WO2005003284A2 - KULTURGEFÄß ZUR DUALKULTUR VON ORGANISMEN - Google Patents

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Rüdiger Hampp
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Universität Tübingen
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means

Definitions

  • the invention relates to a culture system which allows a controlled dual culture of different biological organisms, in particular a dual culture of plants, cell cultures and / or microorganisms.
  • a dual culture is often used in biology and medicine and for many questions. For example, dual cultures are used to study the effects of various growth factors, hormones, signaling, inhibiting or other substances that are excreted by one cell line and act on another cell line.
  • the fields of application and the organisms or cell lines involved can be the following, to name just a few examples: Investigation of angiogenesis (endothelial cells and fibroblasts), neuron growth (cells of neuronal and non-neuronal tissue), plant growth (plants and Fungi or microorganisms), search for new antibiotic or antifungal substances (microorganisms such as bacteria and fungi). In all of these questions, a chemical exchange between the different organisms is desired, but physical contact between the organisms or mixing should be avoided.
  • the object of the present invention is to provide a culture system which allows different organisms to be grown, between which an exchange of chemical substances takes place, but which at the same time prevents physical contact and thus mixing of these organisms.
  • the invention primarily proposes a device with the features mentioned in claim 1. Its further developments, methods for its use and possible applications are the subject of the remaining dependent claims 2 to 20, the wording of which, like the wording of the abstract, is made the content of the description by reference.
  • a culture vessel for the dual culture of organisms which has at least two culture chambers. These culture chambers each have a base area and at least one side surface, the base areas of at least two culture chambers adjoining one another and being separated from one another by at least one release agent.
  • This provides a composite culture vessel with at least two opposing culture chambers, which after being filled with in particular solid or solidifying nutrient media has at least two opposing surfaces which can be inoculated or equipped with preferably different organisms separately.
  • the organisms can grow on and / or in these nutrient media and are in chemical but not physical contact with each other.
  • the same or different nutrient media can be used in the at least two culture chambers.
  • the separating agent comprises at least one partition, a separating ring and / or a separating film. It is particularly preferred that the separating means has one or more recesses or recesses, wherein in the case of several recesses these are preferably distributed uniformly over the area of the separating means, that is to say in particular over the area of the dividing wall or the separating surface, for example.
  • the culture vessel according to the invention has the shape of a high petri dish, in which the bottom is missing, and which is divided by a partition into two mutually opposite compartments, or culture chambers.
  • This partition has recesses or cutouts, for example in the form of evenly distributed round or differently shaped holes (e.g. Fig. 1). Both opposing culture chambers are advantageously covered with a cover that enables sterile mounting.
  • the exchange of chemical substances can take place between the organisms growing on opposite media surfaces in both culture chambers.
  • a spatial separation of the two organisms mainly arises from the nutrient medium itself. Effects of one organism on the other can be due to diffusion of soluble substances through the nutrient medium.
  • the number, the size and the distribution of the recesses or the presence or absence of a release agent determines the rate of diffusion of the soluble substances between the two culture chambers. A variation of these parameters can advantageously be used according to the invention for different questions.
  • a flat separating ring can be attached to the boundary between the two culture chambers be, which is attached with its outer edge to the inner side wall of the composite culture vessel and protrudes with the inner edge into the inside (eg Fig. 3).
  • the two culture chambers of the composite culture vessel in this embodiment are filled with a solidifying nutrient medium in succession.
  • the release agent can be at least partially removed.
  • a continuous removable insert and / or a continuous removable film on the border between the two culture chambers, which can rest against the partition wall and seal it (e.g. Fig. 4 A).
  • This insert or the film preferably has a pull-off aid which is intended to facilitate separation.
  • the culture medium is filled with the culture medium, which is opposite the removable insert or the removable film (e.g. Fig. 4 B).
  • the composite culture vessel is turned over, the insert is removed or the film is removed (e.g. Fig. 4 C) and the second culture chamber is filled with the nutrient medium (e.g. Fig. 4 D).
  • the partition does not necessarily have to be present.
  • the continuous use or the continuous film can alone take over the function of the soil when filling the composite culture vessel with the nutrient medium (e.g. Fig. 5).
  • the nutrient medium e.g. Fig. 5
  • chemical substances are exchanged over the entire contact area between the nutrient media in the two culture chambers.
  • rapid, unimpeded diffusion of soluble substances may even be desirable.
  • this offers the possibility of using different nutrient media in their composition.
  • the separating agent is network-like or grid-like (e.g. Fig. 2).
  • the release agent can be designed more or less flexibly, for example as a relatively inflexible grid made of plastic or other material or as a flexible network.
  • Such a network-like or lattice-like release agent preferably has the function of providing support for the nutrient medium of the culture chambers and essentially not influencing or hindering an exchange of chemical substances by the nutrient medium.
  • the mesh or lattice structures can be chosen to be finer or coarser.
  • the mesh-like or grid-like release agent can be provided with a film, in particular a peelable film. This film serves in particular to seal the release agent and can be removed after the medium has solidified.
  • the second culture chamber can then be filled with medium, as has already been exemplified.
  • At least one of the culture chambers has at least one removable side surface, in particular at least one removable or attachable ring.
  • FIG. 6 A shows a possible embodiment of this embodiment, in which an attachable or removable ring is additionally attached to the side wall of one of the culture chambers.
  • both culture chambers of the composite culture vessel can advantageously be filled with the nutrient medium in one step. Before filling with the nutrient medium, the ring is removed and the composite culture vessel is placed on a sterile surface, which ensures a suitable seal (for example Fig. 6 B). The medium flows into both culture chambers during filling, the lower culture chamber being filled to the brim.
  • the composite culture vessel becomes turned over and the ring placed back on the culture chamber filled to the brim (e.g. FIG. 6 C), in order to enable the composite culture vessel to be covered with a cover dish, for example as a spacer (e.g. FIG. 6 D).
  • a continuous removable insert or a continuous removable film in the lower culture chamber at a distance from its edge, for example at about half the height, which seals the culture vessel and at the same time ensures a distance from the bottom edge.
  • both culture chambers can also be filled in one step.
  • the medium surface of the lower culture chamber is accessible after the medium has solidified by pulling off the film or by removing the insert (e.g. Fig. 7).
  • the individual culture chambers may have a comparable size or volume.
  • At least one side surface of at least one of the culture chambers has one or more cutouts.
  • a recess or such recesses can be located in the edge region which faces away from the base area.
  • Such an embodiment is particularly suitable for growing a dual culture in which at least one of the organisms is a plant. It is particularly advantageous here if there is a recess or cutout on the outer edge of the side wall of at least one of the culture chambers located opposite one another and / or the cover shell (for example FIG. 8). The shoot of the growing plant seedling can then be placed in this recess.
  • the composite culture vessel advantageously consists essentially of plastic.
  • Polystyrene which can be used in the production of conventional petri dishes, is particularly preferably used as the material.
  • Other materials are also possible (polypropylene, glass, etc.).
  • the base area of at least one of the culture chambers is round, oval or angular. Both or all of the base areas of the culture chambers of a culture vessel advantageously have the same shape of the base area.
  • the dimensions of the base area of at least one of the culture chambers essentially correspond to the dimensions of conventional petri dishes.
  • the culture vessel according to the invention can also have the outer round shape and the diameter of a conventional petri dish. On the one hand, this has the advantage that a handling of culture vessels established in everyday laboratory work can be transferred to the culture vessels according to the invention, for example with regard to the concentrations and volumes of nutrient media, solutions etc.
  • the culture vessel according to the invention can also have a different shape, for example a rectangular shape, depending on the specific question of the experiment to be carried out.
  • at least one of the culture chambers has at least one covering means.
  • both culture chambers or all culture chambers are provided with a covering agent.
  • Such a covering means can facilitate or enable a sterile drawing up of the organisms.
  • a film or the like can be provided as the covering means.
  • Such covering means can be fixed to the culture vessel, which can be advantageous depending on the spatial orientation of the culture vessel.
  • Such fixing or fastening of the covering means can likewise promote the sterility or the freedom from contamination of the organisms in the culture vessel according to the invention.
  • a fixation can take place, for example, by suitable wrapping with parafilm or the like, or also by means of clamping devices or the like.
  • the vessel is designed as a disposable unit, in particular as a sterile disposable unit. This has the advantage that the culture vessel can be removed, for example, from appropriate sterile packaging and is readily available to the user.
  • the culture vessel is filled with nutrient media, in particular with solid nutrient media, at least two essentially solid surfaces being provided on the base surfaces of the culture chambers, which the user can equip or inoculate with appropriate organisms.
  • nutrient media in particular with solid nutrient media, at least two essentially solid surfaces being provided on the base surfaces of the culture chambers, which the user can equip or inoculate with appropriate organisms.
  • Such a previously filled culture vessel is advantageously provided in sterilized form and can thus be used as a “ready-to-use” disposable unit.
  • the choice of the nutrient media used here depends in particular on the organisms to be cultivated from. For example, media for the cultivation of microorganisms or bacteria other than for the cultivation of plant cells or whole plants or parts of plants may be advantageous or necessary.
  • the invention comprises a method for the culture of at least two preferably different organisms in the culture vessel according to the invention already described, the organisms being in chemical but not physical contact with one another.
  • the growth or metabolism of the organisms takes place in the two opposite culture chambers of the culture vessel according to the invention.
  • This method initially comprises the provision of at least one culture vessel as described above.
  • This culture vessel which is advantageously in sterile form, is optionally filled with suitable nutrient media, at least two essentially solid surfaces being formed on the base surfaces of the culture chambers.
  • This step is, of course, omitted when using culture vessels that are already filled with nutrient medium as described above.
  • these nutrient media in particular these surfaces, can be inoculated and / or populated with different organisms.
  • the organisms with the nutrient media can be introduced into the culture vessel or into the culture chambers when the nutrient media are poured. This depends on the type and preferred mode of growth of the organisms used. The organisms can then be cultivated. Depending on the question of the experiment to be carried out, the corresponding experiment can be started without further cultivation.
  • a dual culture of microorganisms such as bacteria, of fungi, protozoa, plant and / or animal cell cultures and / or is particularly preferred Plants or parts of plants are carried out.
  • the method according to the invention or the culture vessel according to the invention can preferably be used for microbiological, cell biological and / or plant biological studies.
  • the culture system according to the invention has the decisive advantage that when growing in different culture chambers of the composite culture vessel according to the invention, the organisms are never in physical contact with one another. The two organisms are not mixed even with a longer culture period, as is often the case with conventional devices.
  • the culture system according to the invention is therefore ideally suited for studying interactions between organisms based on an exchange of soluble substances.
  • the culture system according to the invention can particularly preferably be used in the agricultural industry, forestry, medical laboratory diagnostics, the development of pharmaceuticals or crop protection agents, quality control or research and development.
  • Fig. 1 Schematic representation of an exemplary composite culture vessel with a partition 3, which divides the culture vessel into two opposing culture chambers 1 and 2, with recesses in the form of uniformly distributed round or differently shaped holes 4 and with two cover shells 5a and 5b;
  • Fig. 2 Schematic representation of an exemplary composite culture vessel with a partition 6, which is designed as a network or grid, and which divides the culture vessel into two opposite culture chambers 1 and 2;
  • FIG. 3 Schematic representation of an exemplary composite culture vessel, in which a flat separating ring 7 is attached to the border between the two culture chambers, which divides the culture vessel into two culture chambers 1 and 2 lying opposite one another;
  • FIG. 6 A. Schematic representation of an exemplary composite culture vessel, in which an attachable or removable ring 10 is additionally attached to the side wall of one of the culture chambers; B. For filling with the nutrient medium, the ring 10 is removed and the composite culture vessel is positioned on a sterile base 11, C. After the medium has solidified, the ring 10 is placed back on the culture chamber filled to the brim; D. The two culture chambers are covered with covers 5a and 5b; 7: Schematic representation of an exemplary composite culture vessel, in which a continuous removable insert or a continuous removable film 8 is attached in the lower culture chamber 2 at a distance from the lower edge;
  • Fig. 9 Investigation of the influence of bacterial metabolic products on the formation of fine roots of the spruce with the help of a dual culture in an exemplary composite culture vessel: dual culture after 12 weeks.
  • FIG. 9 shows a composite culture vessel equipped in this way with a view of the lower culture chamber inoculated with bacteria.
  • the culture chamber with the bacterium was also closed with parafilm and the culture systems set up vertically in PVC stands in plastic greenhouses.
  • the greenhouses were exposed to 120 ⁇ E r ⁇ 2 s _1 in a climatic chamber at 20 ° C for 16 h per day.

Abstract

Es wird ein Kulturgefäß zur Dualkultur von Organismen bereitgestellt, welches mindestens zwei Kulturkammern mit jeweils einer Grundfläche und mindestens einer Seitenfläche aufweist. Die Grundflächen von min-destens zwei Kulturkammern grenzen aneinander und sind durch min-destens ein Trennmittel voneinander getrennt. Bei dem Trennmittel han-delt es sich vorzugsweise um eine Trennwand, einen Trennring und/oder eine Trennfolie. In besonders bevorzugter Weise weist das Trennmittel eine oder mehrere Aussparungen auf. Mit Hilfe des erfin-dungsgemäßen Kulturgefäßes kann eine Kultivierung von mindestens zwei vorzugsweise unterschiedlichen Organismen durchgeführt werden, die in chemischem, jedoch nicht in physischem Kontakt miteinander ste-hen.

Description

Kulturgefaß zur Dualkultur von Organismen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Kultursystem, welches eine kontrollierte Dualkultur unterschiedlicher biologischer Organismen erlaubt, insbesondere eine Dualkultur von Pflanzen, Zellkulturen und/oder Mikroorganismen.
Eine Dualkultur wird in der Biologie und Medizin häufig und für viele Fragestellungen benötigt. So werden beispielsweise Dualkulturen für die Untersuchung der Wirkung von diversen Wachstumsfaktoren, Hormonen, Signal-, Hemm- oder sonstigen Substanzen, die von einer Zelllinie ausgeschieden werden und auf eine andere Zelllinie einwirken, eingesetzt. Die Anwendungsgebiete und die beteiligten Organismen oder Zell- linien können folgende sein, um nur einige Beispiele zu nennen: Untersuchung der Angiogenese (Endothelzellen und Fibroblasten), des Neu- ronenwachstums (Zellen des neuronalen und nicht-neuronalen Gewebes), des Pflanzenwachstums (Pflanzen und Pilze oder Mikroorganismen), Suche nach neuen antibiotischen oder antifungischen Substanzen (Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze). Bei allen diesen Fragestellungen wird ein chemischer Austausch zwischen den unterschiedlichen Organismen erwünscht, ein physischer Kontakt zwischen den Organismen oder eine Durchmischung soll jedoch vermieden werden.
Aus dem Stand der Technik ist eine Aufzucht der Dualkulturen unterschiedlicher Organismen in einem selben Kulturgefäß, wie beispielsweise einer herkömmlichen Petrischale, bekannt. In diesen Vorrichtungen sind die Organismen nicht physisch voneinander getrennt, so dass es immer wieder zu Durchmischungen kommen kann. Für viele Fragestel- lungen vor allem in der biochemischen, molekularbiologischen oder chemischen Analyse sind solche Vorrichtungen daher ungeeignet.
BESTATIGUNGSKOPIE Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Kultursystem bereitzustellen, welches eine Aufzucht unterschiedlicher Organismen erlaubt, zwischen denen ein Austausch chemischer Substanzen stattfindet, das jedoch gleichzeitig einen physischen Kontakt und somit eine Durchmischung dieser Organismen unterbindet.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung in erster Linie eine Vorrichtung mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen vor. Seine Weiterbildungen, Verfahren zu seiner Anwendung sowie Anwendungs- möglichkeiten sind Gegenstand der übrigen abhängigen Ansprüche 2 bis 20, deren Wortlaut ebenso wie der Wortlaut der Zusammenfassung durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht wird.
Diese Aufgabe wird durch ein Kulturgefäß zur Dualkultur von Organis- men gelöst, welches mindestens zwei Kulturkammern aufweist. Diese Kulturkammern besitzen jeweils eine Grundfläche und mindestens eine Seitenfläche, wobei die Grundflächen von mindestens zwei Kulturkammern aneinander grenzen und durch mindestens ein Trennmittel voneinander getrennt sind. Hierdurch wird ein Verbund-Kulturgefäß mit min- destens zwei sich gegenüberliegenden Kulturkammern bereitgestellt, welches nach einer Befüllung mit insbesondere festen bzw. festwerdenden Nährmedien mindestens zwei sich gegenüberliegende Oberflächen aufweist, welche mit vorzugsweise unterschiedlichen Organismen separat beimpft bzw. bestückt werden können. Auf und/oder in diesen Nähr- medien können die Organismen wachsen und stehen miteinander in chemischem jedoch nicht in physischem Kontakt. Je nach Anwendungsfall können in den mindestens zwei Kulturkammern die gleichen oder verschiedene Nährmedien eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes umfasst das Trennmittel mindestens eine Trennwand, einen Trennring und/oder eine Trennfolie. Besonders bevorzugt ist, dass das Trennmittel eine oder mehrere Aussparungen bzw. Ausnehmungen aufweist, wobei im Fall von mehreren Aussparungen diese vorzugsweise gleichmäßig in der Fläche über das Trennmittel, also beispielsweise insbesondere über die Fläche der Trennwand oder der Trennfläche, verteilt sind.
Beispielsweise weist das erfindungsgemäße Kulturgefäß in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Form einer hohen Petrischale auf, bei der der Boden fehlt, und die durch eine Trennwand in zwei sich gegenüberliegende Kompartimente, oder Kulturkammern, geteilt ist. Diese Trennwand weist Ausnehmungen beziehungsweise Aussparungen auf, beispielsweise in Form von gleichmäßig verteilten runden oder anders geformten Löchern (z.B. Fig. 1 ). Beide sich gegenüberliegenden Kulturkammern werden vorteilhaft mit je einer Deckschale, die ein steriles Aufziehen ermöglichen, abgedeckt.
Durch die Ausnehmungen kann zwischen den in beiden Kulturkammern auf sich gegenüberliegenden Medienoberflächen wachsenden Organis- men der Austausch chemischer Substanzen stattfinden. Eine räumliche Trennung der beiden Organismen entsteht dabei vorwiegend aus dem Nährmedium an sich. Auswirkungen eines Organismus auf den anderen können auf eine Diffusion löslicher Substanzen durch das Nährmedium zurückzuführen sein. Die Anzahl, die Größe und die Verteilung der Aus- nehmungen bzw. das Vorhandensein oder das Fehlen eines Trennmittels bestimmt dabei die Diffusionsgeschwindigkeit der löslichen Substanzen zwischen den beiden Kulturkammern. Eine Variation dieser Parameter kann erfindungsgemäß für unterschiedliche Fragestellungen vorteilhaft ausgenutzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann an der Grenze zwischen den beiden Kulturkammern ein flacher Trennring angebracht sein, der mit seinem Außenrand an der inneren Seitenwand des Verbund-Kulturgefäßes befestigt ist und mit dem Innenrand ins Innere ragt (z.B. Fig. 3). Die Befüllung der beiden Kulturkammern des Verbund- Kulturgefäßes in dieser Ausführungsform mit einem fest werdenden Nährmedium erfolgt nacheinander.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kulturgefäßes ist das Trennmittel zumindest teilweise entnehmbar. Beispielsweise befindet sich an der Grenze zwischen den beiden Kulturkammern ein durch- gehender herausnehmbarer Einsatz und/oder eine durchgehende abziehbare Folie, welche der Trennwand anliegen kann und sie abdichtet (z.B. Fig. 4 A). Dieser Einsatz bzw. die Folie weist vorzugsweise eine Abziehhilfe auf, die das Abtrennen erleichtern soll. Zuerst erfolgt die Befüllung mit dem Nährmedium der Kulturkammer, die dem herausnehm- baren Einsatz bzw. der abziehbaren Folie gegenüberliegt (z.B. Fig. 4 B). Nach dem Erstarren des Mediums wird das Verbund-Kulturgefäß umgedreht, der Einsatz herausgenommen bzw. die Folie abgezogen (z.B. Fig. 4 C) und die zweite Kulturkammer mit dem Nährmedium befüllt (z.B. Fig. 4 D). Bei dieser Ausführung muss die Trennwand nicht notwendigerwei- se vorhanden sein. Der durchgehende Einsatz bzw. die durchgehende Folie können alleine die Funktion des Bodens beim Befüllen des Verbund-Kulturgefäßes mit dem Nährmedium übernehmen (z.B. Fig. 5). In diesem Fall findet nach dem Entfernen des Einsatzes bzw. der Folie der Austausch chemischer Substanzen über die gesamte Kontaktfläche zwi- sehen den Nährmedien in den beiden Kulturkammern statt. Bei einigen Tests kann eine schnelle ungehinderte Diffusion von löslichen Substanzen sogar gewünscht sein. Des Weiteren bietet sich dadurch die Möglichkeit, in ihrer Zusammensetzung unterschiedliche Nährmedien zu verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes ist das Trennmittel netzartig oder gitterartig ausgebildet (z.B. Fig. 2). Hierbei kann das Trennmittel mehr oder weniger flexibel gestaltet sein, beispielsweise als relativ unflexibles Gitter aus Kunststoff oder anderem Material oder aber als flexibles Netz. Ein solches netzartiges oder gitterartiges Trennmittel hat vorzugsweise die Funktion, dem Nähr- medium der Kulturkammern eine Stütze zu bieten, und dabei einen Austausch chemischer Substanzen durch das Nährmedium im wesentlichen nicht zu beeinflussen bzw. zu behindern. Je nach Fragestellung der mit dem erfindungsgemäßen Kulturgefäß durchzuführenden Versuche oder beispielsweise auch in Abhängigkeit von der Stabilität des ver- wendeten Nährmediums können die Netz- bzw. Gitterstrukturen feiner oder gröber gewählt sein. Während der Befüllung der Kulturkammern bzw. der ersten Kulturkammer kann das netzartige oder gitterartige Trennmittel mit einer Folie, insbesondere einer abziehbaren Folie, versehen sein. Diese Folie dient insbesondere der Abdichtung des Trenn- mittels und kann nach dem Erstarren des Mediums entfernt werden. Anschließend kann die zweite Kulturkammer mit Medium befühlt werden, wie es bereits beispielhaft ausgeführt wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemä- ßen Kulturgefäßes weist mindestens eine der Kulturkammern mindestens eine abnehmbare Seitenfläche auf, insbesondere mindestens einen abnehmbaren bzw. aufsetzbaren Ring. Figur 6 A zeigt eine mögliche Ausgestaltung dieser Ausführungsform, bei welcher an der Seitenwand einer der Kulturkammern zusätzlich ein aufsetzbarer bzw. abnehmbarer Ring angebracht ist. Bei dieser Ausführungsform können vorteilhafterweise beide Kulturkammern des Verbund-Kulturgefäßes in einem Schritt mit dem Nährmedium befüllt werden. Vor einer Befüllung mit dem Nährmedium wird der Ring abgenommen und das Verbund-Kulturgefäß auf eine sterile Unterlage positioniert, die eine geeignete Abdichtung gewährleistet (z.B. Fig. 6 B). Das Medium fließt beim Befüllen in beide Kulturkammern, wobei die untere Kulturkammer bis zum Rand gefüllt wird. Nach dem Erstarren des Mediums wird das Verbund-Kulturgefäß umgedreht und der Ring an die bis zum Rand gefüllte Kulturkammer wieder aufgesetzt (z.B. Fig. 6 C), um insbesondere als Abstandhalter ein Abdecken des Verbund-Kulturgefäßes mit beispielweise einer Deckschale zu ermöglichen (z.B. Fig. 6 D).
In einer weiteren Ausführungsform des Kulturgefäßes befindet sich in der unteren Kulturkammer in einem Abstand zu ihrem Rand, beispielsweise auf etwa halber Höhe, ein durchgehender herausnehmbarer Einsatz oder eine durchgehende abziehbare Folie, welche das Kulturgefäß abdichtet und gleichzeitig einen Abstand zum unteren Rand gewährleistet. Auf diese Weise können ebenfalls beide Kulturkammern in einem Arbeitsschritt befüllt werden. Die Mediumoberfläche der unteren Kulturkammer wird nach dem Erstarren des Mediums durch Abziehen der Folie, beziehungsweise durch Herausnehmen des Einsatzes zugänglich (z.B. Fig. 7).
Je nach der Fragestellung der mit dem erfindungsgemäßen Kulturgefäß durchzuführenden Versuche und nach der Art der Organismen kann es bevorzugt sein, dass die einzelnen Kulturkammern eine vergleichbare Größe bzw. ein vergleichbares Volumen aufweisen. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, dass beispielweise eine der Kulturkammern ein größeres Volumen als die andere Kulturkammer aufweist. Dies kann z.B. für die Dualkultur einer Pflanze einerseits zusammen mit Mikroorganismen andererseits vorteilhaft sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes weist mindestens eine Seitenfläche mindestens einer der Kulturkammern eine oder mehrere Aussparungen bzw. Ausnehmungen auf. Insbesondere kann sich eine solche Aussparung oder solche Aussparungen in dem Randbereich befinden, welcher der Grundfläche abgewandt ist. Eine derartige Ausführungsform ist vor allem zum Aufziehen einer Dualkultur geeignet, bei der mindestens einer der Organis- men eine Pflanze ist. Hierbei ist es insbesondere vorteilhaft, wenn am Außenrand der Seitenwand mindestens einer der sich gegenüberliegenden Kulturkammern und/oder der Deckschale eine Ausnehmung bzw. Aussparung vorhanden ist (z.B. Fig. 8). In diese Ausnehmung kann dann der Spross des heranwachsenden Pflanzenkeimlings platziert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Verbund-Kulturgefäß vorteilhafterweise im wesentlichen aus Kunststoff. Besonders bevorzugt wird als Material Polystyrol verwendet, das bei der Herstellung herkömmlicher Petrischalen Anwendung finden kann. Auch andere Materialien sind möglich (Polypropylen, Glas, etc.).
In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kulturgefä- ßes ist die Grundfläche mindestens einer der Kulturkammern rund, oval oder eckig. Vorteilhafterweise weisen beide bzw. alle Grundflächen der Kulturkammern eines Kulturgefäßes die gleiche Form der Grundfläche auf. In besonders bevorzugter Weise entsprechen die Abmessungen der Grundfläche mindestens einer der Kulturkammern im wesentlichen den Abmessungen üblicher Petrischalen. Auch kann das erfindungsgemäße Kulturgefäß die äußere runde Form und den Durchmesser einer herkömmlichen Petrischale aufweisen. Dies hat zum einen den Vorteil, dass eine im Laboralltag etablierte Handhabung von Kulturgefäßen auf die erfindungsgemäßen Kulturgefäße übertragen werden kann, beispiels- weise im Hinblick auf die Konzentrationen und Volumina von Nährmedien, Lösungen etc.. Anderseits können Materialien und Gerätschaften für die erfindungsgemäßen Kulturgefäße verwendet werden, welche auf herkömmliche Kulturgefäße, insbesondere Petrischalen, ausgerichtet sind. Das erfindungsgemäße Kulturgefäß kann jedoch insbesondere ab- hängig von der konkreten Fragestellung des durchzuführenden Versuches auch eine andere, beispielsweise eine rechteckige Form, haben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes weist mindestens eine der Kulturkammern mindestens ein Abdeckmittel auf. In besonders vorteilhafter Weise sind beide Kulturkammern bzw. alle Kulturkammern mit einem Abdeckmittel verse- hen. Ein solches Abdeckmittel kann ein steriles Aufziehen der Organismen erleichtern bzw. ermöglichen. Als Abdeckmittel kann beispielsweise eine Folie oder Vergleichbares vorgesehen sein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, eine bzw. mehrere Deckschalen als Abdeckmittel einzusetzen. Derartige Abdeckmittel können an dem Kulturgefäß fixiert wer- den, was je nach räumlicher Ausrichtung des Kulturgefäßes vorteilhaft sein kann. Ein solches Fixieren oder Befestigen des Abdeckmittels kann ebenfalls der Sterilität bzw. der Kontaminationsfreiheit der Organismen in dem erfindungsgemäßen Kulturgefäß förderlich sein. Eine Fixierung kann beispielsweise durch ein geeignetes Umwickeln mit Parafilm o.a. erfolgen oder auch durch Klemmeinrichtungen oder Vergleichbares.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes ist das Gefäß als Einwegeinheit ausgebildet, insbesondere als sterile Einwegeinheit. Dies hat den Vorteil, dass das Kultur- gefäß beispielsweise einer entsprechenden sterilen Verpackung entnommen werden kann und ohne weiteres dem Anwender zur Verfügung steht.
In ein weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Kultur- gefäß mit Nährmedien, insbesondere mit festen Nährmedien, befüllt, wobei mindestens zwei im wesentlichen feste Oberflächen auf den Grundflächen der Kulturkammern bereitgestellt werden, die vom Anwender mit entsprechenden Organismen bestückt bzw. beimpft werden können. Vorteilhafterweise wird ein solches bereits befülltes Kulturgefäß in sterilisierter Form bereitgestellt und kann somit als „Ready-to-use" Einwegeinheit eingesetzt werden. Die Wahl der hierbei verwendeten Nährmedien hängt insbesondere von den zu kultivierenden Organismen ab. So können beispielsweise für die Kultivierung von Mikroorganismen oder Bakterien andere Medien als für die Kultivierung von pflanzlichen Zellen oder ganzen Pflanzen bzw. Pflanzenteilen vorteilhaft bzw. erforderlich sein.
Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Kultur von mindestens zwei vorzugsweise unterschiedlichen Organismen in dem bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Kulturgefäß, wobei die Organismen im chemischen jedoch nicht im physischen Kontakt zueinander stehen. Das Wachstum bzw. der Stoffwechsel der Organismen findet in den beiden sich gegenüberliegenden Kulturkammern des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes statt. Dieses Verfahren umfasst zunächst die Bereitstellung mindestens eines Kulturgefäßes gemäß der obigen Beschreibung. Dieses Kulturgefäß, welches vorteilhafterweise in steriler Form vorliegt, wird gegebenenfalls mit geeigneten Nährmedien befüllt, wobei mindestens zwei im wesentlichen feste Oberflächen auf den Grundflächen der Kulturkammern gebildet werden. Bei der Verwendung von Kulturgefäßen, die wie oben beschrieben bereits mit Nährmedium befüllt sind, entfällt selbstverständlich dieser Schritt. In folgenden können diese Nähr- medien, insbesondere diese Ober lächen, mit jeweils unterschiedlichen Organismen beimpft und/oder bestückt werden. Anderseits ist es auch möglich, dass die Organismen mit den Nährmedien beim Gießen der Nährmedien in das Kulturgefäß bzw. in die Kulturkammern eingebracht werden. Dies hängt von der Art und der bevorzugten Wachstumsweise der eingesetzten Organismen ab. Anschließend kann ein Kultivieren der Organismen erfolgen. Je nach Fragestellung des durchzuführenden Versuchs kann jedoch auch ohne ein weiteres Kultivieren mit der entsprechenden Versuchsdurchführung begonnen werden.
Besonders bevorzugt kaηn mit dem erfindungemäßen Verfahren eine Dualkultur von Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, von Pilzen, Protozoen, pflanzlichen und/oder tierischen Zellkulturen und/oder Pflanzen oder Pflanzenteilen durchgeführt werden. Vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. das erfindungsgemäße Kulturgefäß für mikrobiologische, zellbiologische und/oder pflanzenbiologische Untersuchungen eingesetzt werden.
Im Vergleich zu herkömmlichen Vorrichtungen weist das erfindungsgemäße Kultursystem den entscheidenden Vorteil auf, dass beim Wachstum in unterschiedlichen Kulturkammern des erfindungsgemäßen Verbund-Kulturgefäßes die Organismen zu keiner Zeit in einem physischen Kontakt zueinander stehen. Es kommt auch bei längerer Kulturdauer nicht zur Durchmischung der beiden Organismen, wie dies bei herkömmlichen Vorrichtungen häufig der Fall ist. Das erfindungsgemäße Kultursystem ist somit bestens für eine Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Organismen geeignet, die auf einem Austausch lösli- eher Substanzen basieren. Besonders bevorzugt kann das erfindungsgemäße Kultursystem in der Agrarindustrie, Forstwirtschaft, medizinischen Labordiagnostik, der Arznei- oder Pflanzenschutzmittel- Entwicklung, der Qualitätskontrolle oder der Forschung und Entwicklung verwendet werden.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. In den Figuren zeigen:
Fig. 1 : Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes mit einer Trennwand 3, die das Kulturgefäß in zwei sich gegenüberliegende Kulturkammern 1 und 2 teilt, mit Ausnehmungen in Form von gleichmäßig verteilten runden oder anders geformten Löchern 4 und mit zwei Deckschalen 5a und 5b; Fig. 2: Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes mit einer Trennwand 6, die als Netz bzw. Gitter gestaltet ist, und die das Kulturgefäß in zwei sich gegenüberliegende Kulturkammern 1 und 2 teilt;
Fig. 3: Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem an der Grenze zwischen den beiden Kulturkammern ein flacher Trennring 7 angebracht ist, der das Kulturgefäß in zwei sich gegenüberliegende Kulturkammern 1 und 2 teilt;
Fig. 4: A. Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem an der Grenze zwischen den beiden Kulturkammern 1 und 2 ein durchgehender herausnehmbarer Einsatz oder eine durchgehende abziehbare Folie 8 mit einer Abziehhilfe 9 ange- bracht ist; B. Befüllung mit dem Nährmedium der ersten Kulturkammer 1 ; C. Umdrehen des Kulturgefäßes und Entfernen des Einsatzes bzw. der Folie 8; D. Befüllen der zweiten Kulturkammer 2 mit dem Nährmedium;
Fig. 5: Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem an der Grenze zwischen den beiden Kulturkammern 1 und 2 statt einer Trennwand eine Folie 8 mit Abziehhilfe 9 vorhanden ist;
Fig. 6: A. Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem an der Seitenwand einer der Kulturkammern zusätzlich ein aufsetzbarer bzw. abnehmbarer Ring 10 angebracht ist; B. Für eine Befüllung mit dem Nährmedium wird der Ring 10 abgenommen und das Verbund-Kulturgefäß auf eine sterile Unterlage 11 positioniert, C. Nach dem Erstarren des Mediums wird der Ring 10 an die bis zum Rand gefüllte Kulturkammer wieder aufgesetzt; D. Die beiden Kulturkammern werden mit Deckschalen 5a und 5b abgedeckt; Fig. 7: Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem in der unteren Kulturkammer 2 ein durchgehender herausnehmbarer Einsatz oder eine durchgehende abziehbare Folie 8 in einem Abstand zum unteren Rand angebracht ist;
Fig. 8: Schematische Darstellung eines beispielhaften Verbund- Kulturgefäßes, bei dem am Außenrand der Seitenwand der Kulturkammer und der Deckschale eine Ausnehmung 12 vorhanden ist;
Fig. 9: Untersuchung des Einflusses bakterieller Stoffwechselprodukte auf die Bildung von Feinwurzeln der Fichte mit Hilfe einer Dualkultur in einem beispielhaften Verbund-Kulturgefäß: nach 12 Wochen Dualkultur.
Ausführungsbeispiel
Dualkultur von Bakterien und Pflanzen: Bakterieller Einfluss auf die Bildung von Feinwurzeln
In einem erfindungsgemäßen Verbund-Kulturgefäß mit einer Ausnehmung bzw. einem Schlitz nach Fig. 8 wurde der Einfluss bakterieller Stoffwechselprodukte/Exsudate auf die Bildung von Feinwurzeln der Fichte untersucht.
Auf die obere Agaroberfläche des Verbundgefäßes wurde, vor dem Einsetzen der Pflanzen, ausgekochte und sterilisierte Cellophanfolie aufgelegt um ein Einwachsen der Wurzeln in das Festmedium zu verhindern. Fichtenkeimlinge aus einer Vorkultur wurden sodann in die Petrischalen überführt. Die Wurzeln der Pflanzen lagen der Cellophanfolie auf, der Spross der Pflanzen ragte durch den Schlitz aus der Petrischale heraus (Fig. 9). Um die Pflanzen in Position zu halten, wurden die Wurzeln mit einem sterilen Aktivkohlefilter bedeckt und dieser mit zwei sterilen Zahnwatterollen und dem Deckel fixiert. Die verbleibende Öffnung zwischen dem Spross und dem Gefäßrand wurde mit autoklaviertem Silikonfett abgedichtet und die Kulturkammer mit Parafilm verschlossen.
Die gegenüberliegende Agaroberfläche der Kultursysteme wurde mit durchschnittlich 5 x 105 koloniebildenden Einheiten eines zu untersuchenden Bakterienstammes aus der Gattung Streptomyces beimpft. Im Wesentlichen waren die Pflanzen und die Bakterien durch die etwa 1 ,5 cm dicke Schicht des gemeinsamen Nährmediums voneinander ge- trennt. Figur 9 zeigt ein solchermaßen bestücktes Verbund-Kulturgefäß mit Blick auf die untere, mit Bakterium beimpfte Kulturkammer.
Die Kulturkammer mit dem Bakterium wurde ebenfalls mit Parafilm verschlossen und die Kultursysteme senkrecht in PVC-Ständem in Kunst- Stoffgewächshäusern aufgestellt. Die Gewächshäuser wurden in einer Klimakammer bei 20°C für 16 h pro Tag mit 120 μE rτϊ2 s_1 belichtet. Zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit wurden in den Boden der Gewächshäuser in regelmäßigen Abständen ca. 250 ml destilliertes Wasser gegeben.
Tabelle 1
Anzahl der Feinwurzeln je Fichtenkeimling Steigerung Kontrollpflanzen ± Pflanzen aus Dualkultur ±SE [%] SE* 67 ±6,6 151 ±10,1 Ϊ25
*= Standard-Error
Jeweils 12 parallele Experimente wurden mit dem Bakterienisolat be- schickt und 12 weitere ohne dieses als Kontrolle genutzt. Die Kulturkammern wurden wöchentlich auf Kontamination hin überprüft. In den 3 Monaten Untersuchungszeit konnten keine Kontaminationen und Durchmischungen der beiden Kulturen festgestellt werden. Nach 3 Mo- naten Kultur der Fichten in den Verbundgefäßen wurden die Pflanzen geerntet und unter dem Binokular die Gesamtanzahl der gebildeten Feinwurzeln je Pflanzenkeimling bestimmt. Wie in Tabelle 1 dargestellt, hatte das Bakterienisolat einen signifikanten Einfluss auf die Bildung von Feinwurzeln.
Da die beiden Organismen während der gesamten Kulturdauer physisch voneinander getrennt waren, kann dieser Einfluss auf Substanzen zurückgeführt werden, die von dem Bakterienisolat an das Nährmedium abgegeben worden waren, durch Diffusion in das Pflanzenkompartiment gelangten und dort den beobachteten Effekt bewirkten.

Claims

Ansprüche
1. Kulturgefäß zur Dualkultur von Organismen mit mindestens zwei Kulturkammern mit jeweils einer Grundfläche und mindestens ei- ner Seitenfläche, wobei die Grundflächen von mindestens zwei Kulturkammern aneinander grenzen und durch mindestens ein Trennmittel voneinander getrennt sind.
2. Kulturgefäß nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel mindestens eine Trennwand, einen Trennring und/oder eine Trennfolie umfasst.
3. Kulturgefäß nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel eine oder mehrere Aussparungen aufweist, wobei vorzugsweise die mehreren Aussparungen gleichmäßig verteilt sind.
4. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel zumindest teilweise ent- nehmbar ist.
5. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel eine Abziehfolie ist oder mindestens eine Abziehfolie umfasst, wobei vorzugsweise die Ab- ziehfolie eine Abziehhilfe aufweist.
6. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel netzartig oder gitterartig ist.
7. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Kulturkammer mindestens eine abnehmbare Seitenfläche, insbesondere mindestens einen abnehmbaren Ring, aufweist.
8. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Seitenfläche mindestens einer Kulturkammer mindestens eine Aussparung aufweist, wobei vorzugsweise die Aussparung im von der Grundfläche abgewandten Randbereich angeordnet ist.
9. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturgefäß im wesentlichen aus Kunststoff, insbesondere aus Polystyrol, besteht.
10. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundfläche mindestens einer der Kulturkammern rund, oval oder eckig ist.
11. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abmessungen der Grundfläche mindes- tens einer der Kulturkammern im wesentlichen den Abmessungen einer üblichen Petrischale entsprechen.
12. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Kulturkammern min- destens ein Abdeckmittel, insbesondere eine Deckschale, aufweist.
13. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturgefäß eine Einwegeinheit ist, ins- besondere eine sterile Einwegeinheit.
14. Kulturgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturgefäß mit Nährmedien unter Ausbildung von mindestens zwei im wesentlichen festen Oberflächen auf den Grundflächen der Kulturkammern befüllt ist.
15. Verfahren zur Kultur von mindestens zwei vorzugsweise unterschiedlichen Organismen, die in chemischem, jedoch nicht in physischem Kontakt miteinander stehen, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: - Bereitstellen mindestens eines Kulturgefäßes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, gegebenenfalls Befüllen mit Nährmedien zur Bildung von mindestens zwei im wesentlichen festen Oberflächen auf den Grundflächen der Kulturkammern, - Beimpfen und/oder Bestücken der Nährmedien, insbesondere der Oberflächen, mit jeweils unterschiedlichen Organismen und gegebenenfalls Kultivieren der Organismen.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Organismen Mikroorganismen, Pilze, pflanzliche und/oder tierische Zellkulturen und/oder Pflanzen sind.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, dadurch gekenn- zeichnet, dass es für mikrobiologische, zellbiologische und/oder pflanzenbiologische Untersuchungen eingesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es in der Agrarindustrie, Forstwirtschaft, medizini- sehen Labordiagnostik, Arznei- oder Pflanzenschutzentwicklung, Qualitätskontrolle und/oder Forschung und Entwicklung eingesetzt wird.
19. Verwendung mindestens eines Kulturgefäßes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 für mikrobiologische, zellbiologische und/oder pflanzenbiologische Untersuchungen.
20. Verwendung mindestens eines Kulturgefäßes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 in der Agrarindustrie, Forstwirtschaft, medizinischen Labordiagnostik, Arznei- oder Pflanzenschutzentwicklung, Qualitätskontrolle und/oder Forschung und Entwicklung.
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