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Verfahren zur Herstellung von Tranexamsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tranexamsäure. Mit "Tranexamsäure" wird das antifibrinolytisch aktive Isomere der 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure bezeichnet (Vorschlag von British Pharmacopea und United States Approved Names).
Gesteigerte Fibrinolyse kann während der Menstruation und auch bei bestimmten Krankheiten nach chirurgischen Operationen auftreten. Wegen des ernsthaften Charakters von Blutungsstörungen dieser Art ist es günstig, eine Droge mit antifibrinolytischer Aktivität zur Verfügung zu haben. Die erste niedermolekulare synthetische Droge, die eine solche Aktivität aufweist, ist die nicht essentielle Aminosäure e-Aminocapronsäure (beschrieben in der USA-Patentschrift Nr. 2,939, 817), welche mit EACA abgekürzt wird.
Die antifibrinolytische Aktivität von EACA wurde in vitro und in vivo mit Versuchstieren geprüft.
Durch Anwendung von Streptokinase ist es möglich, bei Laborversuchen eine induzierte, gesteigerte fibrinolytische Aktivität hervorzurufen. Durch Titrationen und Bestimmung der Fibrinolyseperioden, die der Zugabe wechselnder Mengen von Streptokinase und EACA zu den Testsystemen folgen, kann die antifibrinolytische Aktivität von EACA bestimmt und mit der Wirkung bei der klinischen Anwendung für Patienten in Beziehung gebracht werden. So besteht eine hinreichende Parallele zwischen den Werten, die in den verschiedenen Laboratoriumsexperimenten erhalten wurden und jenen, die unter klinischen Bedingungen erzielt wurden.
Die wissenschaftliche Prüfung von EACA hat gezeigt, dass Präparate, welche EACA enthalten, bei der klinischen Anwendung eine annehmbare antifibrinolytische Aktivität aufweisen. Die EACA wird jedoch vom tierischen Organismus so rasch abgebaut, dass es zur Erzielung der erwünschten antifibrinolytischen Wirkung unter klinischen Bedingungen trotz der gegebenen relativen antifibrinolytischen Aktivität notwendig ist, in 24 h 25 g oder mehr anzuwenden.
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"Influence of AMCHA on the activity of fibrinolysin (palsmin)", Ibid., S. 117, geht hervor, dass a) AMCHA in gleicher Gewichtsmenge aktiver ist als EACA und b) die antifibrinolytische Aktivität von AMCHA etwa zweimal grösser ist als jene von EACA.
Die akute intravenöse Toxizität in Mäusen und Ratten, ausgedrückt als letale Dosis für 50% der Versuchstiere (LD ), zeigt jedoch, dass AMCHA etwa zweimal giftiger ist als EACA. So besteht also kein offensichtlicher klinischer Vorteil, wenn man an Stelle von EACA AMCHA anwendet.
Die Arbeit mit AMCHA, die zur Erfindung führte, ermöglichte die Identifizierung und Bestimmung der relativen Anteile von 2 Isomeren in der Substanz, die in den oben angeführten Veröffentlichungen
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nem, welches weiter oben als Tranexamsäure bezeichnet wurde. Dieses aktive Isomere liegt in einer Menge von etwa 10 bis 25% in der isomeren Mischung vor, d. h. in jenem AMCHA, welches nach bisher angewendeten synthetischen Verfahren hergestellt wurde, z. B. durch katalytische Hydrierung des Benzolkernes inder4-An) inomethyIbenzoesäure oder durch Reduktion undHydrierung von4-Cyanbenzoe- säure, wie in der brit. Patentschrift Nr. 949, 512 beschrieben.
Die Bewertung der antifibrinolytischen Aktivität der beiden einzelnen AMCHA-Isomeren nach den weiter unten angeführten Verfahren zeigt, dass das aktive AMCHA-Isomere zwanzigmal wirksamer ist als EACA, während das inaktive AMCHA-Isomere praktisch keine antifibrinolytische Aktivität aufweist.
Die klinische Anwendung von Zusammensetzungen, die eine hohe relative Menge des aktiven AMCHA-Iso- meren enthalten, ergibt also einen wesentlichen Vorteil. Dazu kommt, dass zwischen der akuten Toxi- zität (LD 5 -Werte) der isomeren AMCHA-Mischung, welche 10-25% aktives Isomeres enthält und der
Toxizität (LDso) der Tranexamsäure kein wesentlicher Unterschied besteht.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass 4-Halogenmethylcyclohexan- carbonsäure mit Ammoniak umgesetzt und die entstandene 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure aus der Reaktionsmischung isoliert wird.
Die Abtrennung, Identifizierung und quantitative Bestimmung der Tranexamsäure und des inaktiven Isomeren aus der isomeren AMCHA-Mischung und von andern Aminosäuren, welche die Proben enthalten können, erfolgte durch Papier-Elektrophorese nach der Methode von G. N. Atfield und C. J. O. R. Morris,.
Biochem. Journ., Band 81 [1961]. S. 606.
Die elektrophoretische Trennung erfolgt in einer Hochspannungs-Elektrophoreseapparatur, die eine Kühlplatte aus Glas aufweist, die mit Leitungswasser auf 2-130C gekühlt wird. Die Lösungen, die der Elektrophorese zugeführt werden, werden auf Chromatographiepapier des Typs"Munktell 302 M"aufge- bracht.
Das aktive AMCHA-Isomere wird von den andern möglichen Aminosäuren durch Papier-Elektrophorese bei einem PH von 4. 5 getrennt. Es wurde festgestellt, dass bei diesem PH das AMCHA zur Kathode wandert und von allen vorhandenen natürlichen Aminosäuren vollständig getrennt wird. Nach der elektrophoretischen Trennung wird das vorhandene AMCHA durch BehandelnmitNinhydrin-Reagenssichtbargemacht, der erhaltene Farbkomplex mit Methanol extrahiert und die Menge AMCHA spektrophotometrisch durch Vergleich mit Standardlösungen bestimmt.
Für die Wanderungsstrecken der verschiedenen Aminosäuren bei einem PH von 4. 5 und einem Spannungsgefälle von 50 Volt pro cm wurden nach 200 min bei 60C folgende Werte gefunden :
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<tb>
<tb> Alanin <SEP> 25mm
<tb> Tranexamsäure <SEP> 135 <SEP> mm <SEP>
<tb> EACA <SEP> 150 <SEP> mm <SEP>
<tb> Inaktives <SEP> AMCHA-Isomeres <SEP> 160mm <SEP>
<tb> Lysin <SEP> 240 <SEP> mm <SEP>
<tb>
Der Puffer mit PH 4. 5 wurde aus 40 ml Essigsäure. 40 ml Pyridin, 160 ml Aceton und dest. Wasser auf 1000 ml hergestellt.
Das verwendete Ninhydrin-Reagens wurde von J. Heilmann, J. Barollier und E. Watzke in Hoppe-Seyl Zeitschrift, Band 309 [ 1957], S. 219, beschrieben und wurde aus 0, 050 g Cadmiumacetat, gelöst in einer Mischung aus 5,0 ml Wasser und 1, 0 ml Essigsäure durch Zugabe von 50 ml Aceton und Schütteln der Mischung bis zur Auflösung der Feststoffe und Zugabe von 0. 50 g Ninhydrin hergestellt. Dieses Reagens war nur einen Tag lang brauchbar.
Das Methanol zum Auflösen der gefärbten Flecke ist redestilliert oder von analytischer Qualität.
Standardlösungen wurden für den Vergleich hergestellt und bestanden aus reiner Tranexamsäure, welche mit folgenden Konzentrationen in Wasser gelöst wird : 20, 10, 5 und 2,5 mg pro ml. Diese Mengen entsprechen 120, 60,30 und 15y reiner Tranexamsäure, z. B. einer solchen, welche durch Elektrophorese aus der isomeren AMCHA-Mischung isoliert wurde.
Analysenvorschrift : 6 iL 1 der einzelnen Standardlösungen wurden getrennt auf das Chromatographierpapier aufgebracht, ebenso die unbekannte Probelösung. Das Papier wurde dann durch Besprühen mit der Pufferlösung befeuchtet, auf die Kühlplatte der Apparatur gelegt und die Elektrophorese, wie oben beschrieben, durchgeführt. Das Chromatographierpapier wurde dann 2 h mittels kalter Luft ge-
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trocknet, in das Ninhydrin-Reagens eingetaucht und wieder getrocknet. Das Papier wurde dann in der
Dunkelheit in einem luftdichten Gefäss über konzentrierter Schwefelsäure (um die Atmosphäre ammoniak- frei zu halten) aufbewahrt.
Nach 20h wurden die gefärbten Flecke zusammen mit einem entsprechenden Anteil eines nicht ge- i färbten Teiles des Papiers entfernt und mit Methanol extrahiert. Die roten Lösungen wurden filtriert und ihre Extinktion bei 500 mg gegen die Vergleichsprobe gemessen.
Die erhaltenen Zahlen wurden zur Feststellung der Menge an Tranexamsäure in der Probe verwen- det. Der Gehalt an inaktivem Isomerem wurde nach dem gleichen Verfahren festgestellt.
Eigenschaften der Kristalle der Tranexamsäure : Aus den analytischen Verfahren und den Werten der Infrarot-Spektroskopie, der magnetischen Kernresonanz und der Röntgenkristallographie geht hervor, dass das aktive AMCHA-Isomere in seinen Kristallen als inneres Salz (d. h. Zwitterion) vorliegt und die Kri- stallachsen a = 6, 29, b = 7, 90 und c = 16, 66 aufweist.
Die quantitative Bestimmung der antifibrinolytischen Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme der
Verfahren von L. E. Christensen in J. clin. Invest., Band 28 [1949], S. 163 und A. E. Wasserman et. al. in J. Lab. clin. Med., Band 4 [1953], S. 812. Bei dieser Technik wird die Menge an Tranexamsäure ge- messen, die für das Hervorrufen einer 50%igen Hemmung der, in vitro durch Streptokinase induzier- ten Fibrinolyse erforderlich ist. Das System besteht aus Fibrinogen, Plasminogen und Thrombin. zude- nen 6 Einheiten Streptokinase zugefügt werden, welche einen lythischen Effekt bewirkt. Die untersuchte
50% ige Hemmung entspricht einer lythischen Aktivität von 3 Streptokinase-Einheiten. Die Streptoki- nase aktiviert das Proenzym Plasminogen zu Plasmin und dieses zuletzt genannte Enzym besitzt fibri- nolytische Aktivität.
Die Zeit, die für das gebildete Plasmin erforderlich ist, um ein Standard-Fibrin- koagulum aufzulösen, wird bestimmt.
Die folgende Tabelle enthält Werte über die antifibrinolytische Aktivität verschiedener Verdünnun- gen in vitro, ausgedrückt als 50%ige Hemmung von 6 Streptokinase-Einheiten.
Tabelle
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<tb>
<tb> Relative <SEP> Tatsächliche <SEP> Menge
<tb> Aktivität <SEP> der <SEP> Verbindung
<tb> EACA <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> r <SEP>
<tb> AMCHA <SEP> (enthaltend <SEP> 10%aktives <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> y
<tb> Isomeres)
<tb> Aktives <SEP> AMCHA-Isomeres <SEP> 10 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> r <SEP>
<tb> Inaktives <SEP> AMCHA-Isomeres <SEP> 0,1 <SEP> 30 <SEP> γ
<tb>
Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel l : 200g 4-Brommethylcyclohexancarbonsäure werden zu 2500 ml konzentriertem wässerigem Ammoniak zugefügt. Nachdem die Reaktionsmischung 100 h bei 250C gehalten wurde, wird sie zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zweimal mit je 1000 ml kochendem Methanol extrahiert.
Der Methanolextrakt wird eingedampft und aus Wasser umkristallisiert. Die Reinheit der so erhaltenenak- tiven Tranexamsäure ist mindestens 95%, wie aus der Analyse durch Hochspannungselektrophorese hervorgeht. (Fp. : 386-392 C). Sie kann ohne weitere Reinigungsschritte für pharmazeutische Zwecke eingesetzt werden. Die spektroskopische Bestimmung ergibt eine Ausbeute an Tranexamsäure von 40 % der Theorie.
Beispiel 2 : 200 g trans-Form der 4-Brommethylcyclohexancarbonsäure werden zu 2500ml konzentriertem wässerigem Ammoniak hinzugefügt. Nach 100 h bei 250C wird das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und der Rückstand zweimal mit je lOOOmIkochendemMethanolextrahiert. Der Methanolextrakt wird eingedampft und aus Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute an Tranexamsäurebetragt 60% der Theorie, Fp. : 386-3920C. Die mit Hilfe der Hochspannungselektrophorese festgestellte Reinheit des Produktes liegt über 98%.