unter den entsprechenden lage von Papier-, Dünnschicht- und Gas-Flüssigkcits- 40 Spitzen stellen ein quantitatives Maß für die von den Chromatographie bestimmt, und zwar nach Extrak- Spitzen gekennzeichneten verschiedenen Komponention aus den.Zellen durch Lösungsmittelextraktion ten dar. Es traten qualitative und quantitative Än- und Membranfiltration. derungen in den Gemischen ein, die bei den beiden

Da die Zellen auf einem chemisch definierten · Kulturen unterschiedlich waren.

Medium aufgezogen wurden, das keine von Glucose 45 3. Änderungen des Stoffwechsels bei unterschied- oder Glycerin verschiedenen vorgebildeten organi- liehen Medien: Diese wurden ebenfalls durch quantischen Substrate enthielt, handelte es sich bei allen tative Gas-Flüssigkeits-Chromatographie der Aminoaus den Zellen ausgezogenen Stoifwechselkomponen- säuren bestimmt, die aus phasengleichen Kulturen ten um echte Stoffwechselprodukte der Zelle und extrahiert wurden, welche mit der gleichen Wachsnicht um irgendwelche Produkte, die durch Transport 50 tumsgeschwindigkeil und übereinstimmenden Bedin- und Durchdringung von extrazellulären Komponen- gungen, aber auf unterschiedlichen Medien wuchsen, ten in der Zelle konzentriert worden sind. Fig. 4 zeigt von oben nach unten die Chromato-

Nachstehend sind die unter Anwendung dieser gramme, die von Proben erhalten wurden, welche in Methoden erzielten Ergebnisse, welche für das Bei- 90minutigen Abständen entnommen wurden; es hanspiel von Bedeutung sind, zusammengefaßt: 55 delt sich um Reihenextrakte von Zellen, .die in

phasengleicher Kultur mit einer Kreislaufzeit von

Ergebnisse 6,5 Stunden in einem Medium aufgezogen wurden,

in dem die. Glucose durch Glycerin ersetzt worden

1. Änderung der Stoffwechselprodukte während war (auf Basis gleichen Kohlenstoffgehalts); im

des Zellkreislaufs, d. h. der Kreislaufspanne einer 60 übrigen stimmten jedoch die Wachstumsbedingungen

phasengleichen Kultur oder der Spanne zwischen völlig mit denen überein, die für die Versuche gemäß

Dosierungen in dem Aufzuchtgefäß 1: den Fig. 3 A und 3 B Anwendung fanden. Ein Ver-

Bei phasengleichem Wachsen von C. utilis auf dem gleich der analogen Fig. 3 B und 4 zeigt, daß quali-

Glucosemedium mit einer Kreislaufzeit von 4 Stunden tative und quantitative Änderungen des~Aminosäure-

15 Minuten und Probenahme in Zeitabständen von 65 gemisches, und demgemäß des Zellstoffwechsels, bei

30 Minuten ergaben sich Extrakte aus den Zellen, die ' unterschiedlichen Medien eintraten.

bei Papierchromatographie nach der zweidimensio- Die Ergebnisse der vorstehenden Ziffern ,1, 2 und 3

nalen Methode fünf Folgen ergaben. Während des zeigen, daß sich der ZellstofTwechsel im Verlauf des

Zellkreislaufs ändert und daß dies von der Wachstumsgeschwindigkeit, der Zusammensetzung des Mediums oder der Umgebung abhängig ist.

Weiter ist aus den quantitativen Gaschromatogrammen der vorstehenden Fig. 3 und 4 ersichtlich, daß sich die verschiedenen Komponenten einer Stoffgruppe im Verlauf des Kreislaufs ändern und große Unterschiede untereinander zeigen.

Diese Änderungen können durch eine systematische und methodische Zusammenstellung der Ergebnisse von Reihenanaiysen während des Kreislaufs erfaßt werden, so daß Punkte optimaler Ausbeute (beispielsweise in bezug auf die im Kreislauf verstrichene Zeitspanne) für die nachfolgende Benutzung beim Ernten spezifischer Produkte ermittelt und zusammengestellt werden können.

Eine oberflächliche Prüfung der Fig. 3 B zeigt beispielsweise, daß Alanin aus dem Aminosäuregemisch von Zellen, die. sich in phasengleichem Wachstum unter den Bedingungen dieser Ausführungsform des Verfahrens befinden, zu dem Zeitpunkt, der der zweiten Probe "von oben entspricht, d. h. 90 Minuten nach der Dosierung, in maximaler Ausbeute geerntet werden kann. -

._;i Tabelle V .... ■ ' ^: V

Ergebnisse von phasengleichem Wachstum; Glyceriiimedium; Kreislauf 4,25 Stunden

	30	Zeitpunkt im Kreislauf, Minuten	90	120	150	180	210
0	0,36	60	0,41	0,45	0,43	- 0,50	0,53
0,33	2,10	0,39	2,50	2,75	3,00	•3,14	3,80
1,88	49,0	2,38	32,0	32,0	39,0	53,5	58,-5
75,5	0,09	46,0	0,11	0,17	.0,15	0,20.	0,16
0,09	-0,10

240 I 255

Optische Dichte (2/25) bei 600 ηημ .. :.

Trockengewicht, mg/ml

ges. Amino-Ninhydrin, °/₀ Durchlässigkeit UV 260 πιμ — Optische Dichte 1-ml-Zelle..

Optische Dichte (2/25) bei 600 πΐμ.

SW ....

ges. Amino-Ninhydrin als % T bei 570 ιτιμ. SW

RNA (Orcinol) als °/₀ T 670/380 πιμ.

SW.J....

DNA (Diphenylamin) als % T 600 πιμ SW ...-' .,..

Protein (Folin) mg/ml

* Wert als ein Drittel Siedewasserkonzentration. SW: Siedewasserextraktionsmethode. FT: Einfrier-Auftaü-Extraktionsmethode..

0,57.1 3,60 j

68,5 1 0,10

Zeitpunkt im Kreislauf, Minuten

50 I 100 ! · . 150

200

0,33 .0,33

69

47 '

38/66 45/66

4.3 66

0,78 0,39
0,39

36 '■■'
39

4/66
31/60

48
59 ,

*0,98

0,44
. Ο-⁴⁴

34
23

19/42
15/45

64
62

1,02

0,49 0,49

42" 25

23/50 10/38

60 61

1,37

0,54 . 0,54

·■■ 25. ' .35

■·■ 50/73 ■ · 54/76

... 64

2,00

Wenngleich Amiriosäüregemische vorstehend als Beispiele herangezogen wurden, . gilt dasselbe für andere Stoffgruppen. Dies geht aus der Tabelle V hervor. Die Tabelle V zeigt die Ergebnisse, die bei Anwendung des vorstehend angegebenen Glycerinmediums mit der C. utilis-Zellkultur bei einer Kreislaufzeit von 4 Stunden und 15 Minuten erhalten wurden. Die in der Tabelle V angegebenen empirischen Gesamtwerte von verschiedenen Zellbestandteilen zeigen quantitative Änderungen, weiche die qualitativen Änderungen widerspiegeln. In dem nachstehenden Abschnitt 4 ist als weiteres Beispiel, das sich auf Nucleotidbestandteile bezieht, gezeigt, wie die Gewinnung oder Ernte spezifischer Produkte erreicht werden kann. ... _:.. \

4. In dem vorstehend angegebenen Nährmedium wurden die 30 g/l Glucose durch 30 g/l Glycerin ersetzt; Zellen von einer phasengleichen Kultur (4 Stunden 15 Minuten Kreislauf zeit) wurden bei 0" C mit 1,5 n-Perchlorsäure extrahiert, nachdem sie kalt.mit -destilliertem Wasser gewaschen und ihre Fettstoffe durch Isopropanol entfernt worden waren. Das Filtral wurde in eine Dowex-50-Säule eingeführt, die nach der Methode von Schlenk und. DePalma, J. Biol.

Chem., 229, S. 1037, 1051 (1957), > bereitet worden war. Nach Eluierung der Nucleotide mit In · H₂SO₄ wurde gewaschen, bis der Ausfluß keine nennenswerte Ablesung bei 256 ηΐμ. ergab. Die nachfolgende Chromatographie, der Extrakte, unter; Anwendung eines

Lösungsmittelsystems aus Äthanol, Wasser und Essigsäure (Volumenverhältnis; 65 : 32.: 1) ergab, eine Stelle von Rf 3^2, sichtbar, mit Ultraviolettlicht bei,260 mu - und mit Ninhydrin. Offensichtlich handelte es sich um die Verbindung, die von Schlenk und DePalma als S-Adenosylmethionin identifiziert worden war; aus den in der Tabelle VI angegebenen Weiten geht hervor, daß sie kurz nach der Mitte· des Kreislaufs in maximaler Menge vorlag. .:

21 22

Tabelle VI
Phasengleiches Wachstum — Gehalt an S-Adenosylmethionin

Zeitpunkt im Kreislauf, Minuten 0 I 30 I 60 I 90 1 120 i 150 180 I 210 j 240 i 255

Optische Dichte (2/25), 600 ηψ .......

1 n-H₂SO₄ Eluat, optische Dichte 256 ηιμ* ..
In-H₂SO₄ Waschflüssigkeit, optische Dichte

256 ΐημ

On-H₂SO₄ Eluat, 256 ΐημ**

*) Nucleotidfraktion.
**) S-Adenosylmethionin-Fraktion.

0,35
0,09

0,02
0,08

0,43
0,10

0,02
0,10

0,46
0,11

0,01
0,11

0,48
0,17

0,01
0.12

0,51
0,15

0,01
0,15

0,54
0,21

0,58
0,16

0,01 1 0,02
0,12 ! 0,08

0,63
0,11

0,01
0,08

III. Unterschiede und Beziehungen zwischen
regellosen und phasengleichen Kulturen

Es ist von Bedeutung und zeigt die erfindungsgemäß erzielten Vorteile besonders deutlich, wenn man die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung mit den phasengleichen Kulturen erzielten Ergebnisse mit den Ergebnissen vergleicht, die bei entsprechen-_ den, nach den herkömmlichen kontinuierlichen Arbeitswcisen erzeugten Kulturen, d. h. Kulturen der gleichen Wachstumsgcschwindigkeit, aber regelloser Besiedlung von Zellen sämtlicher Entwicklungsstadien, erhalten werden.

Bei den phasengleichen Kulturen ergeben eindimcnsionale Papicrchromatogramme der Aminosäuren (oder anderer Stoffgruppen) im Verlauf des Kreislaufs einen Gang der Spektrumsänderung, der sieb in jedem Kreislauf wiederholt. Wenn man jedoch die Extraktreihen eines Kreislaufs vereinigt, erhält man eine Mittelung oder einen mittleren Bestand über den Kreislauf, der ein gemitteltes Spektrum ergibt, das für diesen Kreislauf charakteristisch ist.

Da eine phascngleiche Zellkultur nur im Verlauf mehrerer Kreisläufe regellos wird, ist die bei Vo₁II-cndung des Verarbeitungskrcislaufes in dem Verarbeitungsteil der Vorrichtung erzeugte Zellkultur noch in einem phasengleichen Zustand, und sie kann daher auch mit den gleichen Vorteilen während eines weiteren Zellkreislaufs, d. h. eines Nachkreislaufs, analysiert und untersucht werden, und es können erwünschte StoiTwcchselprodukte während dieses Nachkrcislaufs geerntet werden. Jedoch ist das Nähr-' -medium am Ende des Verarbeitungskreislaufs hinsichtlich mindestens einem der Nährstoffe, z. B. hinsichtlich der Stickstoff- oder Kohlenstoffquclle, im wesentlichen erschöpft, da die Zellkultur in dem Verarbcitungskrcislauf genauso-wie in dem Phasenkreislauf eine Wachstumsgeschwindigkeit angenommen hat, die einem Aufbrauch der Gesamtmenge dieses Nährstoffs entspricht; dies bedeutet gewöhnlich, daß die Zellkultur den Nährstoff, der in der begrenzenden Geringstmenge anwesend ist, ganz aufgebraucht hat. Die Zellkultur, in der sich die Anzahl der Zellen verdoppelt hat und in der die Zellen exponentiell wachsen, befindet sich also am Ende des Verarbeitungskreislaufs in einem verarmten oder ausgelaugten Nährmedium, in dem sie während des Nachkreislaufs sich entwickeln' und wachsen muß. Ein solches weiteres Wachstum oder eine solche Entwicklung der Zellen kann daher nur auf Kosten der nicht erschöpften Nährstoifc, die in dem Nährmediuni zurückgeblieben sind, und der von den Zdlen gebildeten extrazellularen und intrazellularen Reserven erfolgen, und demgemäß wird eine unterschiedliche Art von Wachstum eintreten.. Demgemäß handelt es sictfalso bei dem in den Zellen während der Verarbeitungs- und Aufzuchtkreisläufe auftretenden Stoffwechsel um einen solchen des Wachstums, d.h. des primären Wachstums, während es sich bei dem Stoffwechsel im Nachkreislauf um einen Stoffwechsel der Entwicklung, d. h. eines sekundären Wachstums, handelt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Arbeitsweise wiederholt man demgemäß die Aufzucht, Teilung und Nährmediumzugabc mehrmals, führt bei jeder Teilung die weiteren Wiederholungen mit einer Hälfte der Zellkultur durch und läßt die andere Hälfte ihren Kreislauf vollenden und zu einem weiteren Wachstum in einen Nachkreislauf eintreten.

Bei Anwendung dieser Ausführungsform def Erfindung ist es möglich, die Nachkreislauf-Wachstumsentwicklung der Zellkultur gewerblich auszunutzen und/oder zu untersuchen, und zwar unter Anwendung phascngleichcr Zellen, deren Wachstumsgeschwindigkeil bei einem vorherbestimmten Wert gehalten wurde. Dies ermöglicht eine ganz wesentliche Verbesserung hinsichtlich maximaler Stoffwechselproduktkonzentrationsschwankungcn im Vergleich zu den bekannten Arbeitsmethoden der herkömmlichen satzweisen und kontinuierlichen Verfahren mit regelloser Zellvcrteilung, vermeidet die Notwendigkeit von Temperaturänderungen und äußeren Zwangsmaßnahmen wie Fitlration, Abtrennung, Wiedersuspendierung und ähnlichen Behandlungen. Natürlich können aber gewünschtcnfalls auch derartige zusätzliche Regelgrößen der Regelung durch das Nährmittel über-' lagert werden, um die Konzentration an dem gewünschten Stoffwechselprodukt auf einen Höchstwert zu bringen.

Wie bereits dargelegt wurde, wird das Wachstum der Zellkultur in den Aufzucht- und Verarbeitungs-. krcisläufen in erster Linie durch Begrenzung mindestens eines der anwesenden Nährstoffe, z. B. der Stickstoff- oder Kohlensloffquellc, geregelt, wobei die anderen Nährstoffe in nichtbegrenzenden (überschüssigen) Konzentrationen anwesend sind. Die Menge der nichlerschöpften Nährstoffe in dem Nährmedium zu Beginn des Nachkrcislaufs hängt demgemäß von der Menge dieser Nährstoffe ab, die ursprünglich in dem bei den Phasen- und Verarbeitungskreisläufen verwendeten frischen Nährmedium anwesend waren, und hierdurch wird die in dem Nachkreislauf eintretende Entwicklung gesteuert. Hieraus folgi, daß die Entwicklung der Zeilen in dem Nach-

kreislauf durch die Mengen der nichtbegrenzenden Nährstoffe in dem frischen Nährmedium, das in den Phasen- und Verarbeitungskreisläufen zur Anwendung kommt, in gewissem Maße geregelt werden kann. Es können jedoch auch die Mengen der nichtbegrenzenden Nährstoffe in dem Nährmedium während des Verarbeitungskreislaufs ohne Änderung der Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen in diesem Kreislauf gesteigert werden, indem man weitere Mengen dieser nichtbegrenzenden Nährstoffe zu irgendeinem Zeitpunkt während des Verarbeitungskreislaufs, je nach experimenteller Zweckmäßigkeit, und insbesondere unmittelbar vor dem Beginn des Nachkreislaufs zusetzt. Diese Zugaben können satzweise oder kontinuierlich erfolgen, ganz wie das gewünscht wird. ■-.-■■■

In dieser Weise können systematische Änderungen der Mengen der nicht begrenzenden Nährstoffe in dem Nährmedium vorgenommen werden, während die Menge des begrenzenden Nährstoffs als der bestimmende Faktor, der das Wachstum der Zellen während ihres primären Wachsens in den Aufzucht- und Verarbeitungskreisläufen steuert, konstant gehalten wird. Beispielsweise kann die Menge der Stickstoffquelle in dem Nährmedium bei einem kohlenstoffbegrenzten Wachstum geändert werden, oder umgekehrt. Auf diesem Wege können Änderungen oder Abwandlungen der Entwicklung der Zellen in der Kultur in dem Nachkreislauf, der einem konstanten primären Wachstumszyklus folgt, vorgenommen werden. Dabei können jedoch dem Nachkreislauf nach Wunsch auch

andere systematische Änderungen oder Zwangseinflüsse überlagert werden, z. B. eine Temperaturänderung. Außerdem können wiederum Änderungen des primären Wachstums in den Aufzucht- und Verarbeitungskreisläufen vorgenommen werden, beispielsweise durch Änderung der Verdoppelungszeit, Wahl anderer wachstumsbegrenzender Faktoren oder Änderung physikalischer Bestimmungsgrößen, wie der Temperatur, so daß eine Änderung der Entwicklung der

ίο Zellen in dem Nachkreislauf bei Zellen verfolgt und ausgenutzt werden kann, die bei unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten und unterschiedlichen Umgebungsbedingungen gewachsen sind.

Die Ausführungsform der Erfindung mit einer Nachkreislaufentwicklung ist besonders vorteilhaft anwendbar auf das Ernten und die Gewinnung von Stoffwechselprodukten aus Zellkulturen, welche die gewünschten Stoffwechselprodukte nur im sekundären -Wachstum, d.h. in > dem auf das primäre Wachstum folgenden Nachkreislauf, erzeugen. So ist beispielsweise bei der Erzeugung von Penicillin in einer Satzkultur das Penicillin ein sekundäres Stoffwechselprodukt, das in der stationären Stufe erzeugt wird, die dem primären Wachstum folgt. Bei dem phasen-

25- gleichen Kulturverfahren gemäß der Erfindung kann dieses Stoffwechselprodukt in dem Nachkreislauf zum experimentell bestimmten optimalen Zeitpunkt geerntet werden, und infolge des phasengleichen Wachstums der Zellkultur wird eine weit höhere Ausbeute erhalten als bei dem satzweisen Kulturverfahren mit regellosem Zellwachstum.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

309 614/21

Claims (1)

i O I I I Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen, deren Zellen weitgehend in der gleichen Hntwicklungsphase vorliegen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Zellkultur mit vorherbestimmter Wachstumsgeschwindigkeit in einer solchen Menge eines Nühnnediums aufzieht, die nur ausreicht, daß die Zellen bei dieser Wachstumsgeschwindigkeit ihren Zcllkreislauf einmal vollenden können,

b) die Zellkultur zu ihrer Verdoppelungszeit in zwei gleiche Hälften teilt und

c) der Zellkultur vor der Teilung oder jeder der beiden Hälften so viel weiteres Nährmcdium zusetzt, daß jede der Hälften gerade genügend Nährmedium für eine Vollendung des Zellkreislaufs der darin befindlichen Zellen enthält.