DE2360384B2

DE2360384B2 - Mikrokapseln im Nanometergrößenbereich und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2360384B2
Application number: DE2360384A
Authority: DE
Inventors: Gerd Dr. Aesch Birrenbach; Peter P. Prof. Dr. Forch Speiser
Original assignee: SPEISER PETER P PROF DR FORCH (SCHWEIZ)
Current assignee: SPEISER PETER P PROF DR FORCH (SCHWEIZ)
Priority date: 1972-12-04
Filing date: 1973-12-04
Publication date: 1979-11-08
Also published as: SU529804A3; JPS4986525A; AU6297773A; FR2208716B1; US4021364A; DE2360384C3; DD110181A5; CH594444A5; BE808034A; AR199710A1; ZA739171B; NL7316576A; DE2360384A1; BR7309505D0; ES420930A1; FR2208716A1; GB1436355A

Description

Bekannte Mikrokapseln mit einem Durchmesser im Bereich von z.B. 0,1 — 1 mm, die flüssige oder feste Stoffe enthalten, werden für medizinische und technische Zwecke verwendet, beispielsweise für die Applikation durch die Haut oder Schleimhaut, zur Geschmacksmaskierung Ditterer Medikamente, für magensaftresistente Umhüllungen, /um Schutz von Wirkstoffen gegenüber Umgebungseinflüssen oder zur Einkapselung vo>' Klebstoffen, welche durch Druck oder Temperatur aktiviert werden können, für die Herstellung von Apiplikationsformen von Schädlingsbekämpfungsmitteln mit Depotwirkung und für die Verkapselung von Farbstoffen und Farbbildern. So ¹St aus der GB-PS IO 6:! 919 die Herstellung von submikroskopischen Polymerteilchen bekannt, die eine flüssige Farbmasse enthalten und an den Berührungspunkten der Teilchen miteinander verschmolzen sind, so daß sie für druckempfindliche Durchschreibpapiere Verwendung finden können. Das Wandmaterial von Mikrokapseln besteh I aus polymerem, mehr oder weniger wasserunlöslichem Material, z. B. Gelatine oder meistens aus synthetischen Polymeren. Die Mikroverkapselung kann auch als Aufbauumhüllung in rotierenden Kesseln, Tellern, Scheiben oder Walzen sowie im Wirbelschichtbett oder durch Sprühkondensation erfolgen.

Ein bekanntes viel angewendetes Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln ist die sogenannte »einfache« oder »komplexe« Koazervation (J. Pharm, Soc, 59, 1367 (1970), welche gewöhnlich in 4 Verfahrensschritten erfolgt: a) Herstellung einer Emulsion oder Suspension des einzukapselnden Stoffes in einer geeigneten Trägerflüssigkeit, welche bereits das Wandmaterial gelöst enthält; b) Erzeugung des Wandmaterials in Form kleiner Tröpfchen in dieser Suspension oder Emulsion durch Phasentrennung oder Zugabe einer weiteren Phase, wobei gegebenenfalls ein Dreiphasensystem gebildet wird; c) Umhüllung der einzukapselnden Phase durch die bei b) ausgeschiedenen Tröpfchen aus Wandphasenmaterial und d) Verfestigung der zunächst noch flüssigen Hülle. Während dieses gesamten Prozesses muß gerührt v/erden, um das Mehrphasensystem stabil zu halten. Die Bildung der Mikrokapseln erfolgt dabei in .-^r Regel durch Koazervierung von Gelsystemen, wie sie etwa in den schweizerischen Patentschriften 3 30 500 und 3 73 633, den deutschen Ausiegeschriften 12 56 194, 12 56 196, den deutschen Patentschriften Ii SO 347, 11 85 585 und 11 89 050, den amerikanischen Patentschriften 28 00 457, 28 00 458, 31 55 590 und 31 90 837, der britischen Patentschrift 10 16 839, den belgischen Patentschriften 6 99 324, 7 01 600 und 7 27 294 und der deutschen Offenlegungsschrift 19 28 552 beschrieben ist. Die Teilchengröße der nach diesen Verfahren hergestellten Mikrokapseln variiert zwischen einem Minimum von einigen Mikrometern und mehreren 100 Mikrometern und kann bis zu mehreren Millimetern reichen. Polymerpartikel mit einem Durchmesser zwischen 10 Mikrometern und 2 mm können z. B. durch Suspensionspolymerisation nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 10 81 228 erhalten werden.

In der DE-OS 22 22 697 sind Mikrokapseln beschrieben, die durch eine Pfropfpolymerisation erhalten werden, wobei zunächst eine Polymerisatumhüllung mit flüssigem polymerisierbaren Kernmaterial erfolgt, das dann polymerisiert wird, wobei eine Pfropfpolymerisation an die Polymerisatumhüllung eintritt. Diese Kapseln können einen mittleren Durchmesser zwischen 0,2 und 2,0 μιτι besitzen. Aus der DE-PS 10 96 038 sind Mikrokapseln mit einem Durchmesser von wenigen Mikron bis einigen Millimetern bekannt, die aus feinen Oeltröpfchen bestehen, die eine äußere feste Hülle aus filmbildender hydrophiler kolloidaler Substanz aufweisen. Die Anwendung derartiger Mikrokapseln in der Medizin ist beispielsweise auf die orale, kutane, epitheleale und enterale Verabreichung beschränkt.

Eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, diese Einschränkung bei der medizinischen Anwendung zu beseitigen und eine Kapselform im Nanometerbereich zur Verfügung zu stellen, die für viele Anwendungen wesentliche Vorteile besitzt.

Um eine gefahrlose parenteral, inklusiv intravenöse Verabreichung von therapeutisch wirksamen Partikeln sicherzustellen, muß deren Teilchendurchmesser bis auf wenige hundert Nanometer (10 ^ Meter) reduziert werden. Zur Herstellung der Mikrokapseln mi! einem Durchmesser in der Größenordnung kleiner als 200 Nanometer, vorwiegend unter 80 nm, bedurfte es eines grundsätzlich neuen Verfahrens.

Die kleinsten bisher bekannten Kunststoffpartikel werden erhalten durch Emulsionspolymerisation, bei der das gewöhnlich wasserunlösliche Monomere in wäßriger Phase emulgiert wird, die eigentliche Polyme-

risation jedoch nicht in den Monomerentröpfchen, sondern in der wäßrigen Phase erfolgt und bei welcher zum Schluß eine wäßrige Dispersion von kugelförmigen Polymerteilchen (Latexteilchen) mit einem Durchmesser von etwa 100 bis mehreren 1000 Nanometern vorliegen (Fikentscher et al, Angewandte Chemie, 72, Seiten 856-864 (19G0); Harkins, Journal of Polymer Science, VoL V, No. 2, Seiten 217 - 251 (1950)).

Ausgehend von den Erkenntnissen der Emulsionspolymerisation wurde eine auf den mizellaren Bereich ausgerichtete Polymerisationsmethode entwickelt, um die erfindungsgemäßen Mikrokapseln zu erhalten, deren Kapselwände aus polymerisierten hydrophilen Monomeren, vorzugsweise aus polymerisiertem Acrylamid, Ν,Ν'-MethyIen-bis-acrylamid, polymerisierter Acrylsäure und/oder deren Derivaten, bestehen und die einen Durchmesser im Nanometerbereich von 20—200 nm, vorzugsweise unter 80 nm, aufweisen und in Wasser kolloidal löslich sind und als Kapselinhalt biologisch oder pharmakodynamisch aktives Material enthalten. Die polymeren Kapselwände besitzen meist eine poröse Struktur.

Diese Mizellkapseln können dadurch hergestellt werden, daß man zunächst in einer hydrophoben oder hydrophilen Flüssigkeit zur Bildung mizellarer Reaktionsräume Tenside löst und dann im Falle der Verwendung einer hydrophoben Flüsigkeit Wasser und das einzukapselnde aktive Materia) bzw. dessen Lösung oder im Falle der Verwendung der hydrophilen Flüssigkeit ein hydrophobes Lösungsmittel und das einzukapselnde aktive Material bzw. dessen Lösung unter Rühren soluhi'isiert, worauf man die hydrophilen Monomeren einbringt und polymerisiert und die entstandenen Mikrokapseln isoliert. Man kann das Verfahren auch in der Weise abwa-.deln, daß man zunächst Monomere mit Lösungsmittel allein in die Hilfsstofflösung der hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeit einrührt und dann zu dieser solubilisierten Lösung eine Lösung des Wirkstoffs hinzufügt, worauf man die Polyrnerisierung durchführt und die Mikrokapseln isoliert. Als hydrophobe Flüssigkeit können Paraffine, insbesondere die niedrig siedenden Paraffine wie η-Hexan und n-Heptan, Äthyloleat, Rizinusöl oder andere pflanzliche Öle verwendet werden.

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung der Mikrokapseln entstehen mit Hilfe grenzflächenaktiver Hilfsstoffe (Tenside) winzige Mizellen in der Größenordnung von ca. 20-200 nm, die die polymerisationsfähigen Monomeren, die Wirkstoffe und eventuell weitere Hilfsstoffe enthalten und in einem relativ großen Volumen der hydrophoben Phase solubilisiert sind. Sie bilden kleinste Reaktionsräume für die anzuschließende Polymerisation der Monomeren. Diese kann nach an sich bekannten Methoden eingeleitet werden, wie sie z. B. in der deutschen Patentschrift 10 81 228 oder in den amerikanischen Patentschriften 28 80 152 und 28 80 153 beschrieben sind. Die Polymerisation ist dabei vorwiegend auf die Mi/.ellarräume beschränkt, da die hydrophobe Hauptphase kein polymerisationsfähiges Material enthält und auch eine Diffusion von Monomeren in und durch diese Phase weitgehend verhindert ist.

Zur Einhüllung von nichtwasserlöslichen Stoffen kann das System derart verändert werden, daß eine lipophile Phase mit dem gelösten Material und öllöslichen Monomeren in einer größeren Menge hydrophiler Flüssigkeit, meist Wasser, solubilisiert werden. In diesem Falle ist die Diffusion von Monomeren durch die hydrophile Phase weitgehend verhindert.

Im Gegensatz zur Emulsionspolymerisation, bei welcher in den meisten Fällen wasserunlösliche Monomere in Wasser polymeriseren, und bei welcher die radikalhaltigen, polymerisierenden Reaktionszentren anschwellen können auf ein Vielfaches ihrer ursprünglichen Größe — bedingt durch Diffusion von Monomeren aus deren Vorrat in den vorhandenen Emulsionströpfchen in die wachsenden Polymer-Monomer-Teilchen (Latex-Teilchen) — ist die »Mizeilpolyme-

K) risation« auf die in den Mizellen enthaltenen Monomeren beschränkt. Die Partikel bleiben daher extrem klein. Durch Variation von Monomeren und Vernetzungsmitteln, deren Konzentration, der Polymerisationsart und Katalysatoren, dem Verhältnis der hydrophoben zur

i> wäßrigen Phase und und Wahl der Tenside als Misellbildner, kann innerhalb der Mizellen eine gesteuerte Vernetzung, ein variables Polymergerüst und damit eine Beeinflussung der spezifischen Einkapselung des aktiven Materials erzielt werden.

in Nach Beendigung der Polymerisation wird durch Entfernen oder Einengen der äußeren Phase, z. B. durch Destillation, Ultrafiliraiiori oder Zentrifugierung, der feste Rückstand mit einem geeigneten Lösungsmittel — im allgemeinen mit einem wäßrigen Alkohol, z. B.

2> Methanol — verdünnt, wobei die gebildeten Polymerisatteilchen gewöhnlich ausfallen und dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren von löslichen Begleitstoffen und vom Emulgator abgetrennt und gewonnen werden kann.

so Alternativ dazu kann nach Einstellen der auspolymerisierten Lösung auf einen geeigneten Lösungsmittelgehalt die entstandene Suspension auch direkt ultrafiltriert und das Polymerisat isoliert werden. Das erhaltene Produkt zeigt in beiden Fällen in geeigneten Lösungs-

ii mitteln wieder kolloidales Verhalten. Es besteht, wie aus elektronenoptischen Bildern und Freigabeversuchen mit radioaktiv markiertem, einpolymerisiertem Gammaglobulin als Wirkstoff hervorgeht, aus polymeren Kügelchen von weniger als 200 nm, vorzugsweise unter 80 nm Durchmesser, in denen das aktive Material eingeschlossen ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln im Nanometerbereich, die biologisch oder pharmakodynamisch aktive oder brauchbare

ii Wirkstoffe enthalten, wird vorzugsweise in folgender Weise durchgeführt:

1. Die Tenside, welche die Solubilisierung von Wasser und wäßrigen Lösungen oder von lipophilem

.„ Material — gegeoenenfalls in geeigneten Lösungsmittel — in einer hydrophoben Flüssigkeit, bzw. in einer hydrophilen Flüssigkeit, ermöglichen, werden in der betreffenden Flüssigkeit gelöst, die die hydrophobe oder hydrophile äußere Phase bilden soll.

2. Zu der erhaltenen Lösung wird unter Rühren Wasser und das einzuschließende aktive Material oder die wässerige Lösung des aktiven Materials bzw. das lipophile aktive Material hinzugefügt und

„(i dann die Monomere des zu polymerisierenden Polymers eingetragen. Hierbei werden für die Verwendung in der Therapie Monomere verwendet, die ein gutverträgliches Polymer ergeben. Als wasserlösliche Monomere können insbesondere

hi Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und als öllösliche Monomere, vorzugsweise Acrylsäure + Acrylsäuremethylester, verwendet werden. Gegebenenfalls kann in dieser Verfahrensstufe

auch so verfahren werden, daß zunächst Wasser und Monomere allein in die hydrophobe emulgatorhaltige Flüssigkeit eingerührt wird, oder es werden lipophiles Lösungsmittel und lipophile Monomere in die hydrophile emulgatorhaltige -, Flüssigkeit eingetragen, worauf zu der erhaltenen Lösung dann erst die konzentrierte, gegebenenfalls kolloide, wässerige oder ölige Lösung des einzuschließenden aktiven Materials hinzugefügt wird.

3. Die in den solubilisierten, wasserhaltigen, bzw. '" ölhaltigen Mizellen gelösten Monomeren werden nun je nach anzuwendender Polymerisationstechnik — in an sich bekannter Weise polymerisiert, wobei der Verlauf der Polymerisation durch Titration des M.onomerengehaltes verfolgt werden '' kann.

4. Nach Beendigung der Polymerisation wird das erhaltene Polymerisat mit dem eingeschlossenen und adsorbierten, aktiven Material, gegebenenfalls jn nach Entfernen des Hauptanteils der Flüssigkeit der äußeren, d. h. kontinuierliche;: Phase, z. B. durch Abdestillieren im Vakuum, durch Ultrafiltration oder Zentrifugieren, isoliert. Durch Zusatz von geeigneten Lösungsmitteln, vorzugsweise mit was- r, serigem Alkohol, oder durch Aussalzen kann das Produkt auch ausgefällt werden.

Es wurde festgestellt, daß als Flüssigkeit für die hydrophobe Phase relativ kurzkettige n-Alkane am m besten geeignet sind. Sie sind praktisch wasserunlöslich, für die Solubilisierung von Wasser optimal und stellen selbst kein Lösungsmittel für die gewühlten Monomeren und die in Frage kommenden biologisch aktiven, hydrophilen Wirkstoffe wie Pharmaka oder das andere r. einzuschließende aktive Material dar. Sie sind außerdem inert, ungiftig und leicht wieder von dem erhaltenen Produkt zu entfernen.

Besonders geeignet sind n-Alkane, welche im VakLjrn einen Siedepunkt von weniger als O¹⁵C -i» aufweisen; das sind vor allem η-Hexan und n- Heptan.

Siedepunkt in ( bei:
10 Torr. 40 Torr.

100 Torr.

n-Hexan

n-llcptan

Wasser

-25
- 2,1
+ 11,3

- 2.3

+ 22.3

34.1

15,8
41,8
5 1.6

Ils wurde ferner festgestellt, daß die Kombination cinis geeigneten nichtionogenen Tcnsides mit einem ionogcnen Tensid zu einer wesentlich besseren Solubilisierung der wässerigen Phase führt. Mit Hilfe der Kombination kann eine wesentlich größere Menge Wasser mit geringerer Gesamtmenge an Emulgator in der organischen hydrophoben Phase solubilisiert werden.

Als nichtionogcne Tenside haben sich die Fettalkoholpolyglykoläthcr bewährt, z. B. Polyäthylenlauryläther mit durchschnittlich 4 Äthylenoxidgruppen in der Kette, und als ionogenes Tensid die Alkalisalze von höheren Sulfobcrnsteinsäure-bis-alkylestern, z. B. das Natriumsalz des Sulfobcrnsteinsäure-bis-2-äthylhcxylcstcr.

Für die F.inhüllung lipophiler Wirkstoffe hat sich eine solubilisiertc M! .chung aus Polyoxiäthylcniiorbiianmonoolcat. in beispielsweise Äthylolcat, Paraffin. Rizinusöl oder anderen Fettsäureestern mit Acrylsäurederivaten als Monomere, vorzugsweise Acrylsäure oder Acrylsäuremethylester sowie gegebenenfalls auch mit Vinylderivaten in Wasser bewährt.

Die Polymerisation der Monomeren erfolgt nach an sich bekannten Methoden, eventuell nach Zusatz von Katalysatoren oder Polymerisationsinitiatoren, durch Bestrahlung oder durch Kombination chemischer mit physikalischen Methoden, wie sie z. B. in den amerikanischen Patentschriften 28 75 047,28 80 152 und 28 80 153 und der deutschen Patentschrift 10 81 228 beschrieben sind.

Bei der Wahl des Polymerisationsverfahrens und besonders bei der Dosierung der entsprechenden Maßnahmen muß jedoch Rücksicht auf das einzuschließende Material genommen werden. Dieses darf durch das angewandte Verfahren nicht in nennenswertem Ausmaß geschädigt werden. Zu diesem Zwecke sind im Einzelfalle gewisse Anpassungen des Verfahrens vorzunehmen. So ist zu berück.r .htigen, daß biologisches Material, wie beispielsweise Antigene, aus empfindlichen Proteinen bestehen, welche beim Erhitzen über 55°C, bei einem pH von weniger als 2,5 oder durch die Einwirkung von Oxydationsmitteln, aus denen die üblichen Polymerisationskatalysatoren bestehen, /erstört werden kann.

Es wurde weiterhin festgestellt, daß in diesen Fällen eine nur minimale Schädigung der Proteine eintritt, wenn die Polymerisation, wahlweise nach einem der folgenden Verfahren durchgeführt wird. Eine geeignete Methode ist die γ-Bestrahlung, z. B. mit einer ^ÖOCo-Quel-Ie, wobei gewöhnlich 0,3 Grad genügen. Hierbei kann im Falle von nicht oxydationsempfindlichem Material auch ein wasserlöslicher Radikalbildner, wie z. B. ein Persulfai. als Polymerisationskatalysator verwendet werden. Dann führt Bestrahlung mit sichtbarem Licht zur Polymerisation, z. B. 300 Watt Glühlampe während ca. 7 Stunden und Riboflavinzusntz (<\i. 0.01%) als Sensibilisator, und gegebenenfalls Kaliumpersulfat-Zusatz ist geeignet. Im Falle der UV Strahlenverträglichkeit kann auch mit ultraviolettem Licht polymerisiert werden; hier wirkt solubilsiertes Protein sogar beschleunigend auf die Polymerisationszeit. Die Dauer der UV-Bestrahlung mit 70 Watt Tauchlumpe bei vorwiegender Wellenlänge : 366 nm bcirägt ca. 45 Minuten bei Anwesenheil von Protein, sonst ca. 3 Stunden. Alle diese Polymerisationsarten verlangen eine Stickstoffatmosphäre und können bei 30" + 5° und bei wählbarem pH durchgeführt werden.

Nach erfolgter Polymerisation kann die Flüssigkeit der hydrophoben Phase durch Destillation im Vakuum entfernt werden, falls sich die Anwesenheit dieser bei der weiteren Aufarbeitung als nachteilig erweisen sollte. Es bildet sich ein Azeotrop aus der verwendeten hydrophoben Flüssigkeit, z. B. aus η Hexan und Wasser, welches eine sehr schonende Destillation bei Raumtemperatur oder je nach Vakuum sogar schon bei O⁰C erlaubt. Die Gewinnung der Mizcllkapscln mit eingeschlossenen aktivem Material erfolgt bei nicht cmpfii.dlichem Wirkstoff gewöhnlich direkt durch Ausfällen mit organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol und anschließende Ultrafiltration oder Filtration über Membranfilter und. falls erwünscht, Vakuumtrocknung des Filterrückstandes. Alternativ ist die Abtrennung des Produktes auch durch Zentrifugalion möglich.

Bei Anwesenheit von beispielsweise labilen Proteinen wird mit wässerigem Methanol (40% V/V) in der Kühe

ausgefällt und mittels Membranfilter eine Ultrafiltration unter Überdruck durchgeführt. Gegen Ende der Filtration — nach völliger Entfernung der Emulgatoren, der hydrophoben Phase und des größten Teils der methanolischen Lösung wird der Filterrückstand mit Wasser auf einen Methanol-Gehalt von ca. 5% verdünnt und anschließend lyophilisiert.

Mit Hilfe des erfindungsgernäßen Verfahrens werden Mikrokapseln im Nanometergrößenbercich mit einer engen Teilchendurehmesserverteilung erhalten. Der Durchmesser der Mikrokapseln (für das Elektron-Scanning-Verfahrcr mit Gold bedampft) liegt durchschnittlich bei 800 Λ 180 um), wie die scanning photos /eigen. Die untere Tcilchendurchmesscrgrcn/c beträgt 350 —200 Λ (3d — 20 nm). wie eine Testfiltration mittels Membranfilter (350 —200 Λ) gezeigt hat. Wegen der extrem kleinen Dimensionen sind die erhaltenen Mikrokapseln mit dem eingeschlossenen und adsorbierten aktiven Material in *Vj^:.ser kolloidlöslich. Dies eröffnet ganz neue An^Bildungsmöglichkeiten von therapeutischen Wirkstoffen. Insbesondere erlaubt diese Methode die gefahrlose parenteralc Verabreichung, inklusive unter Umständen der intravenösen Injektion, von biologisch und pharmakodynamiseh aktivem Material, wobei je nach Wahl der Mengenverhältnisse zwischen Trägerstoff und aktivem Material, ein mehr oder weniger großer Teil des aktiven Materials in der Netzstruktur der polymerisieren Mizellen mehr oder weniger stark eingeschlossen und adsorbier! ist oder auch teilweise frei und sogleich wirksam vorliegen kann. Damit ist eine gesteuerte Langzeittherapie mit nur einer einzigen Applikation ermöglicht, wobei der Organismus immer nur mit einem Minimum von biologisch oder pharmakodynamiseh aktivem Produkt belastet wird. Außerdem kann unter gewissen Bedingungen das netzartig umhüllte Material auch direkt zur Wirkung gelangen: dies gilt besonders bei Antigcncn. Auf diese Weise kann ganz besonders hei Impfstoffen eine optimale Adjuvans-Wirkung erzielt werden. Dem Organismus wird über sehr lange Zeit eine äußerst geringe Menge von Antigenen angeboten, wodurch das retikuloendotheliale System ständig zur Antikörpcrbildung angeregt wird. Daraus resultiert ein stabiler hoher Antikörpertiter und im Endeffekt eine langanhaltende Immunität.

Nicht jedes beliebige aktive Material — Protein. Pharmakon, Schädlingsbekämpfungsmittel, Fertilizer, Farhstoff — ist für die Einbettung in die erfindungsgemäß erhaltenen Mizcllnctzstrukturcn in gleicher Weise geeignet. Voraussetzung sind jeweils eine bestimmte Molekulargrößc und insbesondere die Fähigkeit, mindestens kolloide, wässerige oder ölige Lösungen bilden zu können, da bei der Herstellung die Einbettung in die Mikrokapseln erfolgt, wenn die Wirkstoffe sich in den Mizellen befinden. GuI eignen sich mindestens noch kolloid wasserlösliche oder öllösliche Stoffe mit Molekulargewichten bis zu ca. 1 50 000.

In vitro konnte für den Fall von radioaktiv markiertem Human-Gammaglobulin in Mizellkapsnln über einen Zeitraum von 50 Tagen in einer bewegten Phosphatpufferlösung bei 37"C eine von Beginn der Messung an unveränderte Freigabe von nur ca. 20% des Gammaglobulins beobachtet werden, was zeigt, daß der größie Teil des Wirkstoffs gut eingekapseli worden ist.

Andererseits zeigen Resultate mit Gammaglobulin in Immunisierungsversuch in vivo an Meerschweinchen, daß sehr bald ho'ie und relativ lang andauernde Antikörpertiter erhalten werden.

In den folgenden Tabellen sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen mit herkömmlichem Aluminiumoxid-Adjuvans (Tabelle 1) und mit Frcundschem komplettem Adjuvans (Tabelle 2) gezeigt unter Verwendung von Human-Gammaglobulin. Die Tabelle 3 zeigt Antitoxin Titer, wie sie nach Immunisierung von Meerschweinchen mit verschiedenen Tetanus-Toxoid Präparaten erzielt wurden.

T.ibelle 1

Gruppe ' Präpaiierung

! Dosierung j Impl^che
!(hezoEon I (Vaccina-ι auf InCiI ι tion-itaee)

Mittlerer Titer (I lamagglutinations-Mikra-I teclinik)

Anzahl der Tierc/Standardahwcichung

Kommentar

4

IgCi-Ausgangsmaterial

tU mg/kg

(I

14

+

1.
Blutung

2.
Blutung

3.
Blutung

4.
Blutung

Blutung

Booster 1 -3
wie primär
Vaccinat.

;

5

igG-Ausgangsmaterial

0.3 mg/kg

1 :4
9/

1:2.2
8/

1:6.4
8/40

1:1.2
8/61

1 :6.1
8 / 736

2
i
i

IgG-Ausgangsmaterial
+ Al-oxid (4 mg/ml)

0.3 mg/kg

+

1 : 16
10/

I :2
10/

1:9.1
10/1.6

1 : 1.4
7/1.2

1 -AA
7/56

I

IgG einpolymerisiert

0.3 mg/kg

+

1 :16
8/

I :32
8/

1 :3.6
7/46

1:2.1
6/11

I : 113
6/5.6

IgCi einpolymerisiert

0.3 mg/kg

+

i.8
4/

1 :3.5
4/

1 :3.4
3/1.5

! : 170
3/1,7

1. Booster
wie primär
Vaccinat.

J-

I : 16
4/

I :'y'i
4/

I :Xi
3/8.4

:8
/

1:512
1/

ίο

I-'ortscl/tiiU!

Gruppe

Pr.iparierung

Dosierung
(bezogen
auNgG)

lni|
(Va
tion
0

l'sch
jcini
stag
14

ema
:)
22

72

Mittlerer
lcehnik)
Anzahl ü(
1.
Blutung

Filer (lliii
:r Tiere/S
2.
Blutung

nagglutina
andardabv
3.
Blutung

tions-Mik
veichung
4.
Blutung

ro-
5.
Blutung

Kommentiir

6
7
8

IgG einpolymerisiert

0,3 mg/kg

+
I-

+

f
I

1 :64
5/
I : 256
5/

1:2,4
5/

1:88
5/13

I :8,2
5 / 7,6

1:256
2/0

I. Booster
mit IgG-
Ausg.-Mat.

9

IgCi einpolymerisiert

1 mg/kg

I

f

1 :64
5/

1 : 95
5/

1 :37
5/25

1 :2(i
5 / 6.3

I: 1740
4/6,0

IO

IgCi einpolymerisiert

I nig/kg

+

f

t-

I : 128
5/

I 64
5/

1 :320
5 /1,3

I : 16
4/1,4

1:85
4/23

1. Booster
wie primär
Viicunai.

IgG einpolymerisiert

1 mg/kg

1 :256
9/

1:51
4/

I : 287
4/13

! :27
3 / 1.5

1:512
I /

I. Booster
0.3 mg/kg
Ausg.-Mat.

IgG einpolymerisiert
IgG-A usgangsmaterial

1 mg/kg
0,3 mg/kg

1:51
8/

I :25
8/1,4

1 : 16
6/ 1.1

1 :324
7/8,8

Immunisierung von Meerschweinchen (subcutan) mit IgG-Präparaten.

Blutungen am 14.. 21., 35.. 56. und 63. Tag. anschließende Booster-Injektion - K. Booster-Injektion am 72. Tag mil I mg/kg IgCi-

Ausgangsmaterial.

Tabelle 2

Gruppe	Präparierung	Dosierung (bezogen auf IgG)	Impfschema (Vaccina- tionstage) 0 ' 2\	Mittlerer Mikrotec Anzahl d 1. Blutung	Titer (Harn hnik) er Tiere/S!; 2. Blutung	agglutination ndardabweic 3. Blutung	S- hung 4. Blutung	Kommentar
11	IgCi-Ausgangsmaterial	1 mg/kg	+ ⁺	1: 2.5 15/9.0	1 : 6.5 14/6.4	1:31 13/5.8	1:7 9/4.4	Booster 1 mg/kg Ausg.-Mat.
12	IgG-Ausgangsmaterial + Kompl. Freund's 1 : 1	1 mg/kg	+- : +■	1:51 20/ 60	1:272 17/5.3	1: 1954 14/4.8	1: 930 10/4.6	Booster 1 mg/kg Ausg.-Mat.
13	Mizellpolymere (116 mg) IgG-Ausgangsniaterial	1 mg/kg	f I f j	1:3 15/3.6	1 : 3.7 13/6.0	1: 33 12/2.0	1:2 11/13	Booster I mg/kg Ausg.-Mat.

Immunisierung von Meerschweinchen (intramuskulär) mit IgU-Präparaten.
Blutungen am 10.. 20.. 30. und 60. Tag, anschließende Booster-Injektion = I.

Tabelle I	Präparierung	Dosierung (Toxoid)	Antitoxin-Titer ΙΕ/ml (Bestimmung (Anzahl der Tiere im Pool) 1. Blutung I 2. Blutung	> 2,0 < 5,0 > 5.0 < 10.0 > 1,0 < 5.0	dci	_+-Dosis an Mäusen) 3. Blutung ; I	4. Blutung
Gruppe	Tetanus Toxoid einpolymerisiert	5 Lf	>0.01 <0,05 (5) >0,05 <0,l (4) >0,05 <0,I (5) >0,01 <0,05 (5)		(5) (5) (4)	ca. 2.0 (5) I >2,0 <5,0 (4) I >2,0 <5,0 (4) j I	>l,0 <2.0(10i
14

Il

Gruppe	Präparieriing	Dosierung (Toxoid)	Antitoxin-Titer IE/ (Anzahl der Tiere i I. Blutung	< 5,0(4) < 5,0(5) < 10,0 (4) < 5,0(4)	ml (bestimmung der m Pool) 2. Blutung	10,0(5) <20,0 (4) < 10,0 (4)	,+-Dosis an Mäusen) 3. Blutung	< 10,0 (6) < 10,0 (5)	4. Blutung
15	Tetanus ^Toxoid einpolynierisiert	50Lf	>2,0 >2,0 >5,0 >2,0	<().l (4) <0,()5 (5)	ca. >10,0 > 5,0	<5,0 (5)	>5,0 >5,0	<5.0 (5)	>2,0 <5,0(9)
16	Tetanus Toxoid einpolynierisiert + Ausgangstoxoiü	5 Ll 5 Lf	>(),()5 X)₁Ol	<1.0 (5) 21,0 (5)	>2,()	< 5,0 (4) <l(),0 (4)	>2,()	< 10,0 (4) < 10,0 (4)	ca. 2.0(4)
17	Tetanus Toxoid einpolymerisiert + Ausg^ngstoxoid	50 Lr 50 Lf	X). 5	^^,U (5) <1.0 (5) <2.() (5) 1.0(4)	>2.0 >5.()	<- IU₁U P) 5,0 (5) <IÜ.() (5)	>5,0 >5.0	"^ IU₁U Ui < 5,0 (4)	5.0(5)
IX	letanus loxoid an Al-Phosphat	.s Ll	>l.(l X),5 >!.() ca.	<2.O(5) ai.O (5) <5,O(5)	->5,ü ca. >5,0	< 5,0 (5) 10,0 (6)	-> .">,u >2,0	<IO.O (5) 11.0 (5)
19	Tetanus Toxoid an Al-Phosphat	50 Lf	>1.0 >2.0	>2,0 ca.	>5.0	>5,0 <!(),() (8j

Immunisierung von Meerschweinchen (intramuskulär) mit Tetanus Toxoid-Präparaten. Blutungen nach 3, 6, 12 und 20 Wochen, keine Booster-Injektion.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert; diese gliedern sich in die 3 Arbeitsgänge: a) Solubilisierung, b) Polymerisation und c) Isolierung und Reinigung.

Beispiel 1

a) 12,0 g Sulfobernsteinsäure-bis-2-äthyl-hexylester als Natriumsalz (A) und 6,0 g Polyoxiäthylen(4)lauryläther mit durchschnittlich 4 Aethylenoxidgruppen (B) in der Kette werden gelöst in 20,0 g η-Hexan; die Lösung wird keimfiltriert. Unter Rühren gibt man — im folgenden unter sterilen Bedingungen — 10,0 g wässerige Toxoid-Lösung (Diphterie- oder Tetanus-Toxoid mit lOOLf/ml) hinzu, darauf achtend, daß bei langsamer Zugabe und stetem Rühren eine klare Lösung erhalten bleibt. Nach Einbringen von weiteren 20,0 g n-Hexan werden die Monomeren eingerührt, und zwar: 0,250 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 2,000 g Acrylamid. Bei vollständiger Lösung der kristallinen Bestandteile wird dann mit η-Hexan auf ein Gesamtgewicht von UO₁Og ergänzt.

b) Die Lösung wird mit Stickstoff überschichtet, dicht verschlossen und bei etwa 20—30° C kontinuierlich den Strahlen einer Kobalt-60-Quelle ausgesetzt. Zur Polymerisation genügt eine Dosis von 0,3 M rad. Das Ende der Polymerisation, d. h. das Verschwinden der Monomeren, kann mit einer acidimetrischen Farbtitrationsmethode zur Bestimmung von «,^-ungesättigten Verbindungen mittels Reaktion mit Morpholin geprüft werden (F. E. Critchfield, G. L Funk, J. B. Johnson, AnalytChem. 28,76-79,1956).

c) Nach erfolgter Polymerisation wird die hydrophobe Phase, d. h. das η-Hexan, durch schonende Destillation bei Zimmertemperatur und Wasserstrahlvakaurn entfernt Die zurückbleibende konzentrierte, wässerige Lösung von Produkt (Mikrokapseln) und Tensid wird durch Ultrafiltration mit dest. Wasser und Stickstoff-Überdruck (ca. 2—4 atm) von Tensiden gereinigt. Man erhält eine kolloide wäßrige Lösung des Produktes, welches lyophilisiert wird.

Beispiel 2

a) 12,0 g von (A) und 6,0 g von (B) werden klar gelöst in 80,0 g n-Hexan, 5,0 g dest. Wasser darin tropfenweise solubilisiert und die kristallinen Monomeren 0,250 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 2,000 g Acr, '.amid zur Lösung gebracht. Die Lösung wird keimfiltriert. Tropfenweise fügt man, unter sterilen Bedingungen. 5,0 gTetanus-Toxid-Lösung mit 3100 Lf/ml hinzu.

b) Die Polymerisation wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, durch γ- Bestrahlung durchgeführt.

c) Nach erfolgter Polymerisation kann das polymere Produkt mit eingeschlossenem Antigen schonend bei -5°C mit 40%igem wässerigem Methanol ausgefällt werden. Anschließende Zentrifugation oder Ultrafiltration bei —5° C befreit von den Tensiden. Lyophilisation (Methanolgehalt vorzugsweise mit Wasser unter 5% eingestellt) oder Ultrafiltration mit Wasser entfernt andere Lösungsmittel und ergibt das gewünschte Produkt.

Beispiel 3

a) 45,0 g von (A) und 25,0 g von (B) werden gelöst in 215,0 g η-Hexan. In folgender Reihenfolge werden weiter eingebracht und klar gelöst: 2,5 g Aethanol, 2,5 g Methanol, 40,0 g dest Wasser, 1,000 g Ν,Ν'-Methylenbis-acrylamid und 8,000 g Acrylamid. Die solubilisierte Mischung wird keimfiltriert das Gewicht mit n-Hexan auf 340,0 g gebracht Unter Rühren und im folgenden sterilen Bedingungen werden dann 10,0 g einer Human-Gammaglobulin-Lösung (aggregatfrei in Tris-

HCI + NaCI 0,100 g; ca. 1,4% Human IgG) tropfenweise snlubilisiert.

b) Die Polymerisation wurde, wie im Beispiel ! beschrieben, durchy-Bestrahlung durchgelührt.

c) Die Isolierung der Mizellkapseln kann entsprechend Beispiel 1 oder Beispiel 2 erfolgen.

Beispiel 4

a) 12,0 g von (A) und 6,0 g von (B) werden gelöst in 80,0 η-Hexan, unter Rühren langsam 35,0 g dest. Wasser solubilisiert und die kristallinen Monomeren 0,500 g N.N'-Methylen-bis acrylamid und 4,000 g Acrylamid darin zur Lösung gebracht. Die Lösung wird keimfiltriert und 0,300 g Urease (lyophilisicrtcs Produkt, wasserlöslich) mizellar gelöst.

b) Die erhaltene Lösung wird im zylindcrförmigen Reaktionsgefäß unter Rühren und Temperaturkonstanz von 35 ±5°C und ständig durch die Lösung perlendem StickMoffstrom von innen durch eine Ultraviolett - ΙΊη-taurhlampe (Quarzbrenncr, 70 W) 45 Minuten lang bestrahlt bis zum Verschwinden der Monomeren.

c) Nach erfolgter Polymerisation wird die Lösung im Überschuß mit Methanol nicht unter 80% Alkoholgehalt versetzt. Das Produkt fällt aus und kann abzentrifugiert oder unter Druck abfiltriert und gewaschen werden.

Beispiel 5

a) Zu einer Lösung von 5,0 g Toluol, 50 mg Diäthyl-p-nitrophenyl-monothiophosphat und 10,0 g Polyoxyäthylen-soibitanmono-oleat wurde unter Rühren 50 g Wasser hinzugefügt. In diese Lösung werden 1,5 g Acrylsäure-methylestcr eingerührt.

b) In die Lösung werden in einem /ylindcrförmigcn, thermos!atisierbaren, doppe!wandigen Reaktionsgefäß aus Pyrcx-Glas (lichte Weile 6 cm) iiiiter Rühren 0.2 mg Riboflavin 5'-Nalriumphosphal und 0.2 mg K...S/ U gelöst. Unter beständigem Rühren und Temperaturkonstanz von 35 + TC und ständig durch die Lösung perlendem StickMoffstrom wird die Losung von außen auf mittlerer I lohe der Hüssigkcitssäulc im Abstand von 15 cm mit einer Glühbirne Osram (300 W) 7 .Slundcn lang bestrahl! bis zum Verschwinden der Monomeren.

c) Die Isolierung der Mizellkapseln mit dem Insektiziden Wirkstoff wurde gemäß Beispiel 4 vorgenommen.

Claims

Patentansprüche:

1. Mikrokapseln mit Kapselwänden aus polymerem Material und einem Durchmesser im Nanometerberrich, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapselwände aus polymerisierten hydrophilen Monomeren bestehen und als Kapselinhalt biologisch oder pharmakodynamisch aktives Material enthalten.

2. Mikrokapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der Mikrokapseln 20—200 Nanometer beträgt.

3. Mikrokapseln nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapselwände aus polymerisiertem Acrylamid, Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, aus polymerisierter Acrylsäure und/oder deren Derivaten bestehen.

4. Verfahren zur Herstellung der Mikrokapseln nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer hydrophoben oder hydrophilen Flüssigkeit zur Bildung micellarer Reaktionsräume Tenside !löst und dann im Falle der Verwendung einer hydrophoben Flüssigkeit Wasser und das einzukapselnde aktive Material bzw. dessen Lösung oder im Falle der Verwendung der hydrophilen Flüssigkeit ein hydrophobes Lösungsmittel und das einzukapselnde aktive Material bzw. dessen Lösung unter Rühren solubilisiert, worauf man die hydrophilen Monomeren einbringt und polymerisiert und die entstandenen Mikrokapseln isoliert.

5. Abwandlung des Verfahrens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst Monomere mit Lösungsmittel allein in die Hilfsstofflösung der hydrophilen oder hydrophoben Flüssigkeit einrührt und dann zu dieser solubilisierten Lösung eine Lösung des Wirkstoffs hinzufügt, worauf man die Polymerisierung durchführt und die Mikrokapseln isoliert.