DE7343112U - Mikrokapseln im Nanometergrößenbereich - Google Patents

Description

betreffend

Mikrokapseln im Nanometergrößenbereich

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neuartige in Wasser kolloidlösliche oder in hydrcphcbai Medien suspendierbare oder kolloidlösliche Kunststoff kapseln aus gut verträglichem, polymerem Material, insbesondere aus Acrylamid- und N,N¹-Methylenbis-acrylamid-Gel, bzw. aus Acrylsäure- und Acrylsäuremethylester-Gel, von submikroskopischere vorwiegend mizellarer Größenordnung, welche biologisch oder pharmakodynamisch aktives Material, insbesondere Proteine, Antigene, pharmakologisch oder therapeutische Wirkstoffe oder aber Schädlingsbekämpfungsmittel, Fertilizer, Farbstoffe, Farbbildner, Klebstoffe und Katalysatoren oder andere technische Wirkstoffe in eingeschlossener und/oder adsorbierter Form enthalten, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und ihrer Verwendung.

Dl· Herstellung und Verwendung der bekannten Mikrokapseln mit Durchmesser im Bereich von z. B. 0,1 - 1 οία, enthaltend flUeeige oder feste Stoffe flir medizinische und technische Ver-

7HS11222.I.I4

wendung wie beispielsweise fUr die Applikation durch die Haut oder Schleimhaut, zur Geschmacksmaskierung bitterer Medikamente,

IUi' IuOKOXiOaX^-UPesi.B*töifi~tct uiüiiüllüugvn , 2utü 3uiVüt2 VvFi πχΓ'Λβΐΰχχέϊϊ

gegenüber Umgebungseinflüssen oder zur Einkapselung von Klebstoffen, welche durch Druck oder Temperatur aktiviert werden können, fUr die Herstellung von Applikationsformen von Schädlingsbekämpfungsmitteln mit Depotwirkung und für die Verkapse-

und Farbbildnern
lung von Farbstoffenvsind gut !bekannt. Das Wandmaterial dieser Mikrokapseln besteht meistens aus polymerem, mehr oder weniger wasserunlöslichem Material, etwa Gelatine oder synthetischen Polymeren. Die Mikroverkapselung kann dabei als Aufbauumhüllung in rotierenden Kesseln, Tellern, Scheiben, Walzen usw., sowie im Wirbelschichtbett oder durch Sprühkondensation erfolgen. Sin z.Zt. gebräuchliches Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln ist die sog. "einfache" öder "komplexe" KöaäerVätiön (J.Phärffi.

( ^j\q'7q\ vslchs- gfl«^»i ifin i^n L. VgT>jPshrgjissoiiri

erfolgt:

a) Herstellung einer Emulsion oder Suspension des einzukapselnden Stoffes in einer geeigneten Trägerflüssigkeit, welche bereits das Wandmaterial gelöst enthält.

b) Erzeugung des Wandmaterials in Form kleiner Tröpfchen in dieser Suspension oder Emulsion durch Fhasentrennung oder Zugabe einer weiteren Phase, wobei gegebenenfalls ein Dreiphasensystem gebildet wird.

c) Umhüllung der einzukapselnden Phase durch die bei b) ausgeschiednen Tröpfchen aus Wandphasenmaterial.

d) Verfestigung der zunächst noch flüssigen Hülle.

Während des gesamten Prozesses muß gerührt werden, um das Mehrphasensystem stabil zu halten. Die Bildung der Mikrokapseln erfolgt dabei in der Regel durch Koazervierung von Gelsystemen,

wie sie etwa in den schweizerischen Patentschriften Nr. 330'5OO und 373*633» den deutschen Auslegeschriften Nr. 1*256*194 -

1 »185*585 und 1'189'05O, den amerikanischen Patentschriften Kr· 2«800·457, 2*800*458, 3*155*590 und 3*190*837, der britischen Patentschrift Nr. 1'016'839» den belgischen Patentschriften Nr, 699*324, 701*600 und 727*294 und der deutschen Offenlegungaschrift Nr. 1*926*552 beschrieben ist. Die Teilchengröße der nach diesen Verfahren hergestellten Mikrokapseln variiert zwischen einem Minimum von einigen Mikrometern und mehreren 100 Mikrometern und reicht bis zu mehreren Millimetern.

Die Anwendung derartiger Mikrokapseln in der Medizin beispielsweise iS^-I¹Oie orale, kutane, epitheleale und enterale Verabreichung beschränkt. Sine wesentliche Aufgabe der vcrlie= eemdem Erfindung ist es nun» diese Einschränkung bei der medizinischen Anwendung zu beseitigen und darüberhinaus eine Kapselform zur Verfügung zu stellen, die für viele Anwendungen wesentliche Vorteile besitzt.

eine gefahrlose parenterale, inklusiv intravenöse Verabreichung von therapeutisch wirksamen Partikeln sicherzustellen* muß deren Teilchendurchmesser im Mikrometerbereich Bis zu mehreren 100 Mikrometern auf wenige hundert N&nometer (10"' toeter) reduziert werden. Das ist eine Verkleinerung um das 100- bis 10¹OOOfache gegenüber den bekannten Kapseln. Es ist verständlich, daß dazu ein grundsätzlich neues Verfahren erfunden und angewendet werden mußte, damit Teilchen resultieren mit Durchmesser in der Größenordnung kleiner als 200 Nanometer vorwiegend unter 80 mn.

Polymerpartikel mit einem Durchmesser zwischen 10 Mikrometern und 2 mm kSnnen durch Suspensionspolymerisation nack dem Verfahren der deutschen Patentschrift JVr. 4*081*228 erhalten werden.

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Die kleinsten bisher bekannten Kunststoffpartikel werden erhalten durch.iäruleionepolym«rieatioa, bei der das gewöhnlich wasserun»- iöslioh« Monomere in wässeriger Phase emulglert wird, die eigentlich« Polymerisation isisch nichts in dta Mosomereströpfcaifi, eondern in der wässerigen Phaee erfolgt und bei welcher zum 3©hluß eine wässerige Dispersion von kugelförmigen Polymerteileben (Late-teilchen) nit einem Durchmesser von etwa 100 bis mehreren I'ooo Nanometem vorliegen (Fikentscher et al, Angewandte Chemie 22t Seiten Θ36-864 (1960); Harkins, Journal of Polymer Soienoe, Vol. %, No. 2, Seiten 217-251 (1950) )·

Weder die durch Suspensions- noch durch Emulsionspolymerisation erhaltenen Teilehen sind klein genug, um in Wasser kolloid· löslioh zu sein, wohingegen Mikrokapseln mizellarer Größenordnung in Wasser eine stabile kolloide Lösung bilden können.

Aufgrund aer Lehre und Erkenntnisse der sation wurde nun die auf den aizellai<m Bereich ausgerichtete neue Polymerisationsmethode entwickelt, die zu den erfindungsgemäßen Mikrokapseln führt, die aus einem polymeren Material, vorzugsweise aus einem hydrophilem Gel aus polymerisiertem Acrylamid, Acrylsäure und/oder deren Derivaten bestehen und einen Durchmesser im Nanometerbereich von 20 · 200 mn vorzugsweise unter 80 na aufweisen und in Wasser kolloidal löslioh sind und Wirkstoffe in eingeschlossener und/oder adsorbierter Form enthalten. Das Polymer besitzt vorzugsweise eine poröse Struktur.

Biese Mizellkapseln könneSTEergestellt werden, daß wasserlösliche, polymerisationsfähige Moleküle und das einzuschliessemde Material., z.B. der biologisch oder phannakodynamisch aktive Wirkstoff zusammen im Wasser echt oder zumindest kolloidal gelöst werdn. Diese wässerige Lösung wird in einer hydrophoben Flüssigkeit, die eine Phase bildet, in welcher die Kunststoffnonomeren und die Wirkstoffe schwer- oder unlöslich sind, mit

Hilf· von grenzflächenaktiven Hilfsetoffen (Tenside) unter ftÜnfin verteilt, ao dass winzige Mizellen in der Größenordnung voii ca 20 - 200 Nanometer entstehen» die die polymerisationsfähigen Monomeren, die Wirkstoffe und eventuell weitere Hilfs- B¹BOiXe onümltvn MS& S^S in Si**ss relativ großen Volumen der hydrophoben Phase selubllisit/rt sind· Sie bilden kleinste Re- aktionsrHume für die anzuschließende Polymerisation der Monomeren. Sie·· kann nach an sieh bekannten Methoden eingeleitet werden, wie sie 2.B₈ in der deutsche» Patentschrift Nr. 1'081'228 oder in den amerikanischen Patentschriften Nr. 2 * 880Ί52 und 2'880'153 beschrieben sind« Die Polymerisation ist dabei vorwiegend auf die MAzellarräume beschränkt, da die hydrophobe Hauptphase kein polymerisat!onsfähigeβ Material enthält und auch eine Diffusion von Monomeren in und durch diese Phase weitgehend verhindert ist.

Zur Einhüllung von nicht-wasserlöslichen Stoffen kann das System derart verändert werden, daß eine lipophile Phase mit dem gelösten Material und öllSslichen Monomeren in einer- hydrophilen Flüssigkeit, meist Wasser, solubilisiert werden. In diesem Falle ist die Diffusion von Monomeren durch die hydrophile Phase weitgehend verhindert.

Im Gegensatz zur Emulsionspolymerisation, bei welcher in den meisten Fällen wasserunlösliche Monomere in V/asser polymerisieren, und bei welcher die raciikalhaltigen, polymerisierenden Reaktionszentren anschwellen können auf ein Vielfaches ihrer ursprünglichen Größe - bedingt durch Diffusion von Monomeren aus deren Vorrat iaa den vorhandenen Emulsionströpfchen in die wachsenden Polymer-Monomer-Teilchen (Latex-Teilchen) - ist die erfindungsgemäße "Mizellpolymerisation" strikte auf die in den Mizellen enthaltenen Monomeren beschränkt. Die Partikel bleiben daher extrem klein. Durch Variation von Monomeren und Vernetzungsmitteln, deren Konzentration, der Polymerisationsart und Katalysatoren, dem Verhältnis der hydrophoben zur wässerigen Phase

und Wahl der Tenside als Mizellbildner, kann innerhalb der Mizellen eine gesteuerte Vernetzung, ein variables Polymergerüst und damit eine Beeinflussung der spezifischen Einkapselung des aktiven Materials erzielt werden.

Nach Beendigung der Polymerisation wird durch Entfernen oder Einengen der äußeren Phase, z.B. durch Destillation, Ultrafiltration oder Zentrifugierung, der feste Rückstand mit einem geeigneten Lösungsmittel - im allgemeinen mit einem wässerigen Alkohol, z.B. Methanol - verdünnt, wobei die gebildeten Polymerisatteilchen gewöhnlich ausfallen und dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren von löslichen Begleitstoffen und vom Emulgator abgetrennt und gewonnen werden kann.

Alternativ dazu kann nach Einstellen der auspolymerisierten Lösung auf einen geeigneten Lösungsmittelgehalt die entstandene Suspension auch direkt ultrafiltriert und das Polymerisat isoliert werden. Das erhaltene Produkt zeigt in beiden Fällen in geeigneten Lösungsmitteln wieder kolloidales Verhalten. Es besteht, wie aus elektronenoptischen Bildern und Freigabeversuchen mit radioaktiv markiertem, einpolymerisiertem Gammaglobulin als Wirkstoff hervorgeht, aus polymeren Kügelchen von weniger als 200 mn, vorzugsweise unter 80 nm Durchmesser, ic denen das aktive Material eingeschlossen und/oder adsorbiert ist.

Das neue Verfahren zur Herstellung der Mikrokapseln im Nanobereich, die biologisch oder pharmakodynamisch aktive oder technisch brauchbare Wirkstoffe enthalten, ist erfindungsgemäß durch nachfolgende Verfahrensstufen gekennzeichnet:

1. Die grenzflächenaktiven Hilfsstoffe mit Emulgatorwirkung, welche die Solubilisierung von Wasser und wässerigen Lösungen oder von lipophllem Material - gegebenenfalls in geeigneten

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Lösungsmittel - in einer hydrophoben Flüssigkeit, bzw. in einer hydrophilen Flüssigkeit, ermöglichen, werden in der betreffenden Flüssigkeit gelöst, die die hydrophobe oder hydrophile äußere Phase bilden sol^i.

2. ZU der erhaltenen Lösung wird unter Rühren Wasser und das einzuschließende aktive Material oder die wässerige Lösung des aktiven Materials bzw. das lipophile aktive Material hLnzugefügt und dann die Monomere des zu polymerisierenden Polymers eingetragen. Hierbei werdsifür die Verwendung in der Therapie Monomere verwendet, die ein gutverträgliches Polymer ergeben. Als wasserlösliche Monomere können insbesondere Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und als öllösliche Monomere, vorzugsweise Acrylsäure + Acrylsäuremethylester, verwendet werden. Gegebenenfalls kann in dieser Verfahrensstufe auch so verfahren werden, daß zunächst Wasser und Monomere allein in die hydrophobe emulgatorhaltige Flüssigkeit eingerührt wird, oder es w.ercfenlipophiles Lösungsmittel und lipophile Monomere in die hydrophile emulgatorhaltige Flüssigkeit eingetragen, worauf zu der erhaltenen Lösung dann erst die konzentrierte, gegebenenfalls kolloide, wässerige oder ölige Lösung des einzusehliessenden aktiven Materials hinzugefügt wird.

3. Die in den solubilisierten, wasserhaltigen, bzw. ölhaltigen Mizellen gelösten Monomeren werden nun Je nach anzuwendender Polymerisat!onstechnik - in an sich bekannter Weise polymerisiert, wobei der Verlauf der Polymerisation durch Titration des Monomerengehaltes verfolgt werden kann.

4. Nach Beendigung der Polymerisation wird das erhaltene Polymerisat mit dem eingeschlossenen und adsorbierten, aktiven Material, gegebenenfalls nach Entfernen des Hauptanteile der Flüssigkeit der äußeren, d.g. kontinuierlichen Phase, z.B. durch Abdestillieren im Vakuum,. . durch Ultrafiltration oder^Zentrifugi· en

i* isoliert. Durch Zuearts vsb 7141112 ti.4 ti

Lösungsmitteln, vorzugsweise mit wässerigem Alkohol, oder
durch Aussalzen kann:das Produkt auch ausgefällt werden.

Es wurde festgestellt, daß als Flüssigkeit für die hydrophobe Phase relativ kurzkettige n-Alkane am besten geeignet sind.
Sie sind praktisch wasserunlöslich, für die Solubilisierung von Wasser optimal und stellen selbst kein Lösungsmittel für die gewählten Monomeren und die in Frage kommenden biologisch, aktiven, ^wlrKs%oxxiⁿwie Pharmaka oder das andere einzuschließende aktive

aar. Sie sind außerdem inert, uagiftig und leicht wieder von dem erhaltenen Produkt zu entfernen.

Besonders geeignet sind n-Alkane, welche im Vakuum einen
punkt von wenige:
η-Hexan und n-Heptan.

Siedepunkt von weniger als O⁰C aufweisen; das sind vor allem

	Siedepunkt	in 0C bei!	100	Torr.	8
	10 Torr.	40 Torr.	15,	8
n-Hexan	- 25	- 2,3	41,	6
n-Heptan	- 2,1	*· 22,3	51,
Wasser	+ 11,3	34,1

Es wurde ferner festgestellt, daß die Kombination eines
geeigneten nicht-ionogenen Emulgators mit einem ionogenen Emul gator zu einer wesentlich besseren Solubilisierung der wässerigen Phase führt. Mit Hilfe der Kombination kann eine wesentlich größere Mengt Wasser mit geringerer Gesamtmenge an Emulgator in der organischen hydrophoben Phase solubilisiert werden.

Al· nicht-ionogent Üaulgatoren haben sich die Fettalkoholpolyglykolttther bewährt, z.B. Polyäthylenlaurylätber mit durchschnittlich 4 Aethylenoxid in der Kette, und als ionogener

Emulgator die Alkalisalze von höheren Sulfobernsteinsäure-bisalkylestern, z.B. das Natriumsalz des Sulfobernsteinseure-bis-2-äthylhexylester.

Für die Einhüllung lipophiler Wirkstoffe hat sich eine solubilisierte Mischung aus Tween SO, d.h. Polyoxiäthylensorbitanmonooleat, in beispielsweise Äthyloleat, Paraffin, Rizinusöl oder anderen Fettsäureestern mit Acrylsäurederivaten als Monomere, vorzugsweise Acrylsäure oder Acrylsäuremethylester sowie gegebenenfalls auch mit Viny !derivat en in Wasser bewährt*

Die Polymerisation dar Monomeren erfolgt nach an sich bekannten Meth^de^, ^n⁵SCh Zusatz von Katalysatoren oder Polymerisationsinitiatoren , durch Bestrahlung oder durch Kombination chemischer mit physikalischen Methoden, wie sie z.B. in den amerikanischen Patentschriften Nr. 2'875'047, 2'88O¹152 und 2'880·153 und der deutschen Patentschrift Nr. 1'081'228 beschrieben sina.

Bei der Wahl des Polymer!sationsverfahrens und besonders bei dar Dosierung der entsprechenden Maßnahmen muß jedoch Rücksicht auf das einzuschließende Material genommen werden. Dieses darf durch das angewandte Verfahren nicht in nennenswertem Ausmaß ge schädigt werden. Zu diesem Zwecke sind im Einzelfalle gewisse Anpassungen des Verfahrens vorzunehmen. So ist zu berücksichtigen, daß biologisches Material, wie beispielsweise Antigene, aus emp findlichen Proteinen bestehen, welche beim Erhitzen über 55⁰C, bei einem pH von weniger als 2,5 oder durch die Einwirkung von Oxydationsmitteln, aus denen die Üblichen Polymerisationskatalysatoren bestehen, zerstört werden kann.

Es wurde weiterhin festgestellt, daß in diesen Fällen eine nur minimale Schädigung der Proteine eintritt, wenn dia Polymerisation, wahlweise nach einem der folgenden Verfahren

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73H11221.S.74

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durchgeführt wird. Eine geeignete Methode ist die T- Bestrahlung, z. B. mit einer Co-Quelle, wobei gewöhnlich ß,3 Grad genügen. Hierbei kann im Falle von nicht oxydationsempfindlichso Material auch eis wasserl9slieber Radikaibildner, wie z. B* ein Persulfat, als Polymerisationskatalysator verwendet werden. Dann führt Bestrahlung mit sichtbarem Licht zur Polymerisation, z. B. 300 Watt Glühlampe während ce. 7 Stunden und Riboflavinzusatz (ca. 0,01 %) als Sensibilisator, und gegebenenfalls Kaliumpersulfat-Zusatz ist geeignet. Im Falle der UV. Strahlenverträglichkeit kann auch mit ultraviolettem Licht polymerisiert werden; hier wirkt solubilisiertes Protein sogar beschleunigend auf die Polymerisationszeit. Die Dauer der UV-Bestrahlung mit 70 Watt Tauchlampe bei vorwiegender Weilenlänge : 366nm beträgt ca. 45 Minuten bei Anwesenheit von Protein, sonst ca. 3 Stunden. Alle diese Polymerisationsarten verlangen eine 5 ticks to ff atmosphäre und können

DBX J\J ^— ^J üna öci imaluirSä pH d.i*rchgSfU*H*t VSrd.«n.

Nach erfolgter Polymerisation kann die Flüssigkeit der hydrophoben Phase durch Destillation im Vakuum entfernt werden, falls sich die Anwesenheit dieser bei der weiteren Aufarbeitung als nachteilig erweisen sollte. Bs bildet sich ein Azeotrop aus der verwendeten hydrophoben Flüssigkeit, z.B. aus η-Hexan und Wasser, welches eine sehr schonende Destillation bei Raumtemperatur oder je nach Vakuum sogar schon bei O⁰C erlaubt. Die Gewinnung der Mizellkapseln mit eingeschlossenem aktivem Material erfolgt bei nicht empfindlichem Wirkstoff gewöhnlich direkt durch Ausfällen mit organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol und anschließende Ultrafiltration oder Filtration über Membranfilter und, falls erwünscht, Vakuumtrockung des Filterrückstandes. Alternativ ist die Abtrennung des Produktes auch durch Zentrifugation möglich.

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- 11 -

Bei Anwesenheit von beispielsweise labilen Proteinen wird mit wässerigen Methanol (400 V/V) in der Kälte auegefällt und mittels Membranfilter eine Ultrafiltration unter Überdruck durch· geführt. Segen mam der Filtration - aaoh völliger Entfernung der Emulgatoren, der hydaphoben Phaee und des größten Teile der methanoliechen Lötung wird der FilterrUokstand mit Wasser auf einen Methanol-Gehalt von ca. 50 verdünnt und anschließend lyophilieiert.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrene liegen vor» wiegend darin, daß gegenüber bekannten Verfahren ein Produkt erhalten wird, welches Kapseln Bit um das 100« bis 10¹OOOfach kleineren Teilchengröße aufweist. Das Produkt zeigt engste Teilchendurchmesserverteiliäng und ergibt elektronenmikroskop!sch das Bild einer Anhäufung von homogenen, kugeligen, annähernd gleich großen Kunststoffpartikeln. Der Durohassssr der polymeren Teil= chen (für das Elektron-Scanning-Verfahren mit Gold bedampft) liegt durchschnittlich bei 300 Ä (80 nm), wie die scanning photos zeigen. Die untere Teilchendurchmessergrenze beträgt 350 - 200 A (30 - 20 nm), wie eine Testfiltration mittels Membranfilter: Typ Sartorius SM 11530, Membranfilter GmbH., 34 Göttingen, mittlerer Porendurchmesser 350 - 200 H gezeigt hat. Die Teilchen bestehen aus dem Polymergerüst, welches die Wirkstoffe mechanisch umhüllt und/oder adsorptiv zurückhält, wobei man-je nach Polarität, Dielektrizitätskonstante find sterisehen Gegebenheiten der Reaktionspartner - einen mehr oder weniger schalenförmigen Aufbau des Polymergerüsts oder aber gefüllte, aber poröse Teilehen erhält· Wegen der extrem kleinen Dimensionen der Teilchen sind die erhaltenen Mizellkapseln mit dem eingesclilossenen und adsorbierten aktiven Material in Wasser kolloidlöslich. Dies eröffnet ganz neue Anwendungsmöglichkeiten von therapeutischen Wirkstoffen· Insbesondere erlaubt diese Methode die gefahrlose parenterale Verabreichung, inklusive unter Umständen der intravenösen Injektion, von biologisch und phannakodynamisch aktivem Material,

je ü*efc Wmhl der MengeniftrhlUtniese »wischen Trtgerstoff und aktiv*« Matt rial, tin »ehr oder weniger großer Teil de· Aktiven Material* in d«r NetEstruJctur der polyaerislerton

etark «xjuv soiu.suoa m miffmvr«

Ist oder «tiefe teilwei·· frei und sogleich wirk··* vorliegen kann. !Dealt iet eine geeteuerte Ujngseittberaple bit nur einer einzigen Applikation eraöglloht, wobei der orgaal snu· ianer nur alt •inea Minimum vom biologisch oder paaraaicodfiiaaieeh aktivem Produkt belastet wird. Außerdem kann unter gewissen Bedingungen das aotaartig uahülltt Material auch direkt but Wirkung gelangen; dl·· gilt besondere bei Anti.gt «*n» Auf die·· Weite kämm ganz besondere bei Impfstoffen ein« optimale Ad^uvens-Wirkung erzielt werden. Dem Organisaus wird über sehr lange Zelt eine äußeret gering· Meng· von Antigenen angeboten, wodurch das retikuloendotbeliale Syetem etündig zvir Antikörperbildung angeregt wird. Daraus resultiert ein stabiler hoher Antikörpertiter und im und-

Nicht jedes beliebige eiktive Material - Protein, Pharmakon, Schädlingsbekämpfungsmittel, Fertilizer, Farbstoff - ist für die Einbettung in die erfindung&gemäß erhaltenen Mizellnetzstrukturen in gleicher Weise geeignet. Voraussetzung sind jeweils eine bestimmte Molekulargröße und! Insbesondere die Fähigkeit, mindestens kolloide, wässerige oder ölige Lösungen bilden zu können, da bei der Herstellung die Einbettung in die Mikrokapseln erfolgt, wenn die Wirkstoffe stich in den Mizellen befinden. Gut eignen sich mindestens noch kolloid wasserlösliche oder öllösliche Stoffe mit Molekulargewichten bis zu ca. 15O¹OOO.

Ib vitro kennte für den Fall von radioaktiv markiertem

Human-Gammaglobulin in Mizellkapseln über einen Zeitraum von SO Tagen in einer bewegten Phosphatpufferlösung bei 37⁰C eine von Beginn, dar Messung an unveränderte Freigabe von nur ca. 2056

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dee Gammaglobulins beobachtet werden, was zeigt, daß der größte Ttil dee Wirkstoffs gut eingekapselt worden ist.

Αηαοϊ·νΐ·ββϋ5 seigSü Resultats alt Gssssisglcfculir.. ir. iaaauni- eierungevereuen in vivo an Meerschweinchen, daß sehr bald hohe und relativ lang andauernde Antikörpertiter erhalten werden»

In den folgenden Tabellen sind die Ergebnisse von Vergleichs- vereucb^n mit herkömmlichem Aluminiumoxid-Adjuvans (Tabelle 1) und mit Freund'schem komplettem Adjuvans (Tabelle 2) gezeigt unter Verwendung von Human-Gammaglobulin. Die Tabelle 3 zeigt Antitoxin Titer, wie sie nadi Immunisierung von Meerschweinchen m£% verschiedenen Tetanus-Toxoid Präparaten erzielt wurden.

TABELLEN

- 14 91/31

Gruppe Präparierung

Dosiei'ur-ig Ic^xschema, mittlerer Titer (Härcaggiutinations-I-Ukrotechnik}; {(bezogen (Vaccina- Anzahl der Tiere / Standardabv/eichung ;Koa~entar auf IgG) ,tionstage) , ι !

0 ^!I4'22 721.Blutung¹ 2.Blutung'3.Blutung'4.Blutung.?.Blutung!

IgG-Ausgangsmaterial ; 0,3mg/kg j+; + -_f

IgG-Ausgangsnaterial

IgG-Ausgangsmaterial + Al-oxid (4Bg/ml)

IgG einpolymerisiert IgG einpolynerisiert

IgG einpolyraerieiert IgG einpolynerisiert

IgG einpolymorisiert

IgG einpolymerisiert IgG einpolymerisiert

0,3mg/kg ^! + ;

0,3mg/kg +

0,3mg/kg

0,3mg/kg

0,3mg/kg

1 mg/kg

■.+; 9 / /

I : 6,4 !| I : 1,2 ; I : C₁I!

iBoosterI-3

8/40 d / 61

' 8/736

Vaccinat.

ίο / ί 16 j 1:2 '.I'll 9,1. I : 1,4 ί' 1 : Λ

IO ·Ι0 / i:_t6 ; 7/1,2

,7/56

⁺ i 8 / ^ j 8 / ' Γ γ / 46 i 6 / II^J Il 6 / 5,61

J I ι 3 J I ζ 3,5 i:i::i ?Ai I : 5,4;) I : 1701

⁺ 4 / J 4 / 15/ 1,5 : 3 / 1,5 ! 3/1,7;

I : 16 ■

ι ! 4 /

^; 4 / ■■"

3 / 8,4 I /

;i. Boost or

/ ^ ^'wie prinär ,....,.. „ς>·;1. Booster

5 / 13 5/ 7,6

5 p5 /"■■ '1"^:57^::i!5^{: :Vr:?}'"5?'6,3

img/kg I₊I , +'+ ΪΓ^-.¹

1 mg/kg ; +

ι I

1 mg/kg

IgG-Ausgangsmaterialj 0,3mg/kg ί

5 /

I : 5 /" Eilt

2/0 ,

■Ausg.-Mat.

λ Γ': 1740-4 / 6,0 ;

Ώ:ν;..^;£4- ^iTT.Jzo^iV^iß. ill;.γ::·

'5/ 5/]3·>/4 /

4/ ^u 4 / 23 ·^ισ

4 /13 3 / 1,5 Il /

5pj34 8 / 1,4; 6 / 1,17/8,8

Icrjunisisrung von Meerschweinchen (subcutan) mit IgG-Präparaten.

2i^U*S^nSSn - 2⁰^ ^*" >i ²¹-' "^?'' ^°* ^{Und 8}^' ^{Tas> anschliessende} Booster-Injektion= |j , Booster-Injektion

	Präparierung	Dosierung (bezogen auf IgG)	Impfs (Vac c tions	schema ;ina- ätage) 21	I et be Iie	T it er (iian der Tiere 2.Blutung	iagglut inat ions-Mikr« / 1^ ■; and ardabvxe i< 3. BIu I -j -.% 4. Blutung	1:7 9 /4,4	Dtechnik, shung	Kommentar
Gruppe	IgG-Auegangsmaterial	1.mg/kg		+	initf.erer Anzahl 1.Blutung	I Y-6,5" 14 / 6„4 I : 272 17 / 5„3	: I :'51 ■" J13 / 5,8 I :1954 14 / 4,8	ITr 930·: 10 / 4,6		Booster 1 mg/kg Ausg.-Mat.
11	IgG-Ausgangsmaterial ♦ Kompl.Freund's 1:1	1 mg/kg	+	+	' I V 2,5 15 / 9,0 I : 51 *20 / 60	13 7 6"or	I : 33 IZ / 2,0	"Z : 2 11 / 13		Booster 1 mg/kg Ausg.-Mat.
12	Hlzellpolymere (116mg) I«0-Aui3«anÄsmaterial	1 mg/kg	■ +	+	15 7 3,6			*	Booster 1 mg/kg Ausg.-Mat.
15

Iasunisierung von Meerschweinchen (intramuskulär) mit IgG-Präparaten. Blutungen an 10., 20., 30. und 60« Tag, anschliessende Booster-Injelrtion

Gruppej Präparierung

n^ . 'Antitoxin - Titer Iiä/ml (Bestimmung der L+-Do3is an Mäusen) CToxoid? I (Anzahl der Tiere im Pool)

^: 1. Blutung 2. Blutung j 3. Blutung 4. Blutung

>2,0 <5,0 (5)

Retanus Toxoid elnpolymerisiert

'>0,'05< •>0,05 <0,

<O,O5(5) () ca. 2,0 (5)

Tetanus Toxoid einpolymerisiert

;>2,0 <5,0 (4) 5OLf '1If₀ <5'<M5>

:>2,0 <5,0 (4)i ca. 10,0 (5)

·
0

Tetanus Toxoid einpolyserisiert

t -► Attegangstoxoid

5 Lf _;>0,05 <0,l (4) i>0_t01 <O,O5(5) 5 Lf :

Tetanus Toxoid einpolymerisiert

+ Ausgangstoxoid >2,0 <5,0 (5)

>5,0 <10,0 (6) >5,0 <10,0 (5)

>2,0 <5,0 (5)

50 Lf ">0,5^ <l,0 (5):>2,O <5,0 (4) >5,0 <10,0 (4)

: ^ 1,0 (5)^:>5,O <10,0 (4) >5,0 <10,0 (4)1

50 Lf i : j

<2,O(1O)

>2,0 <5_#O.(9)

ca. 2,0 (4)

5,0 (5)

IB j

Tetanus Toxoid an Al-Phosphat

Tetanus Toxoid an Al-Phosphat

5 Lf

>l,0 <2,0 (5) 50 Lf * 1,0 (5) ^>2'°

>2,0 <5,0 (5) ^ca·

ί,Ο <5,0 (7)

>5,0 <10,0

laraunisierung von Meerschweinchen (intrasuskulür) mit Tetanus T oxo id-Präparat en. ■RlutUnesÄ »liich ^. L- 12 MTiΛ '?Q Wofihen. keine Rooste.?·-Tn-"··=>let.inn.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Ausführungsbeispicle näher erläutert; diese gliedern sich in die 3 Arbeitsgänge: a) Solubilisierung, b) Polymerisation, und c) Isolierung und Reinigung.

Beispiel 1

a) 12,0 g SuIfoberasteinsäure-bis-2-äthyl-hexylester als Natriumsalz (Aerosol OT^) und 6,0 g Polyoxiäthyler (4)» lauryläther mit durchschnittlich 4 Aethylenoxid in der Kette (Tensid LA-55-4, der Fa. Hrfti AG, Zürich) werden gelöst in 20,0 g η-Hexan; die Lösung wird keimfiltriert. Unter Rühren gibt man - im folgenden unter sterilen Bedingungen - 10,0 g wässerige Toxoid-Lösung (Diphterie- oder Tetanus-Toxoid mit 100 Lf/ml) hinzu, darauf achtend, daß bei langsamer Zugabe und stetem Rühren eine klare Lösung erhalten bleibt. Nach Einbringen von weiteren 20,0 g η-Hexan werden die Monomeren eingerührt und zwar: 0,250 g NjN'-Methylen-bis-aerylamid und 2,000 g Acrylamid. Bei vollständiger Lösung der kristallinen Bestandteile wird dann mit η-Hexan auf ein Gesamtgewicht von 110,0 g ergänzt.

b) Die Lösung wird mit Stickstoff überschichtet, dicht verschlossen und bei etwa 20· - 30⁰C kontinuierlich den Strahlen einer Kobai1S-60-Quelle ausgesetzt. Zur Polymerisation genügt eine Dosis von 0,3 Mrad. Das Ende der Polymerisation, d.h. das Verschwinden der Monomeren, kann mit einer acidimetrisehen Farbtitrationsmethode zur Bestimmung νοίϊ £ , f* -ungesättigten Verbindungen mittels Reaktion mit Morpholin geprüft werden (F.E. Critchfield, G.L. Funk, J.B. Johnson) Analyt. Chem. 28, 76-79» 1956).

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73*3112 22Λ 7t

c) Nach erfolgter Polymerisation wird die hydrophobe Phase, d. h. das η-Hexan, durch schonende Destillation bei Zimmertemperatur und Wasserstrahlvakuum entfernt. Die zurückbleibende konzentrierte, wässerige Lösung von Produkt und Tensid wird durch Ultrafiltration Bit dest. Wasser (Membran! Amicon PM 30) und Sticks to ff-Überdruck (ca. 2 - 4 atm) von Tensiden gereinigt. Man erhält eine kolloide wässrige Lösung des Produktes, welches lyophilisiert wird«

Beispiel 2

a) 12,0 g Aerosol OT^ und 6,0 g LA-55-4 werden klar gelöst in 80,0 g n-Hexan, 5,0 g dest. Wasser darin tropfenweise solubilisiert und die kristalline^ Monomeren 0,250 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 2,000 g Acrylamid zur Lösung gebracht, Die Lösung wird keimfiltriert. Tropfenweise fügt man, unter sterilen Bedingungen, 5,0 g Tetanus-Toxid-Lösung mit 3¹IOO Lf/ml hinzu.

b) Die Polymerisation wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, durch /-Bestrahlung durchgeführt.

c) Nach erfolgter Polymerisation kann das polymere Produkt mit eingeschlossenem Antigen schonend bei -5°C mit 40%igem wässerigem Methanol ausgefällt werden. Anschließende Zentrifugation oder Ultrafiltration bei -5⁰C befreit von den Tensiden. Lyophilisation (Methanolgehalt vorzugsweise mit Wasser unter 5 % eingestellt) oder Ultrafiltration mit Wasser entfernt andere Lösungsmittel und ergibt das gewünschte Produkt.

Beispiel 3
-/ -^I- ο — u*¹«¹ 25,0 g LA-55-4 werden gelöst in

215,0 g η-Hexan. In folgender Reihenfolge werden weiter eingebracht und klar gelöst: 2,5 g Aethanol, 2,5 g Methanol, 40,0 g dest. Wasser, 1,000 g N,N^r-Methylen-bis-acrylamid

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73« 112 2t. & W

. .19-

und 8,000 g Acrylamid. Dl· solubilisiertt Misohung wird keimfiltriert, das Gewicht alt η-Hexan auf 3^0,0 g gebracht. Unter Rühren und Im folgenden lterIlen Bedingungen

QAxm Iu₉O g «rinwx {

gatfrei in TMe-HCl + NaCl 0,100 g; c*. 1,4* Human IgO) tropfenweise solubiliaiert·

b) Dl· Polymerisation wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, durch /-Bestrahlung durchgeführt.

e) Die Isolierung dar Mixellkapseln kann entsprechend Beispiel 1 oder Beispiel 2 »rfolg»n.

BelsDlel	g Aerosol	Of®iffid	0	g LA	lan gelegt in
a) 12,0	** »»"""I		ι 1	ΙΛΆΛΛ	deet. Wasser
an #v
		=55=4 ^ri
	^m 35.0 m

solubilisiert und die kristallinen Monomeren 0,500 g N,N'-Methylen-bie acrylamid und 4,000 g Acrylamid darin zur Lösung gebracht. Die Lösung wird keimfiltriert und 0,300 g Urease (lyophilisiertes Produkt, wasserlöslich, "Merck") mizellar gelöst.

b) Die erhaltene Lösung wird im zylinderförmigen Reaktionsgefäß unter Rübren und Temperaturkonstanz von 35 * 5⁰C uiid ständig durch die Lösung"perlendem Stickstoffstrom von innen durch eine Ultravlolett-Elntauehlampe (Quarzbrenne?, 70 V) 45 Minuten lang bestrahlt bis zum Verschwinden der Monomeren.

c) Nach erfolgrter Polymerisation wird öi# Lösung Im tlberschuß mit Methanol nicht unter 80% Alkoholgehalt versetzt. Das Produkt fällt aus und kann abzentrlfugiert odstr unter Druck abfiltriert und gewaschen werden.

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#> 2t§ *ia*r Mteuae «on S.O λ Toluol. 50 ac Diathyl-p-nitroyfca^yl'etfaiayiwphat und Iu₁O g Poiyoxyätaylea-iörüitÄii- »-•!•at (fwtea to) word« unter Rühren 30 g Waeeor hin- »&§*· SA t&M· LVtttttf werden 1,5 g Acryleiure-methyleeter

b) Xa die Lftsung w*r*tn in tinea lylinderförmigen, thtrmostatitoierberae, doppelwandig» Roektionageflß aus Pyrex-Olaa (lichte ftite 6 ob) unt#r mar en O₉ 2 ac Riboflavin 5'-Natriumphosphat und O₁2 ag K₂ ^fl2°8 I·¹**·"⁶· Art··* beständiges; Rühren und Temperaturkonetanz von 35 - 5⁰C und ständig durch die Lösung perlenden Stickstofl'strom wird dia Lösung von außen auf aittlersr KSh* der Flüssigkeitssäule ia Abstand von 15 55 alt zLtiS? Glühbirne ©sras (300.¥) 7 Stunden lang bestrahlt bis zua Verschwinden der Moir--«ren.

c) Die Isolierung der Mizellkaipeeln mit dem Insektiziden Wirkstoff wurde gemäß Beispiel 4 vorgenommen.

In der beigefügten schematischen Zeichnung ist in Fig. 1 eine mikroskopisch lysine Mikrokapsel im Schnitt gezeicht, deren Größe etwa 80 Nanometer, d.h. 800 X beträgt und wobei das Kapselmaterial (1) aus deifi polymerisieren Material den Wirkstoff (2) als Matrix üjshüllt. In Fig. 2 ist eine mikroskopisch keine Mikrokapsel gezeigt, bei der das Kapselmaterila (3) in Form einer geschlossenem Hülle den Wirkstoff (4) umgibt.

Je nach dem bei der Herstellung verwendeten Ausgangsmatitrial werden diese Formen b2.w. dazwischen liegende Ausführungsf ornten der neuartigen mikrokapseln erhalten.

SCKUTZANSPRÜCHE

Claims (4)

Schutz ansprüche

1. Mikrokapseln aus pölymerem Material mit eingeschlossenen und/oder adsorbierten Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet , daß die kapseln einen Durchmesser von misellarer Größenordnung von 20 - 200 Nanometer aufweisen und in Wasser kolloidal löslich sincu

2. Mikropkapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das polymere Material poröse Struktur aufweist.

3· Mikrokapseln nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gr e k e η η zeichnet , daß das polymere Material ein Gel, vorzugsweise aus polymerisiertem Acrylamid, Ν,Ν'-methylen-bis-acryi· amid, aus Acrylsäure und/oder deren Derivaten ist.

4. Mikrokapseln nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet _t daß der mittlere Kapseldurchmesser unter 80 Nanometer beträgt,"