DE2327893A1

DE2327893A1 - Verfahren zur waermefraktionierung von lactatdehydrogenase in die isoenzymkomponenten

Info

Publication number: DE2327893A1
Application number: DE2327893A
Authority: DE
Inventors: Anne C Delea; Rush Robert L Erf; Edward D Lash; Frankfurt Pat-Anwaelte; W Dipl Ing Reichel; Robert L Rush; Milos Stastny; Daniel L Vlastelica; Reichel W Dr Ing Vtr
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1972-06-09
Filing date: 1973-06-01
Publication date: 1973-12-13
Also published as: NL7305801A; IT992068B; FR2187803A1; FR2187803B3; CA999507A; US3862010A; BE799119A; JPS4961382A; AU5563673A

Description

Paienicmwälie

g.'Wilhelm ßeichel
WpJ-iog. Waligang BeicJiel

6 Frcmkiuri a. M. 1
Parksiraße 13

7412

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y. VStA

Verfahren zur Wärmefraktionierung von Läctatdehydrogenase in die Isoenzymkomponenten

Die Erfindung betrifft eine Wärmefraktionierung, die auf Serumproben angewandt wird, um die Isoenzyme zu fraktionieren, die sich in der Läctatdehydrogenase (LDH)-Kompo-. nente finden. Insbesondere betrifft die Erfindung eine rasche Fraktionierung der Serumlactatdehydrogenase durch Erhitzen der Serumprobe während kurzer Zeit bei einem pH-Wert von 7 bis 10 in Gegenwart einer Pufferlösung mit einer Konzentration, die praktisch die Inaktivierung bestimmter oder spezifischer Isoenzymmolekül© gestattet.

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LDH ist ein Enzym, das sich in menschlichem Gewebe, insbesondere reichhaltig in Nieren-, Herz-, Leber- und Muskelgeweben findet. Da in normalen Serumproben der LDH-Gehalt verhältnismäßig konstant bleibt, zeigt seine Erhöhung Gewebedisfunktionen oder -krankheiten an.

Die Bestimmung der LDH-Aktivität in einer Blutprobe beruht auf der Verwendung von Lactat als Substrat in alkalischer Lösung, das die gleichzeitig ablaufende Reduktion von Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) in die reduzierte Form, d.h. NADH ablaufen läßt. Diese zuletztgenannte Umwandlung wird fotometrisch gemessen. Die Konzentration an Enzym (LDH) ist direkt proportional der Erhöhung der NADH-Konzentration.

Bei dem Verfahren wird ,die auf LDH-Aktivität zu untersuchende Probe im. allgemeinen etwa 6 min lang bei einem pH-Wert von 9 auf 37 ⁰C erhitzt. Danach wird die spektrofotömetrische Bestimmung durchgeführt,

Kürzlich wurde gefunden, daß LDH aus fünf Isoenzymen besteht, die der Einfachheit halber im folgenden als LDH.., LDH₂, LDH,, LDH^ und LDH= bezeichnet seien. Diese Isoenzymne sind isoliert und durch Elektrophorese identifiziert worden.

Die Bedeutung der Kenntnis der Existenz dieser Isoenzyme äußerst sich in ihrer Anwendung als diagnostisches Hilfsmittel. Das Verhältnis der verschiedenen Isoenzymfraktionen, d.h. das Isoenzymmuster, variiert von Gewebe zu Gewebe. Beispielsweise besitzen Herzextrakte ein Muster, in dem die Fraktionen LDH^ und LDH₂ vorherrschen.

Entsprechend zeigt Lebergewebe ein Überwiegen der LDH=- Fraktion.

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Die Nützlichkeit dieser Beobachtungen zeigt sich in der Praxis daran, daß eine Erhöhung der normalen Serum-LDH-Werte einer Erhöhung in einer oder mehreren Isoenzymfraktionen zuzuschreiben ist, die wiederum bis zu dem affizierten Gewebe zurückverfolgt werden kann.

Beispielsweise steigt nach einem Herzmuskelinfarkt der LDH-.-Wert im Serum an, und zwar sogar'bevor die LDH-Gesamtaktivität normale Werte überschreitet, was die Frühdiagnose erleichtert. Während die LDH-Gesamtaktivitat durchschnittlich zehn Tage nach dem Infarkt erhöht bleibt, dauert die Erhöhung des LDH^-Isoenzynwertes außerdem gewöhnlich bis in die dritte Woche an.

Ein anderes der Isoenzyme, nämlich LDH=, erwies sich bei akuten und chronischen Leberschäden als in seiner Aktivität erhöht.

Die üblichste Methode zur Trennung der LDH-Isoenzyme ist die Elektrophorese, die bei derartigen Messungen immer noch als Standardmethode angesehen wird. Jedoch ist sie für praktische Zwecke wegen ihrer Zeit- und Arbeitsaufwendigkeit nicht annehmbar .

Ein weiteres Verfahren, das auf diesem Gebiet durchgeführt wird, bedient sich der Wärmefraktionierung von LDH in die Isoenzymkomponenten, wobei bestimmte LDH-Isoenzymfraktionen, wie LDH₁ und LDH₂, bei Temperaturen von 65 ⁰C stabil sind, während Fraktion LDH₅ bei 57 ⁰C und LDH₂, LDH₃ und LDH₄ zwischen 57 und 65⁰C inaktiviert werden. Zufolge dieses Unterschiedes in der WärmeStabilität kann man Vergleiche zwischen wärmestabilen und wärmelabilen LDH-Isoenzymfraktionen anstellen. Auf diese Weise gelingt es, die relativen Mengen verschiedener Isoenzymfraktionen der LDH zu bestimmen.

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Die wärmelabile LDHc-Fraktion, die durch Erhitzen auf 59 °C zerstört wird, macht etwa 10% der gesamten LDH-Aktivität im normalen Serum aus. Demzufolge liefert eine Erhöhung der LDH-Aktivität auf über 30% (gewöhnlich 30 bis 70%) der Gesamtaktivität einen guten Hinweis darauf, daß ein akuter oder chronischer Leberschaden beim Patienten vorliegen kann. Falls die Summe der Aktivitäten der wärmestabilen LDH₁- und LDHp-Fraktionen 85% oder einen noch größeren Anteil der Gesamt-LDH-Aktivität ausmacht, wird eine Herzdisfunktion oder -krankheit angezeigt.

Der Test beruht also auf einem Vergleich zwischen der LDH-Gesamtaktivität und der der wärmeempfindlichen und der wärmestabilen Fraktionen.

Bisher hat man die LDH in der Serumprobe dadurch fraktioniert, daß man die unverdünnte Serumprobe etwa 30 min bei einem pH-Wert von etwa 7,0, dem'pH-Wert der Probe, auf 56 ⁰C erhitzte, die Temperatur, bei der die LDH₅-Fraktion inaktiviert wird.

Der sichtliche Nachteil der bekannten Methode bei Verwendung der hochkomplizierten diagnostischen Instrumente, die einen kontinuierlichen Strom voraussetzen, ist schwerwiegend. Wenn hunderte von Proben untersucht werden sollen, so ist es unpraktisch, jede einzelne von ihnen nach Bestimmung der LDH-Gesamtaktivität 30 min lang zu erhitzen. Ein derartiger Verfahrensschritt würde eine* Anwendung auf eine Vorrichtung, die mit kontinuierlichen Strömen arbeitet, nicht fähig sein.

Ziel der Erfindung ist die Beseitigung dieser Nachteile.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fraktionierung von Lactatdehydrogenase (LDH) in einer Serumprobe in ihre Isoenzymkomponenten zur Durchführung diagnostischer Bestimmungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

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die Serumprobe mit einer wäßrigen Pufferlösung vermischt, daß man dieses Gemisch auf eine Temperatur erhitzt, die ausreicht, um die Lactatdehydrogenase zu fraktionieren, wobei die wäßrige Pufferlösung einen vorgegebenen pH-Wert und einen Gehalt an Ionen aufweist, der ausreicht, um während des Erhitzens bestimmte Isoenzymmoleküle praktisch zu inaktivieren, daß man das Gemisch aus Serumprobe und Pufferlösung auf eine. Temperatur von mindestens unterhalb 37 °C rasch abkühlt und von der gekühlten Probe b@i praktisch dem vorgegebenen pH-Wert die Restaktivität an Laetatdehydrogenase bestimmt.

Bevorzugte Durchführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens bestehen darin, daß man

a) etwa 0,5 bis etwa 5 min lang und insbesondere etwa 40 see lang erhitzt;

b) als Puffer eine 0,67.molare wäßrig© Lösung von Aminomethylpropanol verwendet;

c) einen pH-Wert für das Gemisch von 7 bis 10 und insbesondere etwa 9 anwendetj

d) bei einer Temperatur der Mischung von etwa 55 bis etwa 65 ⁰C und insbesondere 62,5 ⁰C arbeitet und

e) während 30 bis 60 see abkühlen läßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Analyse zahlreicher Proben im kontinuierlichen Strom mit einer Geschwindigkeit, die sich für eine Vorrichtung mit kontinuierlichem Strom eignet, so daß eine sofortige Bestimmung der fraktionierten LDH-Aktivität an zahlreichen, im kontinuierlichen Strom geführten Proben nacheinander mit lediglich einem einfachen Erhitzungsschritt und anschließender Abkühlung, wonach die Probe zur Bestimmung der restlichen LDH-Aktivität vorbereitet ist, ermöglicht wird.

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Aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit die Hitzefraktionierung in technischem Maßstab anwendbar.

Das Endergebnis ergibt sich durch einen Vergleich zwischen der 'bestimmten Gesamt-LDH und der Bestimmung der fraktionierten LDH. Wenn daher diese Schritte nacheinander oder gleichzeitig auf parallelen Doppelkanälen durchgeführt werden, ohne daß eine unzweckmäßige Wartezeit eingeschaltet werden muß, ist das Gesamtverfahren nicht nur zeitsparend, sondern auch für einen kontinuierlichen Stromanalysator geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Zusammenfassung der einzelnen Schritte durch das rasche Erhitzen in etwa 40 see und anschließend© schnelle Abkühlung vor der Bestimmung der Aktivität der fraktionierten Lactätdehydrogenase.

Die LDH-Gesamtaktivität sowie die Aktivität der fraktionierten LDH können beim gleichen pH-Wert und den gleichen Pufferbedingungen bestimmt werden. Ein aliquoter Teil des Serums wird bei einem pH-Wert von 7 bis 10 und einer Temperatur von etwa 37 ⁰C auf Gesamt-LDH analysiert. Ein anderer, gleicher aliquoter Teil-wird in dem gleichen pH-Wertbereich rasch auf eine Temperatur von 55 bis etwa 65 ⁰C und vorzugsweise auf etwa 62,5 ⁰G erhitzt, gekühlt und auf die LDH-Restaktivität hin analysiert.

Es wurde gefunden, daß bei dem vorliegenden Verfahren vier kritische Variablen auftreten, die sämtlich miteinander verknüpft sind. Die optimalen Bedingungen für einen im Bereich zwischen 7 und 10 festgesetzten pH-Wert.müssen notwendigerweise empirisch bestimmt werdenο

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Es kommt wesentlich darauf an, daß der pH-Wert während der Fraktionierung und der anschließenden Bestimmung der gleiche ist wie der bei der Bestimmung der gesamten LDH-Aktivität.

Es wurde beispielsweise gefunden, daß, wenn der pH-Wert bei 9 gehalten wird, was bevorzugt ist, eine Erhitzung während etwa 40 see auf eine Temperatur von annähernd 62 bis 63 ⁰C erforderlich ist, wenn ein Aminomethylpropanol enthaltender Puffer verwendet wird. Außerdem ist eine 0,67 molare Lösung erforderlich, um einen hinreichenden lonengehalt im Puffer zu gewährleisten, damit bestimmte Isoenzymmoleküle praktisch inaktiviert werden»

Wenn,der pH-Wert unter 9 liegt, kann das Erhitzen über eine längere Zeitdauer erforderlich werden« Es ist möglich, daß unter bestimmten Bedingungen 10 oder 15 min lang erhitzt werden muß. Natürlich muß dabei bedacht werden, daß ein Erhitzen über 5 min hinaus von s@hr geringem Wert für die Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens ist.

Entsprechend wird die Erhitzungsdauer verkürzt, wenn sich der pH-Wert oberhalb 9 bewegt. Bei einem ρΉ-Wert von über Jedoch verläuft die Fraktionierung ;unpraktisch rasch. Außerdem treten Nebenreaktionen auf, die die Ergebnisse verfälschen. . -

Da das Gemisch während des Erhitzens einen pH-Wert zwischen 7 und 10 und vorzugsweise von 9 besitzen muß, sind bestimmte Pufferzusammensetzungen erforderlich.

Die folgende Zusammenstellung, die nicht erschöpfend ist, gibt Beispiele für in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Puffer:

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Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan • Glycin
Triethanolamin
Borat-Puffer
Ammonium-Puffer

Jede dieser Pufferzusammensetzungen hält einen pH-Wert im Bereich zwischen 7 und 10 aufrecht. Wenn der pH-Wert festgelegt ist, können die anderen Variablen bestimmt werden, um die optimalen Bedingungen für den verwendeten Puffer und angewandten pH-Wert zu erzielen. Diese Bestimmung ist nicht kompliziert, und die dabei erzielten Bedingungen fallen in die für das erfindungsgemäße Verfahren angegebenen Grenzen.

Der Fachmann kann Jede der Variablen nach Belieben vorher wählen, vorausgesetzt, daß sie in die angegebenen Bereiche fallen. Um jedoch optimale Bedingungen festzulegen, sind einfache Versuche erforderlich.

Wie bereits betont, werden durch das erfindungsgemäße Verfahren unter anderem folgende Vorteile erzielt:

1) Das Verfahren läßt sich in einer Vorrichtung zur Analyse eines kontinuierlichen Stroms anwenden, und

2) die kostspieligen und zeitraubenden Verfahren des Standes der Technik können abgelöst werden.

Beispiel I

0,2 ml einer Serumprobe werden mit 1,6 ml einer 0,67 molaren wäßrigen Lösung von Aminomethylpropanol und 1 Vol.% Milchsäure versetzt, wobei ein Endwert für den pH-Wert von 9,0^Λ erreicht wird.

Das Gemisch wird 40 see auf 62,5 ⁰C erhitzt und anschließend innerhalb 30 see auf etwa 25 ⁰C gekühlt.

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Das erhaltene Gemisch wird anschließend mit Nikotinamidadenindinucleotid (NAD) versetzt land in üblicher Weise auf Rest Lactatdehydrogenase analysiert.

Gleichzeitig mit der obigen Analyse wird aus einer gleichen aliquoten Probe die LDH-Gesamtaktivität wie oben ohne Durchführung der Wärmefraktionierung bestimmt.

Beispiel II

Das Verfahren gemäß Beispiel I wird mit einer Serumprobe wiederholt, die von einem Patienten mit Herzmuskelinfarkt stammt. Elektrophoretische Analyse ergab erhöhte LDH₁-und LDH₂-Isoenzyme. Der Wert für die fraktionierte LDH, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurde, betrug über 85%. ,

Hieraus ergibt sich, daß die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit denen der elektrophoretisehen Standardmethode übereinstimmten. <

Beispiel III

Das Verfahren gemäß Beispiel I wird mit einer Serumprobe wiederholt, die von einem Patienten mit Leberschaden stammt. Die elektrophoretische Analyse zeigte erhöhte UHiL- und LDHc-Werte. Die Analyse nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ergab einen Wert für die fraktionierte Lactatdehydrogenase von 5096.

Hieraus ergibt sich wiederum die Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach der elektrophoretischen Standardmethode.

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Beispiel IV

Das Verfahren gemäß Beispiel I wird mit der Abweichung wiederholt, daß statt des Aminomethy!propanols folgende Puffer verwendet wurden:

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Glycin

Triäthanolamin

Borat-Puffer

Puffer mit quaternärem Ammoniumsalz

Beispiel V

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß die Erhitzungsdauer 20 see, 60 see und 3 min betrug. Es wurden vergleichbare Ergebnisse erhalten,

Beispiel VI

Das Verfahren gemäß Beispiel I wurde mit der Abweichung wiederholt, daß bei pH-Werten von 7,6, 8,0 und 10,0 gearbeitet wurde. Es wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Fraktionierung von Lactatdehydrogenase (LDH) in einer Serumprobe in ihre Isoenzymkomponenten zur Durchführung diagnostischer Bestimmungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Serumprobe mit einer wäßrigen Pufferlösung vermischt, daß man dieses Gemisch auf eine Temperatur erhitzt, die ausreicht, um die Lactatdehydrogenase zu fraktionieren, wobei die wäßrige Pufferlösung einen vorgegebenen pH-Wert und einen Gehalt an Ionen aufweist, der ausreicht, um während des Erhitzens bestimmte Isoenzymmoleküle praktisch zu inaktivieren, daß man das Gemisch aus Serumprobe und Pufferlösung auf eine Temperatur von mindestens unterhalb 37 ⁰C rasch abkühlt und von der gekühlten Probe bei praktisch dem vorgegebenen pH-Wert die Restaktivität an Lactatdehydrogenase bestimmt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Erhitzen den gleichen aliquoten Teil der Probe kolorimetrisch auf die Gesamtaktivität an Lactatdehydrogenase analysiert.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Erhitzen bei einer Temperatur zwischen etwa und 65 ⁰C und insbesondere bei etwa 62,5 ⁰C durchführt.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Erhitzen etwa 0,5 bis etwa 5,0 min und insbesondere 40 see lang durchführt.

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5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man während des Erhitzens den pH-V/ert in einem Bereich von 7 bis 10 und insbesondere bei 9 hält.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer eine 0,67 molare wäßrige Lösung von Aminomethylpropanol verwendet.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer eine wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan, Glycin, Triäthanolamin oder eine borathaltige oder ein quaternäres Ammoniumsalz enthaltende wäßrige Lösung verwendet.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Abkühlen während 15 bis 90 see durchführt.

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