DE2323106B2

DE2323106B2 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure aus Kohlenwasserstoffen

Info

Publication number: DE2323106B2
Application number: DE2323106A
Authority: DE
Inventors: Laurence Mackenzie Kingston Miall; George Frederick Broadstairs Parker
Original assignee: Pfizer Corp
Current assignee: Pfizer Corp
Priority date: 1972-05-19
Filing date: 1973-05-08
Publication date: 1978-07-13
Also published as: AR198413A1; IT1006580B; AT326595B; FR2185679A1; DE2323106C3; ATA423173A; AU5578573A; NL7306028A; BR7303652D0; DE2323106A1; BE799630A; IE38029B1; IL42264A0; LU67616A1; GB1369295A; FR2185679B1; ES414831A1; JPS4947588A; SU493979A3; IE38029L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Fermentation eines Zitronensäure ansammelnden bzw. akkumulierenden Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Kohlenwasserstoffe als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoffenthält.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein kontinuierliches Verfahren für diesen Zweck zur Verfügung zu stellen, das eine verbesserte Gesamtausbeute an Zitronensäure, bezogen auf die Kohlenwasserstoffquelle, und eine verbesserte Zitronensäure-Produktionsgeschwindigkeit, verglichen mit bekannten Fermentationsverfahren zur Herstellung von Zitronensäure aus Kohlenwasserstoffen gewährleistet.

Ein Ansatzverfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Fermentation eines Mikroorganismus in einem Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium ist in der DE-OS 20 50 361 beschrieben. Für den Fachmann hat es jedoch keineswegs nahegelegen, daß das Ansatzverfahren gemäß DE-OS 20 50 361 auch kontinuierlich durchführbar sein könnte und wirtschaftliehe Ausbeuten liefern könnte.

Die theoretischen Vorteile eines kontinuierlichen Verfahrens liegen zwar auf der Hand, jedoch weiß der Fachmann, daß es in der Praxis unmöglich ist, mikrobiologische Verfahren während längerer Zeiten mit so guten Ausbeuten durchzuführen, wie sie in Ansatzkulturen erreicht werden.

Überraschend ergab sich nun, daß bei Anwendung eines ganz bestimmten Mikroorganismus, nämlich Candida lipolytica ATCC 20228, unter Verwendung bestimmter Kohlenstoffquellen, eines bestimmten pH-Wertes und einer bestimmten Temperatur bei kontinuierlicher Führung des Verfahrens nicht nur ebenso gute, sondern sogar verbesserte Ausbeuten gegenüber dem Ansatzverfahren erhalten werden bo konnten.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Fermentation eines wäßrigen, als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff n-Alkane mit 14 bis 19 C-Atomen b5 dispergiert enthaltenden Mediums mit Candida lipolytica ATCC 20228, unter Aufrechterhaltung eines DH-Wertes des Mediums von 2,8-3,5 und einer Temperatur von 26 —30° C, welches dadurch gekennzeichnet isi, daß man das Verfahren kontinuierlich durchführt, indem man die Kohlenwasserstoffquelle und die essentiellen Nährstoffe für den Mikroorganismus kontinuierlich dem Fermentationsmedium zuführt und kontinuierlich Zitronensäure enthaltendes Medium in solcher Menge abzieht, daß das Fermentationsmedium auf im wesentlichen konstantem Volumen gehalten wird, und daß man schließlich die Zitronensäure aus dem abgezogenen Medium isoliert.

Gemäß Beispiel 1 der DE-OS 20 50 361 wird in einem Ansatzverfahren eine Ausbeute von etwa 50% erreicht, während bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es in Beispiel 1 erläutert ist, eine Ausbeute von 127 Gew.-% erhalten wird. Diese Beispiele können direkt miteinander verglichen werden, da in beiden Beispielen u. a. der gleiche Mikroorganismus verwendet wird.

Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren einzuhaltende pH-Wert von 2,8 — 3,5 kann zwar auch im Laufe des Ansatzverfahrens gemäß DE-OS 21 34 826, die ein Verfahren zur Herstellung eines Citrat-Isocitratgemisches durch Fermentation eines Kohlenwasserstoffe enthaltenden Mediums mit einer Candida-Hefe betrifft, auftreten, obwohl dort ein Anfangs-pH nicht unterhalb 4 empfohlen wird.

Wesentlich für die vorliegende Erfindung ist jedoch, daß unter ausgewählten, an sich bekannten Bedingungen, das Fermentationsverfahren kontinuierlich durchgeführt wird. Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Kombination von Verfahrensbedingungen und kontinuierlicher Verfahrensweise wird überraschenderweise neben den Vorteilen, die eine kontinuierliche Verfahrensweise mit sich bringt, eine überraschend hohe Ausbeute an Zitronensäure erzielt.

Das Fermentationsmedium kann sich in einem geeigneten Behälter befinden, der Einrichtungen zum Rühren bzw. Bewegen, falls erforderlich, Einrichtungen zur Einleitung von Luft in das Medium, Einrichtungen zur Einspeisung von Kohlenwasserstoffen und essentiellen Nährstoffen in das Medium, Einrichtungen für das Überfließen zum Abziehen des Mediums und zur im wesentlichen Konstanthaltung des Mediumvolumens in dem Behälter sowie Einrichtungen für die pH- und Temperaturkontrolle besitzt.

Der oder die Kohlenwasserstoffe werden dem Fermentationsmedium entweder getrennt von oder dispergiert in einer wäßrigen Lösung zugeführt, die die essentiellen Nährstoffe für den Mikroorganismus liefert. In beiden Fällen werden der oder die Kohlenwasserstoffe im allgemeinen in einer Menge von etwa 5 bis 20 Gew.-% (d.h. 50 bis 200g/Liter), bezogen auf das Volumen der die essentiellen Nährstoffe liefernden Lösung, zugeführt. Dieser Gesichtspunkt ist jedoch nicht kritisch, so daß auch niedrigere oder höhere Kohlenwasserstoffmengen angewendet werden können. Bei den essentiellen Nährstoffen handelt es sich z. B. um die zur Verfügung stehenden Stickstoffquellen, vorzugsweise stickstoffhaltige Salze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, sowie einfache, organische Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff. Es können jedoch auch andere organische Stickstoffquellen, wie Aminosäuren oder Peptone verwendet werden. Es ist allgemein bekannt, daß solche Vitamine, die in dem Vitamin-B-Komplex enthalten sind, insbesondere Thiamin, und solche Mineralkationen und -anionen, wie Magnesium, Kalium, Phosphat und Sulfat, für das Wachstum der Hefen wichtig sind oder wichtig sein können; diese werden der essentielle

Nährstoffe enthaltenden Lösung absichtlich in Form von Salzen zugesetzt. Solche Salze enthalten im allgemeinen auch als Verunreinigungen essentielle Spurenelemente, wie Eisen, Zink, Kupfer, Mangan und Kobalt. Diese Elemente werden der essentielle Nährstoffe enthaltenden Lösung vorzugsweise in Form einer Spurenelementlösung zugesetzt.

Das Fermentationsmedium kann auch andere Bestandteile enthalten, z. B. ein Tensid, um den Kohlenwasserstoff in der wäßrigen Phase in feinverteiltem 1« Zustand zu halten, oder ein Antischaummittel.

Der pH des Fermentationsmediums kann durch Zugabe von Basen, z. B. Alkali, in beliebiger Form innerhalb des gewünschten Bereiches gehalten werden. Am zweckmäßigsten erfolgt die pH-Regelung durch Zugabe von gasförmigem oder wäßrigem Ammoniak.

Die Temperatur des Fermentationsmediums kann durch beliebige, geeignete Einrichtungen gesteuert werden, z. B. unter Verwendung von Kühlrohren oder Kühlschlangen, die in das Medium eintauchen, oder mittels eines äußeren Kühlmantels.

Die Belüftung des Fermentationsmediums kann in jeder geeigneten Weise durchgeführt werden, z. B. durch Hindurchblasen von Luft durch das Medium. Vorzugsweise liegt die Belüftung im Bereich von 0,3 bis 1,5 Volumteilen Luft pro Volumteil des Mediums pro Minute, z.B. 0,48 bis 0,62 Volumteile/Volumteil/Min. Das Medium kann auch bewegt bzw. gerührt werden, um die Wirksamkeit der Belüftung und der Kohlenwasserstoffdispersion in dem Medium zu verbessern, falls dies erforderlich ist.

Dem kontinuierlichen Verfahren der Erfindung kann eine diskontinuierliche, d. h. ansatzweise Fermentation eines Mediums mit ähnlicher Zusammensetzung vorangehen, das ursprünglich eine Quelle für assimilierbaren 3^r> Stickstoff und eine geeignet hohe Kohlenwasserstoffkonzentration, z. B. im Bereich von 50 bis 200 g pro Liter, aufweist und einen Anfangs-pH im Bereich von 5 bis 8, vorzugsweise 7 bis 7,5 besitzt, um das Wachstum des Mikroorganismus zu ermöglichen. Wenn mit fortschreitender diskontinuierlicher Fermentation Säure gebildet wird, sinkt der pH und wird durch Zugabe von Basen, wie Ätznatron oder Ammoniak, auf einen Wert im Bereich von 2,8 bis 3,5 und insbesondere 3,2 bis 3,5, stabilisiert. -r>

Ammoniak oder Ammoniumhydroxid hat eine zweifache Funktion, indem es den pH regelt und als Quelle für assimilierbaren Stickstoff dient. Wird Natrium- oder Kaliumhydroxid als Neutralisationsmittel verwendet, so muß kontinuierlich assimilierbarer Stickstoff zugeführt werden, vorzugsweise Harnstoff oder ein Ammoniumsalz.

Wenn der Kohlenwasserstoffgehalt auf einen geeignet niedrigen Wert gefallen ist, z. B. weniger als 30 g/Liter, beginnt man mit der Zufuhr von Kohlenwas- v> serstoff und essentiellen Nährstoffen. Erreicht das Volumen ein vorbestimmtes Niveau, so läuft Zitronensäure enthaltendes Medium über und wird als Ablauf abgezogen.

Die anfängliche, diskontinuierliche Durchführung des to Verfahrens ist nach Maßgabe der für das Wachstum des Organismus und die hierdurch bewirkte Produktion von Zitronensäure sowie die Verminderung des Kohlenwasserstoffgehaltes auf den gewünschten Wert erforderlichen Zeit von variabler Dauer. Im allgemeinen beträgt b5 die Dauer etwa 12 bis 120 Stunden, üblicherweise etwa 50 bis 100 Stunden. Man läßt das Wachstum des Organismus im allgemeinen so lange fortschreiten, bis 1 bis 4 χ 10⁹ Zellen pro Milliliter des Mediums vorhanden sind, wobei dieser Wert hoch genug ist, um die Bildungsgeschwindigkeit der Zitronensäure auf einem geeigneten Wert zu halten, jedoch nicht so hoch ist, daß die Aufarbeitung des Ablaufs zu schwierig wird oder eine Erniedrigung der Zitronensäureausbeute eintritt.

Auch der Kohlenwasserstol'fgehalt des Mediums beim Ende der anfänglichen, diskontinuierlichen Durchführung ist nach Maßgabe des Kohlenwasserstoffgehaltes, bei dem das kontinuierliche Verfahren durchgeführt werden soll, variabel. Dies bestimmt den Kohlenwasserstoffgehalt im Ablauf, welcher wiederum so niedrig sein kann, daß der Kohlenwasserstoffgehalt im Ablauf vernachlässigt werden kann. Wenn der Kohlenwasserstoff geh alt relativ hoch ist, kann der Kohlenwasserstoff, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und entweder zu dem einzuspeisenden Kohlenwasserstoff zurück oder einem zweiten, erfindungsgemäß durchgeführten kontinuierlichen Fermentationsverfahren zugeführt werden.

Das kontinuierliche Verfahren der Erfindung kann so lange wie gewünscht fortgeführt werden. Der einzige, begrenzende Faktor in der Theorie liegt in der Stabilität des Mikroorganismus; in der Praxis kann das Verfahren jedoch zu einem früheren Zeitpunkt beendet werden. Für die Zwecke der Erfindung kann jedes Verfahren, das mindestens 24 Stunden mit kontinuierlicher Kohlenwasserstoffzufuhr betrieben wird und eine gewisse Zeitdauer der kontinuierlichen Entfernung von Zitronensäure enthaltendem Medium umfaßt, als kontinuierliches Verfahren angesehen werden.

Die wäßrige Phase des Ablaufs wird von den Zellen des Mikroorganismus und von gegebenenfalls anwesendem Kohlenwasserstoff mittels üblicher Verfahren, z. B. mittels Zentrifugieren und/oder Filtration, abgetrennt. Die Zitronensäure wird aus der wäßrigen Phase ebenfalls nach herkömmlichen Methoden, z. B. durch Ausfällung als Tricalciumcitrat, isoliert.

Viele Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe unter Bildung von Zitronensäure zu assimilieren vermögen, sind auch zur Bildung von Isozitronensäure hieraus befähigt; dies ist unerwünscht, wenn Zitronensäure das gewünschte Produkt darstellt. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß bei dem kontinuierlichen Verfahren der Erfindung geringere Mengen an Isozitronensäure, bezogen auf Zitronensäure, gebildet werden als bei einem diskontinuierlichen Verfahren unter Verwendung des gleichen Stammes des Mikroorganismus.

Das Verfahren der Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.

Beispiel 1
(A) Anfängliches, diskontinuierliches Verfahren

Es wird ein flüssiges Medium hergestellt, das 5 g/l einer Stickstoffquelle enthält und in 600-ml-Mengen in 2,8-Liter-Kolben verteilt wird, wobei anschließend jeder Kolben mit 45 ml (34,5 g) Ci₄- bis Cie-n-Paraffinen versetzt wird. Bei der Stickstoffquelle handelt es sich um eine handelsübliche Quelle für assimilierbaren Stickstoff, die durch Pankreasenzyme aufgeschlossenes Kasein enthält. Nach der Dampfsterilisierung dieses Mediums (35 Minuten bei 1 atü) wird jeder Kolben mit einem Kartoffeldextrose-Agar (schräg im Reagenzglas angelegt) geimpft, der Zellen von Candida lipolytica ATCC-20228 enthält, und unter Verwendung einer Rotationsschüttelvorrichtung 48 Stunden bei 26 bis 27°C aerob bebrütet. Am Ende dieser Zeit wird ein

5%-lmpfmaterial des Candida-Wachstums in 2 Liter eines wäßrigen, sterilisierten Mediums überführt, das pro Liter 2,6 g Feststoffe von Maisquellwasser, 4,0 g Ammoniumsulfat und 15 g Calciumcarbonat enthält und das mit 200 ml (153 g) der gleichen Ch- bis C,₆-n-Paraffine versetzt worden ist. Das geimpfte Medium wird 53 Stunden gerührt und belüftet, indem man Luft in einer Menge von 1,25 Liter Luft/Minute bei einer Temperatur von 26 bis 28⁰C durchbläst.

Am Ende dieser Zeit werden 270 ml dieses Impfmediums zu etwa 5 Liter sterilisiertem Medium in einem größeren Fermentationsbehälter hinzugesetzt, das folgende Bestandteile pro Liter enthält: 2,0 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 6,0 g Calciumcarbonat, 0,75 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 mg Thiaminhydrochlorid und so viel Eisen(IlI)-nitrat sowie Zink-, Kupfer- und Mangansulfate, daß 0,15 mg Eisen, 0,5 mg Zink, 0,125 mg Kupfer und 0,01mg Mangan enthalten sind. Hierzu werden 980 ml (750 g) der gleichen Ch- bis Cie-n-Paraffine hinzugesetzt Das Fermentationsmedium wird unter Verwendung einer vierschaufligen Turbine mit 1400 U/Min, gerührt und durch Hindurchblasen von Luft in einer Menge von 3,0 Liter Luft/Min, bei 26° C belüftet. In den ersten 24 Stunden wird der pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf einen Wert von 7,25 gehalten. Man läßt anschließend den pH nach Maßgabe der Säurebildung auf einen Wert von 3,5 absinken und hält ihn dann durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf diesem Wert.

(B) Kontinuierliches Verfahren

Nach 71 Stunden wird Medium der folgenden Zusammensetzung kontinuierlich zu dem Fermentationsbehälter in einer Menge von etwa 2 Liter pro Tag (1,4 ml/Min.) hinzugesetzt: 0,4 g/Liter Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,75 g/Liter Kaliumdihydrogenphosphat, 0,25 mg/Liter Thiaminhydrochlorid, 0,6 ml/Liter Chlorwasserstoffsäure sowie Eisen-, Zink-, Kupfer- und Mangansalze in solchen Mengen, daß 0,3 mg/Liter Eisen, 1,0 mg/Liter Zink, 0,25 mg/Liter Kupfer und 0,02 mg/Liter Mangan enthalten sind. Gleichzeitig werden die gleichen Ch- bis Ci6-n-Paraffine in einer Menge von etwa 353 ml (270 g)/Tag (0,25 ml/Min.) zugesetzt. Ein Antischaummittel wird in einer Menge von 2 ml pro Tag zugesetzt. Die Luftmenge wird auf 3,5 Liter/Min, gesteigert, die Temperatur auf 26° C und der pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf einem Wert von 3,5 gehalten. Man läßt das Volumen in dem Fermentationsbehälter auf etwa 7 Liter ansteigen; wenn dieser Wert erreicht ist, läßt man das Medium in einen Aufnahmebehälter überfließen.

Das Material, das sich in dem Aufnahmebehälter sammelt, wird täglich zur Bestimmung von freier Säure durch Titration von Proben mit Basen analysiert. Nach der Zugabe von Formaldehyd erfolgte nochmals eine Analyse, um Säure zu bestimmen, die durch das Ammoniak neutralisiert worden ist. Darüber hinaus werden Proben von dem Aufnahmebehälter zentrifugiert; die klare Flüssigkeit wird in ähnlicher Weise auf ihren Säuregehalt untersucht, ebenso speziell auf Zitronensäure mit der Pentabromacetonmethode und auf die Anteile an Zitronensäure und Isozitronensäure mittels der Gas-Flüssigkeitschromatographie.

Nach einer Gesamtbetriebszeit von 304 Stunden (71 Stunden diskontinuierliches Verfahren plus 233 Stunden kontinuierliches Verfahren) beträgt die gebildete Zitronensäuremenge 4,248 kg (ausgedrückt als Monohydrat) aus einem Gesamtgewicht von 3,337 kg zugesetzten η-Paraffinen, was einer Gesamtausbeute von 127 Gew.-% entspricht. Der Zitronensäuregehalt der klaren Flüssigkeit aus dem Ablauf variiert während des Verfahrens von 134 bis 178 g/Liter (ebenfalls ausgedrückt als Monohydrat) und der Isozitronensäuregehalt variiert von 9,5 bis 20 g/Liter (ausgedrückt als wasserfreie Säure). Der Anteil an Zitronensäure in der klaren Flüssigkeit variiert von etwa 87-92%, bezogen auf den Gesamtgehalt an wasserfreier Zitronensäure und Isozitronensäure.

Das in Beispiel 1 verwendete Kohlcnwasserstoffmaterial besitzt folgende Zusammensetzung:

n-Alkane	0,0
C<14	8,4
C 14	64,9
C15	21,5
C 16	4,1
C17	0,7
C 18	0,2
C>18	99,8

Andere Kohlen	0,2
wasserstoffe

100,0

Beispiele 2 und 3

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, jedoch wird ein Kohlenwasserstoffmaterial verwendet, das hauptsächlich aus (a) Cn-n-n-Paraffinen bzw. (b) Cn,-bis Ci9-n-Paraffinen besteht. Hierbei werden ähnliche Ergebnisse erhalten. Die verwendeten Paraffine besitzen folgende Zusammensetzung:

	(a)	0,1	—	C<14	(b)	0,2
n-Alkane		3,9	—	C 14		0,6
C<13	20,8	99,4	C 15	—	2,8
C 13	32,7	0,6	C 16	12,4
C 14	27,1		C17	30,8
C 15	13,9		C 18	34,1
C 16	0,9		C 19	14,0
C 17	0,0		C 20	1,9
C 18	C>20	0,5
C>18		97,3
		2,7


andere Kohlen
wasserstoffe

100,0

In den vorhergehenden Beispielen werden der pH des Mediums während des kontinuierlichen Verfahrens auf 3,5 und die Temperatur des Mediums bsi 26° C gehalten.

Beispiele 4 bis 7 (Beispiel 7 ist ein Vergleichsbeispiel)

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, jedoch b5 wird der pH des Mediums während des kontinuierlichen Verfahrens auf den in der Tabelle angegebenen Werten gehalten, wobei die ebenfalls in der Tabelle angegebenen Ergebnisse erhalten werden.

Beispiel

2,8 3,0 3,2

4,0

Zitronensäureausbeute")

leicht verringert leicht verringert ähnlich verringert

(Vergleich)
*) Verglichen mit der Ausbeute bei pH

Beispiele 8 bis (Beispiele 8 und 9 sind Vergleichsbeispielc)

Das Verfahren des Beispiels I wird wiederholt, jedoch wird die Temperatur des Mediums während des

kontinuierlichen Verfahrens auf den in der Tabelle angegebenen Werten gehalten, wobei die ebenfalls angegebenen [Ergebnisse erhalten werden.

Beispie!

8 (Vergleich)

9 (Vergleich)
10

Temperatur

Zilronen-

säurc-

bildung*)

22 24 28 30

langsamer langsamer ähnlich ähnlich

*) Bezogen auf die Bildung bei 2b C.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Fermentation eines wäßrigen, als > Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff n-Alkane mit 14 bis 19 C-Atomen dispergiert enthaltenden Mediums mit Candida lipolytica ATCC 20228, unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes des Mediums von 2,8 — 3,5 und einer Temperatur von 26 —30° C, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren kontinuierlich durchführt, indem man die Kohlenwasserstoffquelle und die essentiellen Nährstoffe für den Mikroorganismus kontinuierlich dem Fermentationsmedium zuführt und kontinuierlich Zitronensäure enthaltendes Medium in solcher Menge abzieht, daß das Fermentationsmedium auf im wesentlichen konstantem Volumen gehalten wird, und daß man schließlich die Zitronensäure aus dem abgezogenen Medium isoliert.