WO2003029444A2 - Verfahren und vorrichtung zur gewinnung von sekundären pflanzeninhaltsstoffen - Google Patents

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WO2003029444A2
WO2003029444A2 PCT/EP2002/010850 EP0210850W WO03029444A2 WO 2003029444 A2 WO2003029444 A2 WO 2003029444A2 EP 0210850 W EP0210850 W EP 0210850W WO 03029444 A2 WO03029444 A2 WO 03029444A2
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secondary metabolites
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Eckhart Wildi
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Rootec Gesellschaft Für Bioaktive Wirkstoffe mbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining secondary plant constituents and an apparatus for carrying out the method.
  • Plant organ cultures (transformed root hair (hairy root), root or shoot cultures (shooty teratomas)) must be strictly distinguished from the plant (or animal) cell and tissue cultures (predominantly cell suspensions, callus cultures). So far, cell suspension cultures consisting of undifferentiated single cells or cell aggregates have mainly been used for the fermentation. However, it has been found that cell suspension cultures are often genetically unstable, which has a serious influence on the production of active substances. Even promising high-performance cell lines can therefore be found after a few Cyclic fluctuations in the production of the metabolic products may be subject, or the production of these products can also be completely prevented.
  • Vegetable organ cultures and above all the commercially interesting transformed root cultures, form from differentiated tissue, which proves to be genetically significantly more stable than cell suspension cultures even in long-term cultures. Thanks to the rapid growth of transformed root cultures, which often have comparable growth rates to cell suspension cultures, these organ cultures are particularly suitable for the fermentative production of commercially interesting ingredients. Above all, unlike cell suspension cultures, transformed root cultures can be cultivated without growth regulators. Avoiding the use of growth regulators is advantageous because they can inhibit the biosynthesis of secondary metabolites. For the cultivation of tissues it is necessary to regularly supply the cells with the minerals necessary for the nutrition of the cells, possibly growth regulators, carbon sources (normally sucrose, fructose or glucose), such as possibly gases such as oxygen or carbon dioxide.
  • carbon sources normally sucrose, fructose or glucose
  • the simplest and most economical form of culturing cells is the suspension culture mentioned above, where isolated cells are suspended in a nutrient liquid, used nutritional components are regularly added to the nutrient solution and fumigation is carried out to maintain the suspension and nutrition of the cells if necessary.
  • Appropriate growth regulators prevent the cells from growing together into larger aggregates. It proves to be disadvantageous that many plant or animal cells are not viable in this form for a long time and the formation of metabolites which are difficult to eliminate from the culture fluid requires frequent transfer of the cells into fresh nutrient solution.
  • batch fermentation which is also referred to as batch culture or discontinuous fermentation.
  • process control is used for batch fermentation:
  • the nutrient medium is inoculated at the beginning of the fermentation process and the fermentation is ended after the limiting substrate has been used up - or at another suitable point in time, for example the increase in an inhibitory product.
  • Batch fermentation is called a closed system. In batch fermentation, the substrate, cell and product concentration changes constantly. Batch fermentation leads to a characteristic growth curve in which several growth phases are distinguished.
  • the lag phase in which the cells adapt to the new conditions after inoculation, is followed by the so-called exponential growth phase (or log phase), during which the cell population increases at a constant growth rate.
  • log phase exponential growth phase
  • the stationary phase therefore means that usually one or more substrates have already been used up and a toxic metabolic product has already accumulated to such an extent that the cell mass no longer increases.
  • the specific growth rate is therefore zero.
  • the cells metabolize their reserve substances, which inevitably leads to the death phase relatively quickly.
  • the active ingredients to be extracted are then extracted from the biomass. The disadvantage of this process is that the yield of the active ingredients to be produced is comparatively low for each batch.
  • continuous culture In contrast to this is the so-called continuous culture (or continuous fermentation).
  • a biological system of growing cells is constantly supplied with fresh nutrient solution and, on the other hand, culture solution including the substrates, products and cells are continuously withdrawn at the same time.
  • culture solution including the substrates, products and cells are continuously withdrawn at the same time.
  • the batch process it is an " open system or a so-called single-stage flow culture. After the organisms have adjusted to the flow rate, the system reaches a steady state under certain conditions, in which all concentrations and turnover rates assume constant values.
  • fed-batch process which is a closed system (comparable to batch fermentation), to which a volumetric flow of fresh nutrients is fed continuously or at intervals, assumes an intermediate position, but no culture solution is drawn off.
  • the stationary phase is also limited here by the occurrence of toxic metabolites, or the active substances can only be obtained by biomass extraction. A depletion of metabolites is not planned in the fed-batch process.
  • the prerequisite for the development of an improved production process is a process in which the supply of oxygen and nutrients is reliably guaranteed over an extended period of time and, moreover, toxic metabolites which are formed by the organ cultures are depleted. This prevents an early transition from the stationary phase to the dying phase. According to the invention, this can be achieved by a closed long-term culture process.
  • Long-term culture processes are to be understood as a culture process that can be used to produce active ingredients for at least 1-2 months without the biomass itself having to be extracted.
  • the stationary phase offers particular advantages with regard to the formation of secondary metabolites, since there is no competition between growth and production, the particular advantage of the process according to the invention is that it provides an extended stationary phase in a closed fermentation system ,
  • organ cultures often show a higher secondary material production in the stationary phase, since production and growth correlate inversely.
  • the biomass itself does not have to be extracted, but can be depleted periodically or continuously with regard to the active ingredients and the toxic by-products. The elimination of the toxic by-products prevents an early transition to the death phase.
  • the process according to the invention is a two-phase fermentation process:
  • an optimal growth medium is added during the log growth phase, depending on the respective plant organ culture.
  • an optimized production medium is used in the second culture stage (stationary phase).
  • secondary metabolites such as active substances and toxic metabolites are removed from the nutrient solution circuit by means of suitable chromatographic devices which can be exchanged in the sterile process, whereby damage to the root tissue can be prevented.
  • the process sequence according to the invention deviates from the conventional paradigm of selection for rapidly growing cultures and relies on the often more productive stationary phase. Based on the scheme of the batch, fed Batch and continuous fermentation processes, the process according to the invention can best be classified as a “modified fed-batch process”.
  • Transformed root hair cells represent a genetically stable, fast growing and physiologically undemanding, heterotrophic organ culture system, which usually provides a fingerprint comparable to the roots of the untreated mother plant with regard to the accumulation of plant secondary substances. It is to be expected that "the drug content in transformed root hair cells is equal to or even higher than in the roots of the starting plant.
  • the accumulated, for example, transformed root hair cells of Linum flavum based on the dry weight of 1.5-3.5% of 5-methoxy-Podophyllotoxin This is 2 to 5 times the content of the roots of the differentiated plant and 5 to 12 times the content of cell suspension cultures.
  • Plants can be wounded and deliberately infected with agrobacteria such as A. rhizogenes. This often results in the emergence of genetically modified roots at the wounded area. These roots are then called transformed root hair cells or "hairy roots” because they usually have a highly branched and hairy morphology that differs from normal roots. These transformed root hair cells represent an ideal culture system because they grow quickly, just a very simple one
  • the medium described can also be used to cultivate two different root species in parallel in a bioreactor, whereby secondary metabolites can be produced by one species and biotransformed by the other species.
  • effectors are preferably used in the stationary phase to increase the yield of the desired metabolic products. These can be used periodically or continuously. Effectors are stress factors that are biochemical and physiological in plants Cause changes. When using effector technology, a distinction must be made between biotic (fungal wall extracts, chitin, chitin hydrolyzates), abiotic (UV, pH, rare earths, heavy metals, electrical stimuli) and endogenous (methyljasmonic acid, jasmonic acid, salicylic acid, growth regulators) effectors.
  • biotic fungal wall extracts, chitin, chitin hydrolyzates
  • abiotic UV, pH, rare earths, heavy metals, electrical stimuli
  • endogenous effectors methyljasmonic acid, jasmonic acid, salicylic acid, growth regulators
  • tobacco cell suspension cultures react with the addition of various biotic, abiotic and endogenous effectors (fungal wall extracts of phytophthora, methyljasmonic acid) with an increased production of capsidiol and an increased biosynthesis of the tobacco-specific sesquiteipen synthase.
  • various biotic, abiotic and endogenous effectors fungal wall extracts of phytophthora, methyljasmonic acid
  • abiotic effectors e.g. lowering the pH
  • electroporation can also be used, the tissue being placed under electrical voltage.
  • the cell walls are reversibly permeabilized and the excretion of cell contents is promoted. This approach can also be used in combination with other effector techniques.
  • periodic depletion of secondary metabolites in the stationary phase can be carried out as follows:
  • effectors are added, which increases the discharge and possibly the production of secondary metabolites, in particular active ingredients.
  • the active substances are depleted via the closed nutrient solution cycle (via a corresponding device).
  • a further addition of effectors to the vegetable takes place Organ cultures.
  • the toxic metabolites which are now formed are expediently depleted in the period between the further addition of the effectors until the active substances are excreted by the plant organ cultures, likewise via the closed nutrient solution cycle (but preferably via a depletion device other than the active substances).
  • An apparatus for carrying out the method according to the invention comprises the following features: a) a fermenter vessel, b) a feed for nutrient solution and / or gases into the fermenter vessel, c) a discharge for nutrient solution and / or gases from the fermenter vessel, d) a nutrient solution tank, e) one or more devices for the depletion of secondary metabolites, with a) - e) forming a closed nutrient solution cycle.
  • the nutrient solution tank can consist of a gamma-ray sterilized plastic tank with an integrated port system.
  • the devices for the depletion of secondary metabolites can be carried out, for example, by columns which can be exchanged under sterile conditions and are filled with different chromatographic column materials (e.g. XAD resins).
  • chromatographic column materials e.g. XAD resins
  • the columns can preferably be configured as autoclavable plastic cartridges with a supply ratio.
  • the device further contains an additional container which is connected to the nutrient solution circuit and is provided for receiving an aqueous solution of effectors.
  • the pictures show:
  • Fig. 1 is a schematic representation of the two-phase long-term culture regime with periodic discharge of the metabolites.
  • Fig. 2 is a schematic representation of an example of a circulating nutrient solution system according to the invention with double column purification.
  • Fig. 3 shows an HPLC chromatogram of an O. basilicum extract from a hairy roots culture (HRC).
  • Fig. 4 a quantitative analysis of samples taken from a 4 month old O. basilicum HRC.
  • Fig. 5 the rosmarinic acid (RA) content measured in the medium of an O. basilicum hairy root shake flask culture after elicitation with 10 ⁇ M methyljasmonic acid. Points represent averages of two samples.
  • O treatment with MeJ
  • D control
  • Rosemary acid is an ester of caffeic acid and 3,4-dihydroxyphenyllactic acid. Rosemary acid is used as an antioxidant in the cosmetics industry and shows antimicrobial, antitumor, anti-inflammatory and antiviral properties. The pure substance is currently traded at a price of around 2500 €. Rosemary acid is found in high concentrations in, among other things, transformed basil roots.
  • Seeds of basil containing rosemary acid are treated with sodium hypochlorite for 10 min. surface sterilized and germinated in the dark at 28 ° C.
  • the transformation by co-cultivation with Agrobacterium rhizogenes is carried out with 3 - 4 day old whole seedlings by means of vacuum infiltration in a desiccator at 80 mbar. This enables a large number of seedlings to be transformed using the high-throughput method.
  • the transformation is verified by means of PCR. This is followed by a selection of individually transformed basil roots in Petri dish cultures which have a morphology suitable for the design of the bioreactor support.
  • the selected transformed basil roots are immobilized directly on the support of a spray reactor (eg the LCMB (Low cost mist bioreactor) developed by ROOTec) and the transformed root cultures, which have already been cultivated under conditions similar to those in production, are directly subjected to a second selection process, which includes the time-consuming use of shake flask cultures is no longer necessary.
  • the transformed basil roots are immobilized in a special laminar flow provided with a lifting device. This laminar flow device is designed so that a spray reactor and a loading container (or two spray reactors) can be inserted at the same time.
  • the carrier of the spray reactor is introduced into the loading container via a lifting device.
  • the transformed basil roots selected in the first selection process are located in the loading container. These are applied to the support of the spray reactor by swirling and remain there on hooks. The carrier is then pulled out of the loading container and put back into the spray reactor. leads This process is repeated with several spray reactors and can be automated.
  • More than 30% of rosemic acid is excreted from individual transformed roots and easily dissolves in water. Biosynthesis is stimulated by the periodic (interval-controlled) circulation of the nutrient medium and an integrated depletion process. The depletion takes place in such a way that the nutrient solution, which is sprayed onto the transformed root cultures in a nutrient solution / gas mix, drips off and is then pumped out of the bioreactor becomes. The pumped-out nutrient solution is then pumped into an autoclavable plastic cartridge with a storage container. The storage chamber corresponds to the volume that is pumped through the bioreactor system in one spray interval. The medium then runs passively through a column, which means that rosmarinic acid can be optimally depleted.
  • the filling material of the column consists of various XAD resins, with XAD-4, among others, showing good results.
  • the cartridge is designed so that it can be replaced regularly under sterile conditions and inserted into the chromatographic separation system (preparative HPLC) for the purification of rosemary acid.
  • elicitors (effectors) dissolved in aqueous solution can be introduced into the system.
  • the periodic addition of methyl jasmonic acid can significantly increase the production and discharge of rosemary acid.
  • the process is checked offline by taking regular samples from the spray reactor.
  • Two spray reactors each with a gas volume of around 100 liters, are integrated in a mobile trolley.
  • This double bioreactor system can be opened autonomously - completely decoupled from the gas supply - in the special laminar flow in a sterile manner for sampling.
  • the samples are taken from the medium via a septum, which is attached to the nutrient solution tank via a hose. Sampling enables, among other things, analyzes of sugar, phosphate, nitrate, ammonium, conductivity, pH, rosemic acid and other metabolic products.
  • the analyzes are carried out using HPLC, photospectrometry, conductometry and pH measurement.
  • the transformed basil roots are supplied with nutrient solution via a 20 liter plastic tank (disposable sack made of gamma-sterilized polyethylene), which is attached to the floor in a trolley.
  • the tank can be exchanged for long-term culture processes under sterile conditions.
  • the long-term culture of the basil roots is achieved in the spray reactor through continuous gas solution with computer-controlled intervals at which the nutrient solution / gas mix is sprayed into the bioreactor volume.
  • the fineness of the spray can be changed by the angle of the swirling gas flow and the pressure of the gas flow. The finer the mist, the better the moistening of the transformed roots in the core zones of the wearer.
  • the basil roots show normal growth with the formation of root hairs, which are not destroyed by mechanical influences (e.g. shear forces).
  • the optimal gas / nutrient solution supply also in the core zones of the transformed root cultures enables long-term cultivation with increased productivity over several months.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus pflanzlichen Organkulturen, das eine log-Wachstumsphase und eine stationäre Produktionsphase umfasst, wobei in der stationären Phase Nährlösung und ein Sauerstoff enthaltendes Gas periodisch oder kontinuierlich zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Sekundärmetaboliten in der stationären Phase über einen geschlossenen Nährlösungskreislauf periodisch oder kontinuierlich aus den pflanzlichen Organkulturen abgereichert werden sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von sekundären Pflanzeninhalts- stoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Kultivierung von Zellen zur Erzeugung von Zellmaterial und insbesondere zur Gewinnung von metabolischen Produkten aus diesen Zellen hat in den letzten Jahren ständig an Bedeutung zugenommen. Da die chemische Synthese derartiger metaboli- scher Produkte häufig schwierig oder gar unmöglich ist oder sich gegenüber der biochemischen Produktion als unwirtschaftlich erweist, hat die Wirkstoffproduktion bereits seit langem im großen Umfang durch Kultivierung von Hefen, Schimmelpil- zen und Bakterien zur Herstellung bestimmter Produkte an Bedeutung gewonnen. Das Marktvolumen für aus Pflanzen gewonnene Arzneistoffe erreichte beispielsweise 1997 alleine für die pharmazeutische Industrie 22,6 Milliarden US-Dollar. Aus Pflanzen gewonnene Verbindungen sind ebenfalls für Kosmetika, als Nutraceuticals und als chemische Stoffe in der Landwirtschaft erforderlich.
Die Ermittlung geeigneter Kultivierungsbedingungen und der damit verbundenen hohen Ausbeuten von metabolischen Produkten der gezüchteten Zellen ist daher ein vordringliches Ziel der Forschung.
Von den pflanzlichen (oder auch tierischen) Zeil- und Gewebekulturen (vorwiegend Zellsuspensionen, Kalluskulturen) sind pflanzliche Organkulturen (transformierte Wurzelhaar-(hairy root), Wurzel- oder Sprosskulturen (shooty teratomas)) streng zu unterscheiden. Für die Fermentation wurden bislang vor allem Zellsuspensionskulturen eingesetzt, welche aus undifferenzierten Einzelzellen oder Zellaggregaten beste- hen. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß Zellsuspensionskulturen genetisch häufig instabil sind, was einen gravierenden Einfluß auf die Wirkstoffproduktion mit sich bringt. Selbst viel versprechende Hochleistungszelllinien können daher nach einigen Zyklen starken Schwankungen in der Produktion der metabolischen Produkte unterworfen sein, bzw. kann die Produktion dieser Produkte auch vollständig unterbunden werden.
Pflanzliche Organkulturen, und hier vor allem die kommerziell interessanten transformierten Wurzelkulturen, bilden aus differenziertes Gewebe, welches sich auch in Langzeitkulturen als genetisch deutlich stabiler erweist als Zellsuspensionskulturen. Dank des schnellen Wachstums von transformierten Wurzelkulturen, welche häufig vergleichbare Wachstumsraten wie Zellsuspensionskulturen aufweisen, sind diese Organkulturen für die fermentative Produktion von kommerziell interessanten Inhaltsstoffen besonders geeignet. Vor allem können transformierte Wurzelkulturen - anders als Zellsuspensionskulturen - ohne Wachstumsregulatoren kultiviert werden. Die Vermeidung des Einsatzes von Wachstumsregulatoren ist deswegen von Vorteil, da diese die Biosynthese von Sekundärmetaboliten hemmen können. Zur Züchtung von Geweben ist es notwendig, die für die Ernährung der Zellen notwendigen Mineralstoffe, eventuell Wachstumsregulatoren, Kohlenstoffquellen (normalerweise Saccharose, Fructose oder Glucose), so wie ggf. Gase wie Sauerstoff oder Kohlendioxid den Zellen regelmäßig zuzuführen.
Die einfachste und wirtschaftlichste Form der Kultivierung von Zellen ist die oben angesprochene Suspensionskultur, wobei isolierte Zellen in einer Nährflüssigkeit suspendiert sind, verbrauchte Nahrungsbestandteile der Nährlösung regelmäßig zugeführt werden und ggf. eine Begasung zur Aufrechterhaltung der Suspension und Ernährung der Zellen durchgeführt wird. Durch entsprechende Wachstumsregulato- ren wird ein Zusammenwachsen der Zellen zu größeren Aggregaten verhindert. Als nachteilig erweist sich dabei, daß viele Pflanzen- oder Tierzellen in dieser Form nicht lange lebensfähig sind und die Bildung von aus der Kulturflüssigkeit schlecht eliminierbaren Metaboliten eine häufige Übertragung der Zellen in frische Nährlösung erfordert.
Um die Nachteile der Suspensionskulturen isolierter Zellen zu vermeiden, ist man daher dazu übergegangen, aus differenzierte Kulturen, wie beispielsweise transfor- mierte Wurzelhaarkulturen bzw. Wurzelkulturen oder „hairy roots" oder Pflanzensprossen bzw. Blattgewebe zu kultivieren. Solche größeren Aggregate neigen in Suspension zur Endhomogenisierung, insbesondere in größeren Reaktoren, wodurch eine Abänderung bzw. Anpassung der Verfahrensbedingungen erforderlich wurde, durch die eine gleichmäßige Versorgung der Zellaggregate mit Nährlösung und den notwendigen Gasen erreicht wird.
In technischer Hinsicht können bei den Fermentationsverfahren im allgemeinen drei unterschiedliche Verfahrenstypen unterschieden werden:
An erster Stelle steht die sog. Batch-Fermentation, die auch als Batch-Kultur bzw. diskontinuierliche Fermentation bezeichnet wird. Bei der Batch-Fermentation wird von folgender Prozessführung Gebrauch gemacht:
Das Nährmedium wird zu Beginn des Fermentationsprozesses beimpft und die Fermentation nach Verbrauch des limitierenden Substrats - oder zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt, beispielsweise der Zunahme eines hemmenden Produktes, beendet. Eine Batch-Fermentation wird als geschlossenes System bezeichnet. Bei einer Batch-Fermentation ändert sich die Substrat-, Zeil- und Produktkonzentration stän- dig. Die Batch-Fermentation führt zu einer charakteristischen Wachstumskurve, bei der mehrere Wachstumsphasen unterschieden werden. Auf die Lag-Phase, in der sich die Zellen nach dem Inokulieren an die neuen Bedingungen adaptieren, folgt die sog. exponentielle Wachstumsphase (oder Log-Phase), während der sich die Zellpopulation mit konstanter Wachstumsrate vermehrt. Am Ende der Log-Phase verlangsamt sich das Zellwachstum und in der darauf folgenden stationären Phase nimmt die Zellzahl nicht mehr zu. Nach der vergleichsweise kurzen stationären Phase sterben die zu kultivierenden Zellen in der Absterbephase langsam ab. In der submersen Batch- oder Chargenkultur bedeutet daher die stationäre Phase, daß meist ein oder mehrere Substrate bereits verbraucht sind, und sich ein toxisch wirkendes Stoffwech- selprodukt bereits so stark angereichert hat, daß die Zellmasse nicht mehr zunimmt. Die spezifische Wachstumsrate beträgt damit Null. Die Zellen verstoffwechseln ihre Reservestoffe, was zwangsläufig relativ rasch zur Absterbephase führt. Die zu gewinnenden Wirkstoffe werden dann aus der Biomasse extrahiert. Von Nachteil ist bei diesem Verfahren, daß die Ausbeute der zu erzeugenden Wirkstoffe für jeden Ansatz vergleichsweise gering ist.
Im Gegensatz hierzu steht die sog. kontinuierliche Kultur (bzw. kontinuierliche Fermentation). Einem biologischen System wachsender Zellen wird permanent frische Nährlösung zugeführt und andererseits gleichzeitig Kulturlösung einschließlich der Substrate, Produkte, Zellen ständig abgezogen. Im Gegensatz zum Batch-Ver fahren handelt es sich um ein "offenes System oder um eine sog. einstufige Fließkultur. Nachdem sich die Organismen auf die Fließrate eingestellt haben, erreicht das System unter bestimmten Voraussetzungen einen Fließgleichgewichts-Zustand (steady State), in dem alle Konzentrationen und Umsatzraten konstante Werte annehmen.
Kontinuierliche Fermentationsverfahren werden häufig im Labormaßstab eingesetzt, haben jedoch in der industriellen Praxis wegen der durch das offene System bedingten Infektionsprobleme nur geringen Stellenwert.
Eine Zwischenstellung nimmt das sog. Fed-Batch- Verfahren ein, bei dem es sich um ein geschlossenes System handelt (vergleichbar der Batch-Fermentation), dem kontinuierlich oder in Intervallen ein Volumenstrom mit frischen Nährstoffen zugeführt wird, wobei aber keine Kulturlösung abgezogen wird. Zwar ist es bei diesem Verfahren möglich, die stationäre Phase zu verlängern, jedoch ist auch hier durch das Auftreten von toxischen Metaboliten die stationäre Phase beschränkt, bzw. können die Wirkstoffe nur durch Biomasseextraktion gewonnen werden. Eine Abreicherung von Metaboliten ist im Fed-Batch-Verfahren nicht vorgesehen.
Die bisher bekannten geschlossenen Verfahren (d.h. Batch- und Fed-Batch- Verfahren) leiden alle unter dem Nachteil, daß die Wirkstoffproduktion im wesentli- chen auf die Log-Phase beschränkt ist, während der im Gegensatz zur stationären Phase Wirkstoffproduktion und Wachstum um die gleichen Präkursoren konkurrieren, und die Ausbeute der zu erzielenden Produkte dementsprechend gering ist. Die kontinuierlichen oder offenen Fermentationsverfahren leiden, wie oben angesprochen, unter dem Nachteil, dass die sehr empfindlichen Zellkulturen einem erhöhten Infek- tionsrisiko ausgesetzt sind, wodurch die Anwendbarkeit für die industrielle Praxis eitestgehend eingeschränkt ist.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus pflanzlichen Organkulturen bereitzustellen, das bei gleichzeitiger Vermeidung einer Infektion der Organkultur eine weit höhere als bisher mögliche Ausbeute an Produkten ergibt.
Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Patentansprüchen dargelegten Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Voraussetzung für die Entwicklung eines verbesserten Produktionverfahrens ist ein Verfahren, bei dem über einen ausgedehnten Zeitraum die Sauerstoff- und Nähr- stoffvers orgung zuverlässig gewährleistet wird und zudem toxische Metabolite, die von den Organkulturen gebildet werden, abgereichert werden. Dadurch wird ein frü- her Übergang von der stationären Phase in die Absterbephase verhindert. Dies kann er fmdungs gemäß durch ein geschlossen ablaufendes Langzeitkulturverfahren erreicht werden. Unter Langzeitkulturverfahren ist ein Kulturverfahren zu verstehen, das mindestens 1-2 Monate lang zur Wirkstoffproduktion verwendet werden kann, ohne daß die Biomasse selbst extrahiert werden muß.
Da, wie eingangs angesprochen, die stationäre Phase besondere Vorteile hinsichtlich der Bildung von Sekundärmetaboliten bietet, da hier keine Konkurrenz zwischen Wachstum und Produktion herrscht, ist der besondere Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass es eine verlängerte stationäre Phase in einem dennoch ge- schlossenen Fermentationssystem bereitstellt.
Eine Verlängerung der stationären Phase bietet folgende Vorteile: 1. Das Wachstum der Organkulturen geht gegen Null. Dadurch wird die Dynamik des Prozesses reduziert und die Steuer- und Regeltechnik vereinfacht.
2. Die Organkulturen weisen in der stationären Phase häufig eine höhere Sekun- därstoffproduktion auf, da Produktion und Wachstum invers korrelieren.
3. Organkulturen können über chemische oder physikalische Streßfaktoren (Effektoren) zur periodischen Ausschleusung von Wirkstoffen gebracht werden. Dies ermöglicht die kontinuierliche Gewinnung der Wirkstoffe und reduziert die Kosten über das Down-Stream-Processing (= Produktaufarbeitung, d.h. diejenigen Verfahrensschritte, die vom Fermentationsfluid bis zum Endprodukt erforderlich sind).
4. Die Biomasse selbst muß nicht extrahiert werden, sondern kann periodisch oder kontinuierlich bezüglich der Wirkstoffe und der toxischen Nebenprodukte abge- reichert werden. Durch die Beseitigung der toxischen Nebenprodukte wird ein früher Übergang in die Absterbephase verhindert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein zweiphasiges Fermentationsverfahren:
In der ersten Kulturstufe wird während der Log- Wachstumsphase ein optimales Wachstumsmedium zugesetzt, abhängig von der jeweiligen pflanzlichen Organkultur. In der zweiten Kulturstufe (stationäre Phase) wird mit einem optimierten Produktionsmedium gearbeitet. Im geschlossenen Kreislauf werden über geeignete chromatographische Vorrichtungen, welche in dem sterilen Prozess ausgetauscht werden können, Sekundärmetabolite wie Wirkstoffe und toxische Metabolite aus dem Nährlösungskreislauf ausgeschleust, wodurch eine Schädigung des Wurzelgewebes verhindert werden kann.
Der erfindungsgemäße Verfahrensablauf weicht vom herkömmlichen Paradigma der Selektion nach schnell wachsenden Kulturen ab und setzt auf die häufig produktivere stationäre Phase. Anhand des eingangs angesprochenen Schemas der Batch-, Fed- Batch und kontinuierlichen Fermentationsverfahren läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren am besten als „modifiziertes Fed-Batch-Verfahren" einstufen.
Im Rahmen des erfindungs gemäßen Verfahrens werden bevorzugt die bereits be- kannten und besonders vorteilhaft einsetzbaren transformierten Wurzelhaarzellen verwendet. Transformierte Wurzelhaarzellen stellen ein genetisch stabiles, schnell wachsendes und physiologisch anspruchsloses, heterotrophes Organkultursystem dar, welches bezüglich der Akkumulation von pflanzlichen Sekundärstoffen meist einen vergleichbaren Fingerprint liefert wie die Wurzeln der unbehandelten Mutterpflanze. Es ist damit zu rechnen, "daß der Wirkstoffgehalt in transformierten Wurzelhaarzellen gleich oder sogar höher ist als in den Wurzeln der Ausgangspflanze. So akkumulierten beispielsweise transformierte Wurzelhaarzellen von Linum flavum bezogen auf das Trockengewicht 1,5-3,5% 5-Methoxy-Podophyllotoxin. Das ist das 2- bis 5- fache des Gehalts der Wurzeln der differenzierten Pflanze und das 5-12-fache des Gehalts von Zellsuspensionskulturen.
Pflanzen können verwundet und vorsätzlich mit Agrobakterien, wie beispielsweise A. rhizogenes infiziert werden. Dies hat oftmals das Entstehen von genetisch veränderten Wurzeln an der verwundeten Stelle zur Folge. Diese Wurzeln werden dann als transformierte Wurzelhaarzellen oder „hairy roots" bezeichnet, weil sie meist eine hoch verzweigte und haarige Morphologie zeigen, die sich von normalen Wurzeln unterscheidet. Diese transformierten Wurzelhaarzellen stellen ein ideales Kultursystem dar, weil sie schnell wachsen, nur ein sehr einfaches Wachstumsmedium benötigen und über eine verlängerte Zeitspanne genetisch stabil bleiben. Mit der hier be- schriebenen Technik können auch zwei verschiedene Wurzelspezies parallel in einem Bioreaktor kultiviert werden, wodurch Sekundärmetabolite von der einen Spezies produziert und durch die andere Spezies biotransformiert werden können.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in der stationären Phase zur Steige- rung der Ausbeute an den gewünschen Stoffwechselprodukten vorzugsweise Effektoren eingesetzt. Diese können periodisch oder kontinuierlich eingesetzt werden. Effektoren sind Stressfaktoren, die bei Pflanzen biochemische und physiologische Veränderungen hervorrufen. Beim Einsatz der Effektortechnik muss zwischen biotischen (Pilzwandextrakte, Chitin, Chitinhydrolysaten), abiotischen (UV, pH, seltene Erden, Schwermetalle, elektrische Reize) und endogenen (Methyljasmonsäure, Jas- monsäure, Salicylsäure, Wachstumsregulatoren) Effektoren unterschieden werden.
Es konnte bisher bei einer Vielzahl von Pflanzen festgestellt werden, dass diese Se- kundärmetabolite induktiv produzieren. Das heißt, der Kontakt mit biotischen, abiotischen oder endogenen Effektoren steigert die Biosynthese der Metaboliten. Einer der wichtigsten endogenen Effektoren ist Methyljasmonsäure.
Beipielsweise reagieren Tabakzellsuspensionskulturen bei Zugabe verschiedener biotischer, abiotischer und endogener Effektoren (Pilzwandextrakte von Phytophtho- ra, Methyljasmonsäure) mit einer verstärkten Produktion von Capsidiol sowie einer verstärkten Biosynthese der tabakspezifischen Sesquiteipen-Synthase.
Durch den Einsatz von abiotischen Effektoren (z.B. pH-Erniedrigung) lässt sich e- benfalls eine Produktionssteigerung und verstärkte Ausschleusung der Wirkstoffe erzielen. Erfindungsgemäß kann weiterhin die Elektroporation zum Einsatz kommen, wobei das Gewebe unter elektrische Spannung gesetzt wird. Dabei werden die Zell- wände reversibel permeabilisiert und die Ausscheidung von Zellinhaltsstoffen gefördert. Dieser Ansatz kann auch in Kombination mit anderen Effektortechniken eingesetzt werden.
Eine periodische Abreicherung von Sekundärmetaboliten in der stationären Phase kann gemäß einer Ausführungsform wie folgt durchgeführt werden:
Zunächst werden Effektoren zugesetzt, wodurch die Ausschleusung und ggf. die Produktion von Sekundärmetaboliten, insbesondere von Wirkstoffen, erhöht wird. Nach erfolgter erhöhter Ausscheidung der Wirkstoffe durch die pflanzlichen Organ- kulturen werden die Wirkstoffe über den geschlossenen Nährlösungskreislauf (über eine entsprechende Voπichtung) abgereichert. In der Phase des Wirkstoffproduktionsabfalls erfolgt dann ein weiterer Zusatz von Effektoren zu den pflanzlichen Organkulturen. Zweckmäßigerweise werden die nunmehr gebildeten toxischen Me- tabolite in der Zeitspanne zwischen dem erfolgten weiteren Zusatz der Effektoren bis zur erhöhten Ausscheidung der Wirkstoffe durch die pflanzlichen Organkulturen ebenfalls über den geschlossenen Nährlösungskreislauf (vorzugsweise jedoch über eine andere Abreicherungs Vorrichtung als die Wirkstoffe) abgereichert. Diese Schritte können dann ein- oder mehrmals wiederholt werden.
Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Merkmale: a) ein Fermentergefäß, b) eine Zuführung für Nährlösung und/oder Gase in das Fermentergefäß, c) eine Abführung für Nährlösung und/oder Gase aus dem Fermentergefäß, d) einen Nährlösungstank, e) eine oder mehrere Vorrichtungen zur Abreicherung von Sekundärmetaboliten, wobei a) - e) einen geschlossenen Nährlösungskreislauf bilden.
Ein Beispiel für eine derartige Vorrichtung ist in Abbildung 2 dargestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann der Nährlösungstank aus einem Gammastrahlen-sterilisierten Kunststofftank mit integriertem Portsystem bestehen.
Die Vorrichtungen zur Abreicherung von Sekundärmetaboliten kann beispielsweise durch Säulen erfolgen, welche unter sterilen Bedingungen ausgetauscht werden können und mit unterschiedlichen chromatographischen Säulenmaterialien (z.B. XAD- Harze) gefüllt werden.
Die Säulen können dabei bevorzugt als autoklavierbare Kunststoffkartuschen mit Vorrats- behältnis ausgestaltet sein. Vorteilhafterweise enthält die Vorrichtung weiterhin ein Zusatzbehältnis, das an den Nährlösungskreislauf angeschlossen ist und zur Aufnahme einer wässrigen Lösung von Effektoren vorgesehen ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Abbildungen sowie eines Ausführungsbeispiels ausführlicher beschrieben.
In den Abbildungen zeigen:
Abb. 1 eine schematische Darstellung des Zweiphasen-Langzeitkulturregimes mit periodischer Ausschleusung der Metaboliten.
Abb. 2 eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein erfindungsgemäßes zirkulierendes Nährlösungssystem mit Doppelsäulenaufreinigung.
Abb. 3 ein HPLC Chromatogramm eines O. basilicum Extraktes einer hairy roots- Kultur (HRC).
Abb. 4 eine quantitative Analyse von Proben, die einer 4 Monate alten O. basilicum HRC entnommen wurden.
Abb. 5 den Rosmarinsäure (RA)- Gehalt gemessen im Medium einer O. basilicum hairy root-Schüttelkolben-Kultur nach Elicitierung mit 10 μM Methyljasmonsäure. Punkte repräsentieren Durchschnittswerte von zwei Proben. O = Behandlung mit MeJ, D = Kontrolle
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der transformierten Wurzelkulturen erläutert, wobei sie auf diesen Aspekt nicht beschränkt ist.
Beispiel: Produktion von Rosmarinsäure Rosmarinsäure ist ein Ester der Kaffeesäure sowie der 3,4- Dihydroxyphenyllaktonsäure. Rosmarinsäure wird als Antioxidanz in der Kosmetikindustrie eingesetzt und zeigt antimikrobielle, antitumorale, antiinflammatorische, sowie antivirale Eigenschaften. Die Reinsubstanz wird zur Zeit mit einem Kilo- grammpreis von rund 2500 € gehandelt. Rosmarinsäure kommt in hohen Konzentrationen u.a. in transformierten Basilikumwurzeln vor.
Samen von rosmarinsäurehaltigem Basilikum (Ocimum basilicum unterschiedlicher Varietät) werden mit Natriumhypochlorit für 10 min. oberflächensterilisiert und im Dunkeln bei 28 °C zum Keimen gebracht. Die- Transformation durch Co- Kultivierung mit Agrobacterium rhizogenes (z.B. Stamm 9402) erfolgt mit 3 — 4 Tage alten ganzen Keimlingen mittels Vakuuminfiltration im Exsikkator bei 80 mbar. Dadurch kann im Hochdurchsatzverfahren eine grosse Zahl an Keimlingen transformiert werden. Der Nachweis der Transformation erfolgt mittels PCR. An- schliessend erfolgt eine Selektion von einzelnen transformierten Basilikumwurzeln in Petrischalenkulturen, welche eine für das Design des Bioreaktor-Trägers geeignete Morphologie besitzen.
Die selektierten transformierten Basilikumwurzeln werden direkt am Träger eines Sprühreaktors (z.B. des von der Fa. ROOTec entwickelten LCMB (Low cost mist bioreactor)) immobilisiert und die so bereits unter produktionsähnlichen Bedingungen kultivierten transformierten Wurzelkulturen werden direkt einem zweiten Selek- tionsprozess unterworfen, der u.a. den aufwendigen Einsatz von Schüttelkolbenkultu- ren erübrigt. Das Immobilisieren der transformierten Basilikumwurzeln erfolgt in einem mit einer Hebevorrichtung versehenen Speziallaminarflow. Dieses Lami- narflowgerät ist so konzipiert, dass gleichzeitig ein Sprühreaktor sowie ein Beladebehältnis (oder zwei Sprühreaktoren) eingeführt werden können. Über eine Hebevorrichtung wird der Träger des Sprühreaktors in das Beladebehältnis eingeführt. In dem Beladebehältnis befinden sich die in dem ersten Selektionsprozess ausgewählten transformierten Basilikumwurzeln. Diese werden über Verwirbelung auf den Träger des Sprühreaktors aufgebracht und bleiben dort an Haken hängen. Der Träger wird danach aus dem Beladebehältnis hochgezogen und wieder in den Sprühreaktor einge- f hrt. Dieser Vorgang wiederholt sich mit mehreren Sprühreaktoren und kann automatisiert werden.
Anders als bei herkömmlichen Fermentationsprozessen, welche eine Selektion von Zelllinien erst im Labormaßstab (Schüttelkolben) betreiben, danach in den Pilotmaßstab und schlussendlich in den Produktionsmaßstab übergehen - bei jeweils veränderten Prozessbedingungen, erfolgt die Selektion in diesem Fall direkt von der Petri- schale in den Sprühreaktor. Ein weiterführendes Scale-up erfolgt über die Multiplikation der Sprühreaktoren ohne dass sich die Prozessparameter nochmals verändern. Dies beschleunigt massiv die Entwicklung eines industriellen Produktionsverfahrens für Rosmarinsäure.
Nach dem Immobilisieren der transformierten Basilikumwurzeln werden diese in dem Sprühreaktor für 2-3 Wochen kultiviert. Dazu wird vor allem ein l_ MS (Muras- higge & Skoog) + B5 Vitamin - Medium mit 3% Zucker eingesetzt. Danach wird der Träger unter sterilen Bedingungen hochgezogen und die einzelnen Wurzelgeflechte getrennt analysiert (Biomassenzuwachs, Rosmarinsäuregehalt). Der Rosmarinsäure- gehalt liegt bei einzelnen Kulturen deutlich über 10 % des Trockengewichtes. Hochertragskulturen werden anschliessend in dem Sprühreaktor bis zum steady State hochgefahren, wobei bis zu 10 kg Biomasse generiert werden. Diese Kultivierung erfolgt ebenfalls mit Vi MS + B5 Vitamine mit 3 - 8% Zucker. Nach erreichen des steady-states wird der Phosphatgehalt des Mediums deutlich reduziert (um deutlich mehr als 50%). Dadurch wird das Wachstum der transformierten BasilikumWurzel- kulturen gestoppt und gleichzeitig die Produktion der Rosmarinsäure zusätzlich an- geregt.
Rosmarinsäure wird von einzelnen transformierten Wurzeln zu mehr als 30 % ausgeschieden und löst sich problemlos in Wasser. Durch die periodische (intervallgesteuerte) Zirkulation des Nährmediums und einen darin integrierten Abreicherungspro- zess wird die Biosynthese angeregt. Die Abreicherung erfolgt in der Weise, dass die Nährlösung, welche in einem Nährlösungs- / Gasmix auf die transformierten Wurzelkulturen aufgesprüht wird, abtropft und danach aus dem Bioreaktor abgepumpt wird. Die abgepumpte Nährlösung wird daraufhin in eine autoklavierbare Kunsstoff- kartusche mit Vorratsbehältnis eingepumpt. Die Vorratskammer entspricht dem Volumen, welches in einem Sprühintervall durch das Bioreaktorsystem gepumpt wird. Das Medium läuft anschliessend passiv durch eine Säule, wodurch ein optimale Ab- reicherung der Rosmarinsäure erfolgen kann. Das Füllmaterial der Säule besteht aus verschiedenen XAD-Harzen, wobei unter anderem XAD-4 gute Ergebnisse zeigt. Die Kartusche ist so entwickelt, dass sie regelmässig unter sterilen Bedingungen ausgetauscht und für die Aufreinigung der Rosmarinsäure in chromatographische Auftrennungs System (präparative HPLC) eingefügt werden kann.
Über ein Zusatzbehältnis, welches über ein 3 -Wege- Ventil an die Nährlösungs Versorgung angeschlossen ist, können in wässriger Lösung gelöste Elicitoren (Effektoren) in das System eingeschleust werden. Unter anderem kann durch periodische Zugabe von Methyl-jasmonsäure die Produktion und Ausschleusung von Rosmarin- säure deutlich erhöht werden.
Der Prozess wird offline durch regelmässige Probennahmen aus dem Sprühreaktor kontrolliert. Zwei Sprühreaktoren mit jeweils rund 100 Liter Gasvolumen sind in einem mobilen Rollwagen integriert. Dieses Doppelbioreaktorsystem kann autonom - dabei komplett von der Gasversorgung abgekoppelt - in dem Speziallaminarflow steril für Probennahmen geöffnet werden. Die Probennahmen aus dem Medium erfolgen über ein Septum, welches über einen Schlauch an den Nährlösungstank angebracht ist. Die Probennahme ermöglicht unter anderem die Analysen des Zuckers, Phosphat, Nitrat, Ammoniums, Leitfähigkeit, pH- Wert, Rosmarinsäure und anderer Stoffwechselprodukte. Die Analysen erfolgen mittels HPLC, Photospektrometrie, Konduktometrie und pH-Messung.
Die Versorgung der trans formierten Basilikumwurzeln mit Nährlösung erfolgt über einen 20-Liter Kuns stofftank (Einwegsack aus gammasterilisiertem Polyethylen), welcher in einem Rollwagen am Boden angebracht ist. Der Tank kann bei Langzeit- kulturprozessen unter sterilen Bedingungen ausgetauscht werden. Die Langzeitkultur der Basilikumwurzeln gelingt in dem Sprühreaktor durch eine kontinuierliche Bega- sung mit computergesteuerten Intervallen, bei denen der Nährlösungs- / Gasmix in das Bioreaktorvolumen eingesprüht wird. Die Feinheit des Sprühnebels kann durch den Winkel des Verwirbelungsgasstrom.es sowie durch den Druck des Gasstromes verändert werden. Je feiner der Nebel, desto besser die Befeuchtung der transfor- mierten Wurzeln in den Kernzonen des Trägers.
Die Basilikumwurzeln zeigen in diesem aeroponischen Sprühreaktor-System ein normales Wachstum mit der Ausbildung von Wurzelhaaren, welche nicht durch mechanische Einwirkungen (z.B. Scherkräfte) zerstört werden. Durch die optimale Gas- / Nährlösungsversorgung auch in die Kemzonen der transformierten Wurzelkulturen gelingt die Langzeitkultivierung mit erhöhter Produktivität über mehrere Monate.
Wird von 10 kg FG (FG= Frischgewicht) Biomasse einer selektierten BasilikumWurzelkultur nach 4 Wochen, entsprechend 1 kg TG (TG = Trockenge- wicht) und mit einem Rosmarinsäuregehalt von 10 % des TG (100 g Rosmarinsäure) ausgegangen und ein 14-tägiger Elicitorzyklus unter steady State Bedingungen durchgeführt, so werden bei 50% Ausschleusung und 80% Rückgewinnung durch Säulenreinigung unter Einsatz von XAD-4 Harz 40 g Rosmarinsäure erhalten. Bei einer Langzeitkultur über 2 Monate werden so ca. 150 g Rosmarinsäure erhalten.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Gewinnung von Sekundärmetaboliten aus pflanzlichen Organkul- turen, das eine log- Wachstumsphase und eine stationäre Produktionsphase um- fasst, wobei in der stationären Phase Nährlösung und ein Sauerstoff enthaltendes Gas periodisch oder kontinuierlich zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sekundärmetaboliten in der stationären Phase über einen geschlossenen Nährlösungskreislauf periodisch oder kontinuierlich aus den pflanzlichen Organkulturen abgereichert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Sekundärmetaboliten Wirkstoffe und toxische Metabolite umfassen, wobei diese voneinander getrennt abgereichert werden.
3. Verfahren nach Ansprach 1 oder 2, bei dem als pflanzliche Organkulturen Wurzel- oder Sproßkulturen verwendet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem als pflanzliche Organkulturen trans- formierte Wurzelkulturen verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Wurzelkulturen durch Infektion mit dem Bakterium . rhizogenes transformiert werden.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in der stationären Phase zur Erhöhung der Ausbeute abiotische, biotische und/oder endogene Effektoren eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem in der stationären Phase eine periodische Abreicherung der Sekundärmetabolite wie folgt durchgeführt wird: a) Zusetzen von Effektoren, b) Abreichem der Wirkstoffe nach deren erhöhter Ausscheidung durch die pflanzlichen Organkulturen, c) weiterer Zusatz von Effektoren in der Phase des Wirkstoffproduktionsabfalls in den pflanzlichen Organkulturen; d) Abreichem der toxischen Metabolite in der Zeitspanne zwischen dem weiteren Zusatz der Effektoren und der erhöhten Ausscheidung der Wirkstoffe durch die pflanzlichen Organkulturen, und e) ein- oder mehrmaliges Wiederholen der Schritte b) - d).
8. Verfahren nach Ansprach 6 oder 7, bei dem als Effektor Methyljasmonsäure eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem als Effektor die Elektroporation eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zunächst Hochertragszelllinien selektiert werden.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in der Wachstumsphase und in der Produktionsphase unterschiedliche Nährlösungen und/oder ein unterschiedliches Sauerstoff enthaltendes Gas eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Metaboliten Säulen-chromatographisch aus der zirkulierenden Nährstofflö- sung entfernt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als Säulen in das System integrierte, steril austauschbare Kartuschen mit geeignetem Säulenmaterial eingesetzt werden.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, bei dem aus mit Agrobacteriwn rhizogenes (Stamm 9402) ttansformierten Basilikumwurzeln Rosmarinsäure gewonnen wird.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, die folgendes umfasst: a) ein Fermentergefäß, b) eine Zuführung für Nährlösung und/oder Gase in das Fermentergefäß, c) eine Abführung für Nährlösung und/oder Gase aus dem Fermentergefäß, d) einen Nährlösungstank, e) eine oder mehrere Vorrichtungen zur Abreicherung von Sekundärmetaboliten, wobei a) - e) einen geschlossenen Nährlösungskreislauf bilden.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der der Nährlösungstank aus einem Gamma- strahlen-sterilisierten Kunststofftank mit integriertem Portsystem besteht.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, bei der die Vorrichtungen zur Abreicherung der Sekundärmetabolite mindestens eine autoklavierbare Kunststoffkartu- sehe mit Vorratsbehältnis aufweisen.
18. Vorrichtung nach Anspruch 15, 16 oder 17, bei der als Vomchtung zur Abreicherung von Sekundärmetaboliten steril austauschbare Kartuschen mit geeignetem Säulenmaterial in das System integriert sind.
19. Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der das Säulenfüllmaterial aus XAD-Harzen, z.B. XAD-4-Harz, besteht.
20. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüchen, die weiterhin ein Zusatzbehältnis umfasst, das an den Nährlösungskreislauf angeschlossen ist und zur Aufnahme einer wässrigen Lösung von Effektoren vorgesehen ist.
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