DE2120402A1 - Verfahren zur Herstellung indizier ter Aminosäuren - Google Patents

Description

Or. Ing. Walter Abitz
Dr. Diäter "F. Morf
Dr. Hans-A. Brauns 26. April 1971

8München86, Pienzenauerstr. 28 13294.

Charles Ii. Frosst & Co., Kirkland, Quebec / Kanada

Verfahren aur Herstellung indizierter Aminosäuren

Die Erfindung befaßt sich jeü; einem Verfahren aur Herstellt 15 lung von ^H-1-Tvrosin unter Verwendung von IT-L-Asp&ragin-·

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säure oäer ^N-I-ölutdainoäure als Stickstoff quelle».

Das Verfahren der Erfindung usifaßt die Übertragung von indiziertem bzw. mit Radioisotopen versetztem Stickstoff in der Aminogruppe der gewählten L-Aaiinosäure auf p-HydXOxyphcnyl-

1¹S brenztraubensäure} unter Bildung von "iT-L-Tyroain. Die Aininotranßi*era,3erea)rtion wird durch das Ensym l'yrosin-arainotranßferase katalysiert, wenn die indizierte Stickstoffquelle

jtJ-Ir-irlutaininsäure iet, und wenn die indisierte Stickstoff-

1S
quelle ^N-Ir-Asparaginßäure ist, wird Asparagin-arainotraii3~ ferase? als Enssymkatalysator verwendet. Obgleich rohe, Gans» zellenzysne im Verfahren der Erfindung verwendet werden können,

1¹S
wird die Ausbeute an *\l?-Ir*Tyrosin erheblich gesteigert, wenn gereinigtes Enzym als ein Katalysator in dem neuen Verfahren eingeri&tst wird. Dreifache Reinigung des Enzyms steigert die Ausbeut« an indiziertem Tyrosin auf ein erhebliches Ausmaß, jedoch wird bei einer Herstellung der gewünschten Aminosäure

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in großem Maßstab mit hoher Ausbeute eine fünffache oder stärkere Reinigung des Enzyms bevorzugt. Hochgeroinigte Äsparsgin-aminοtransferase ist im Handel erhältlich und wurde in dein Verfahren der Erfindung verwendet* Jedoch wurde ein Verfahren zur Reinigung des Ensyms Syronin-aniinotrannferase als ein weiteres Merkmal der Erfindung entwickelt, und dieses Verfahren wird im folgenden beschrieben. Es ist natürlich offensichtlich, daß Modifikationen dieses Verfahrens vom Pachraami auf diesem Gebiet vorgenommen werden können, ohne den Rahmen dor Erfindung bu verlassen.

Gereinigte Tyrosin-aminotransferase wird in vorteilhafter Weiße wie folgt hergestellt. Die E. coli B-Zellen werden aufgebrochen und in einem neutralen Puffer (pH 6,5-7,5), der die

W enzymechütζenden Mittel Pyridoxalphosphat und a^Kotoglutarat enthält,, suspendiert. Eine weitere Enzymstabilisierung wurde durch Verwendung eines Thiolschutzmittels (Dithiothre.it, Dithioerythrit, Cystein, Glutathion, Mereaptoäthanol, 2,3-Dimercnptopropanoi oder Ehioglykolat) herbeigeführt. Das Enzym wurde vor Inaktivierung durch Schwermetallionen durch Verwendung eines Koaiplexbildungsmittels (Äthyieiidiamin- t etraacetat, Pyrophosphat, Cyanid, Hydroxychinolin oder Schwefelwasserstoff) geschütst. Der Ensymextrakt wird auf pH 5,ö eingestellt (dieser pH-Wert ist kritisch +0,2 pH-Eiüheiten) und festes Material wird wieder entfernt. Die Lösung v;ird auf 6,5 (6-7) eingestellt und Araraoniumaulfat zugegeben, ura 50 %-±qq (40-60) Sättigung zu

fc erhalten: (Wenn uich der pH-Wert ändert, muß die zugegebene Menge an Ammon3.um3ulfat gleichfalls geändert werden), Das Gemisch wird gekühlt^ und festes Material v/ird abgetrennt. Eine Extranienge Aimnoniuiasulfat wird zugegeben, um eine 65 $-ige (60-70) Sättigung zu ergeben, es wird gekühlt^und die feste Tyrosin-aminotransferase wird gewonnen.

In diesen Verfahrensmaßnahmen können viele Änderungen vorgenommen werden, jedoch stellt das beschriebene Verfahren eine

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einzigartige Kombination von Variablen dar, die eine hohe Ausbeute an Tyrosin ergibt.

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Die Ausbeute an H-Ir-Tyrosin kann weiter gesteigert werden,

ein Überschuß über die stöchiometrische Menge an p-Hydroxypheny!brenztraubensäure verwendet wird; eo wurde festgestellt, daß ein fünffacher Überschuß zu optimalen Ausbeuten ohne übermäßigen Anstieg der Herstellungskosten führt. Es können annehmbare Ausbeuten jedoch erhalten werden, wenn irgendwelche im Bereich des Einhalb- bi3 Siebenfachen dor stöchiometriochen Menge an p-Hydroxyphenylbrenatraubensäure liegende Mengen verwendet werden. Es wurde auch gefunden, daß durch Beibehaltung des pH-Wertes des Reaktionsgerssches bei neutralen oder leicht basischen Bedingungen und vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,4 - 8,0, bevorzugt bei einem pH-Wert von 7»8, die Ausbeute an dem gewünschten indizierten Ir-Tyrosin gesteigert wird.

Die Bildung von Tyrosin in dem Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung eines für die Erfindung entwickelten neuen Tyrοεin-AnaIyseverfahrens verfolgt werden, das in den folgenden Beispielen im einzelnen beschrieben wird. Um die Bildung von Tyrosin zu verfolgen, wird eine kleine Probe do3 Reaktionegemißches durch einn Mikrokolonne elulexH·, die ein basisches Harz enthält, das entweder stark oder schwach basisch sein

15 kann, wodurch eine reine Probe von N-L-Tyrosin geliefert wird. Dowex-1 Harz (ein Cholestyraminharz) in der Acetatfora, erwies sich als sehr geeignet. Diese Probe wird dann hinsichtlich des Tyrosingehalte3 unter Verwendung des Folin-Ciocalteu·- Phenol-Reagenzes analysiert.

15 Das nach dem Verfahren der Erfindung erhaltene N-L-Tyrooin wird gereinigt, indem das Reaktionsgemisch durch eine Kolonne eines basischen Harzes, wie beispielsweise Dowex-1, eluiert wird, das Eluat zur Trockene eingedampft wird und das Tyrosin aus heißem Wasser oder aus einem Gemisch aus heißem Wasser und Alkohol umkristallisiert wird.

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Das neue Vorfahren der Erfindung besitzt den Vorteil, daß es nur das L-Isomere erzeugt, während chemische Synthesen gewöhnlich DL-Racemate ergeben, die dann wieder aufgelöst werden müssen, um das brauchbare L-Isomere zu erhalten. Außerdem macht das Verfahren wirksamen Gebrauch von Stick«

1 ζ ßtoff-15 und kann daher zur Herstellung von ■ N-L-Tyrosin entweder mit einem hohen Verhältnis N/ Ν oder einem niederen Verhältnis ^N/ N verwendet werden. Wenn reine oder teilweise gereinigte Enzyme in dem Verfahren verwendet wer« den, ist die Reaktion reproduzierbar, und es tritt keine isotopische Verdünnung ein.

k Die für Tyrosin entwickelte Analyse und ebenfalls die Rei« nigung der Tyrosin-aminotransferase werden im folgenden beschrieben:

Analyse des Tyrosins

Die Pipetten (zweckmäßig 145 mm (5 3/4") Pasteur Pipetten) werden siliconisiert, so daß Wasser das Glas nicht benetzt. Ein Glasjtf ollepfropfen wird dann eingeführt, und die Pipette wird dann mit Dowex-1 χ 8, Siebkorngröße 74-37/u (200-400 mesh) oder einem anderen basischen Harz, das vorher mit 10 $- iger KatriuinhydroxidlÖBung, dann mit 10 $~iger ChlorwasserstoffsäurGlösung gewaschen wurde, gepackt, mit 0,5 m-Esaig- w säure beschickt und mit 0,05 m-Esoigsäurelösung das Gleichgewicht eingestellt. Die auf Tyrosin zu analysierende Probe (0,20 ml) wird sorgfältig oben auf das Harz aufgegeben. Tyrosin wird dann durch das Harz mit genau 1,00 ml 0,05 m-Esaigsäurelösung eluiert. Da die Flüssigkeitahöhe in der Kolonne stets zu der Oberfläche dee Harzes abzieht und dann anhält, ist das reine Tyrosin in einem Gesamteluat von 1,20 ml enthalten. Die Kolonnen werden mit 2 ml 0,05 m-Essigsäurelösung regeneriert und sind dann fertig für eine andere Probe. Zu der Tyrosin-Probe in dem Versuchsrohr werden 1,50 ml 4 Natriumcarbonat in 0,20 n-Natriumhydroxidlösung zugegeben*

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Hach 10 Minuten wird O;30 ml In-Folin-Ciocalteureagenz zugegeben und rasch vermischt. Maximale Parbintensltät wird in 30 Minuten erreicht, wenn die Absorptionsfähigkeit bei 750 nn» in einer 10 mm Küvette gemessen wird. Wie vorher wird die 5yrosin-Konzentration aus einer in der gleichen Weise abgeleiteten Standardkurve ermittelt. Die Absorptionsfähigkeit verläuft linear bei Konzentrationen von 0,000 bis 0,200 mg/ml.

Reinigung der !Pyrοsin-amlnotransfersse

Eine wirksam auf einem Nährsehrägagar wachsende E. coli B-Kultur wird zur Beimpfung einer Starterkultur in 100 ml Wuchsmedium des von Peldman et al in J. Biol. Chem. 1.87 ♦ 821 (1950) beschriebenen Typs verwendet. Die Kultur wird bei 37⁰C mit Belüftung während 18 Stunden gezüchtet und dann zur Beimpfung von 3 1 Wuchsmedium der gleichen Zusammensetzung verwendet, flach 18 Stunden werden die Zellen bei 2⁰C durch Zentrifugieren bei 16500 χ g während 12 Minuten gewonnen. Die Zellen werden in etwa 100 ml kaltem 0,067 m-Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, resuspendiert und dann wie oben gesammelt. Andere Puffer, wie beispielsweise Tris- oder Pyrophosphat, können auch verwendet werden, oder der Puffer kann weggelassen werden, wenn gewisse andere Mittel, z. B. eine pH stat QJitrationsvorrichtung verwendet wird, um den pH-Wert konstant au halten. Der pH-Wert kann im Bereich von 6-8,5 gehalten werden. Der Zellklumpen wird in einen durch ein Eisbad gekühlten Mörser gebracht und mit zwei Volumen Aluminiumoxid bakteriologischer Qualität (als eine dicke Paste) 15 Minuten zermahlen. Die Paste wird auf 300 ml mit kaltem 0,067 m-Natriumphosphatpuffer, pH 7»2, der 0,0002 m-Pyridoxalphosphat, 0,002 m-Natrium-a-ketoglutarat, 0,001 m-lthylendiamintetraacetat und 0,001 m-Dithiothreit enthält, verdünnt. Das Aluminiumoxid und das Zellsediment werden durch Zentrifugieren der Suspension bei 28 700 χ g während Minuten (2⁰C) entfernt, das überstehende Material auf pH 5_f8 mit 10 ?£-iger Essigsäure eingestellt und dann 5 Minuten bei 55⁰C erhitzt. Es wird gekühlt und bei 28 700 χ g 30 Minuten

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(2⁰C) zentrifugiert. Die überstehende lösung wird entfernt und mit in-ETatriumhydroxidlösung auf pH 6,5 eingestellt, das Volumen der überstehenden lösung gemessen (280 ml) und genügend Ammoniumsulfat zugesetzt, um eine 50 #-ige Sättigung zu ergeben. Nach einstündigem Stehen im Kühlschrank (O⁰C) wird ausgefälltes Protein durch Zentrifugieren während 45 Minuten bei 31 000 χ g entfernt. Das Volumen der überstehenden lösung wird gemessen und weiteres Amiaonium-Bulfat zugesetzt, um 65 #-ige Sättigung zu ergeben. Wiederum· nach einstündigem Stehen bei O⁰C wird die Suspension bei 31 000 χ g während 45 Minuten zentrifugiert, die überstehende lösung verworfen und der Klumpen in 40 ml 0,067 ra-2Tatriumpbosphatpuffer, pH 7|2 (wie oben), gelöst. Diese Lösung enthält teilweise gereinigte Tyrosin-aminotransferase, die sich zur Verwendung im Verfahren der Erfindung eignet. Durch dieses Verfahren wird im allgemeinen eine 4- bis 8-fache Reinigung erreicht.

Beispiel 1

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'-"N-L-Tyrosin _aü3 '^N-Glutaminsäure

Die Reaktion wird in einem 0,01 m-Katriumphosphatpuffer, pH 7»8, der 1 /um/3 ml Äthylendiamintetraaceiat und 1 /um/3 ml Dithiothreit enthält, durchgeführt. In 420 ml dieses Puffera werden 350 mg ¹^N-L-Glutaminsäure (96,0 + 1 Atom $ ¹⁵N) und W 2,15 g p-Hydroxypheny!brenztraubensäure gelöst. Der pH-Wert wird mit 1m-Natriumhydroxidlösung wieder auf 7»8 eingestellt. Etwa 10 mg Pyridoxalphosphat und 17 ml !yrosin-amiuοtransferase, die wie vorstehend beschrieben, hergestellt und gereinigt wurde, werden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird langsam bei 37⁰C gerührt. Es werden periodisch Proben entnommen und auf Tyroein in der oben angegebenen Weise analysiert. Nach 64 Stunden wird die Reaktion abgebrochen, indem destilliertes Wasser unter Herstellung von 1 1 Lösung zugegeben wird und der pH-Wert auf 5_t0 mit 10 #-iger Essigsäure eingestellt wird. Das Gemisch wird auf Glaspapier filtriert und

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dann durch eine Kolonne mit Dowex~1 χ 8 (Sieblcorngröße 149-74,u, 100-200 mesh) von 4,0 χ 23 cm mit 0,05 in-Essigßäurelösung eluiert. Das Eluat (1500 ml) wird zur Trockene flashverdampft (40⁰C) und dann in einem minimalen Volumen siedendem Wasser gelöst. Fach Abkühlung beginnt die Kristallisation, und ein gleiches Volumen Alkohol wird zugegeben. Man läßt die Suspension 18 Stunden bei O⁰O, "⁵N-L-Tyrosin wird dann abgenutscht, einmal mit Äthanol gewaschen und aus einem Gemisch aus Wasser und Äthanol umkristallisiert. Bas Produkt wird gesammelt, getrocknet und gewogen, und man

A C

g erhält 237 mg, 55 # Ausbeute, bezogen auf ^N-L-GIutaminsäure.

A C

Der IsotopengGhalt betrug 97+1 Atom

Beispiel 2 • ^N-Hj-Tyrosin aus ^N-L-Asparaginsäure

Die Reaktion wird in dem gleichen Puffer wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. In 850 ml Puffer werden 630 mg

N-L-Asparaginsäure, 200 mg a-Eetoglutarsäure und 4,30 g

p-Hydroxypheny!brenztraubensäure gelöst. Der pH-Wert wird mit 4oi-Katriumhydroxidlöaung wieder auf 7,8 eingestellt, und es worden 50 mg Pyridoxalphosphat und 4 mg Asparagin-aminotransferase (Sp. Act. 250 E.U./mg) anschließend zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert und

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dann die N-Ir-Tyrosin-Syn these durch Zugabe von 25 ml der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen gereinigten Tyrosin» aminotransferase eingeleitet. Die Synthese verläuft 46 Stunden bei 37⁰C. Das Reaktionsgemisch wird auf 1800 ml verdünnt, mit 10 96-iger Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, und man erhält 652 mg ^N-Tyrosin (76 % Ausbeute, bezogen auf Asparaginsäure).

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Claims (7)

Patentansprüche 15 '

1. Verfahren zur Herstellung von "if-IHCyroain, dadurch

gekennzeichnet, daß p-Hydroxypheny!brenztraubensäure mit "'H-L-Glutaininsäure in Gegenwart von Tyrosin-aminotrans-

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ferase oder mit H-L-Asparaginsäure in Gegenwart von; Asparagin-aminotransferase umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1₉ dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens teilweise ^gereinigtes Enzym verwendet wird.

3» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß praktisch reines·Enzym verwendet wird.

;4« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dia Reaktion bei einem pH-¥art zwischen atwa 7 und 8 und •bei einsr !Temperatur von atwa 37⁰G durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1₉ dadurch gekennzeichnet, daß = wenigstens teilweise gereinigtes Snsym verwendet wird und die Reaktion bei einem pH-Wert zwischen etwa 7 Ms 8 und bei einer Temperatur von atwa 37⁰C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens teilweise gereinigtes Enzym verwendet wird und die Reaktion bei einem pi?-Wert von 7»8 und bei einer Temperatur von etwa 37⁰G durchgeführt wird.

7. Verfahren zur Reinigung voa Tyrosin-aminotransferase, dadurch gekennzeichnet, daß aufgebrochene E.- coil B-Zellen in einem wässrigen Medium suspendiert werden, das zwischen pH 6,5 und 7*5 gepuJSrt ist und IPyridoxalphosphat, a-Ketoglutarat, ein Schwennetallionen-Somplsxbildungsmittel und ein aJhiol-Enayai-Schutssiittsl enthält, dsr Enzymextrakt dann auf pH 5,8 + 0,2 pH Einheiten eingestellt wird und festes Material entfernt wird, dia verbleibende Lösung auf pH 6 bis

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7 eingestellt wird und Ammoniumsulfat zur Einstellung einer 40 bis 60 $-igen Sättigung zugegeben wird, das
Gemisch gekühlt und festes Material entfernt wird und die verbleibende Lösung wiederum mit Ammoniumsulfat zur Einstellung einer 40 bis 60 #-igen Sättigung behandelt wird, gekühlt wird und feste Tyrosin-aminotransferase * gewonnen wird.

ORIGINAL .INSPECTED 1098Ä6/1843 ^C0PY