DE2360091A1

DE2360091A1 - Verfahren zur herstellung von zitronensaeure durch fermentation

Info

Publication number: DE2360091A1
Application number: DE2360091A
Authority: DE
Inventors: Jean-Max Charpentier; Georges Glikmans; Paul Maldonado
Original assignee: ERAP; IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: ERAP; IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 1972-12-06
Filing date: 1973-12-03
Publication date: 1974-07-04
Also published as: NL7316747A; US3966553A; GB1428439A; IT1012534B; JPS4992280A; JPS5018687A

Description

Institut Francais du Petrole des Carburants & Lubrifiants

1 & 4 Avenue des Bois-Preau 92502-Rueil-Malmaison/:PranKreich.

und

Entreprise de Recherches Ss d'Activites Petrolieres-Blf

7 Rue Uelaton

75015-Paris /!Frankreich.

"Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch,

Fermentation

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch Fermentation..

Es ist bekannt, daß Zitronensäure eine der organischen Säuren ist, die in der Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrie wegen ihrer leichten Verdaulichkeit und schwachen Toxizität am meisten verwendet wird.

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Der größte .Teil der Zitronensäure wird auf der ganzen Welt durch Fermentation hergestellt.

Als Mikroorganismen "benutzt man bei diesen Verfahren am häufigsten die Stämme von Aspergillus Niger, welche als hauptsächliche Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, wie Melasse und Dextrose, verwenden.

Bei diesen Verfahren gibt es jedoch zahlreiche Schwierigkeiten, die insbesondere mit einer Instabilität der Stämme zusammenhängen, wobei die Fermentationsdauer besonders lang ist.

Weitere wesentliche Schwierigkeiten stehen in Zusammenhang mit der Variabilität der Zusammensetzung der verwendeten Kohlenhydrate, was gans allgemein bei Produkten landwirtschaftlichen Ursprungs der EaIl ist.

Es ist schon vor langer Zeit beschrieben worden, daß man Hefepilze sowie deren verschiedene Metaboliten und insbesondere Zitronensäure durch Fermentation auf Kohlenhydraten erhalten kann; diese Verfahren sind a priori wesentlich vorteilhafter als die Verfahren, welche von Substraten landwirtschaftlichen Ursprungs ausgehen (vergleiche beispielsweise F. Just, W. Schnabel und S. Ulman, Die Brauerei, Wissenschaftliche Beilage, 1951, 4 (3), 57-60 und (9) 71-75).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Ge\«/innung von Zitronensäure unter Verwendung eines Hefepilzes, der fähig ist, normale Paraffine zu assimilieren, wobei dieser Hefepilz in einem Milieu gezüchtet wird, das mindestens ein ITorraalparaffin in Paraffin und eine wässrige Nährstoff phase klassischer Zuoammenc.· ü^iin^· enthält.

Λ ι) 9 8 2 7 / 0

Als Beispiele für diese Pilze seien die Endomycetaeeae erwähnt, insbesonder die Saccharomycetoideae, zum Beispiel die Stämme Pichia, Hansenula, Debaryomyces, und die Lipomycetoideae, zum Beispiel der Stamm Lipomyces. Erwähnt seien ferner die Cryptococcaceae, zum Beispiel Torulopsis und Candida, und die Ehodotoruloideae, zum Beispiel Ehodotorula.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Züchtung von Hefepilz-Stämmen in einem Milieu, welches mindestens ein n-Paraffin und eine wässrige Nährstoffphase enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das Milieu mit mindestens einer organischen heterocyclischen Stickstoffverbindung versetzt.

Es wurde nämlich gefunden, daß die Hefepilz-Stämme eine wachsende Kapazität zur Aklcumulierung von Zitronensäure annehmen, wenn man dem Permentations-Milleu organische Verbindungen zusetzt, welche mindestens eine in einem Ring eingeschlossene Aminogruppe enthalten, d. h. organische heterocyclische Stickstoffverbindungen. Besonders wirksam haben sich unter diesen Verbindungen diejenigen erwiesen, welche mindestens eine Carboxylgruppe in c&-Stellung zum heterocyclischen Stickstoff besitzen, zum Beispiel:

Pyridin-2-Carbonsäure (Picolinsäure)
Pyridin-2,6-Dicarbonsäure (2,6-Dipicolinsäure) Chinaldinsäure.

Diese Säuren können in Form ihrer nicht-toxischen Salze verwendet werden, zum Beispiel als Alkalisalze.

Man kann aber auch mit Erfolg andere heterocyclische Stickstoffverbindungen verwenden, zum Beispiel:

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o-phenantrolin
bi-Pyridyl
5-Hydroxy-Chinoxalin
e-Hydroxy-Chinol^in.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man zunächst ein Inoculum einer Hefepilzkultur her, die fähig ist, η-Paraffine zu assimilieren (z.B. Candida), worauf man die Fermentation in Gegenwart von mindestens einem Paraffin mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen vornimmt.

Das Inoculum wird hergestellt, in dem man Hefezellen (vorzugsweise Candida) unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Milieu, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (im allgemeinen eine industrielle n-Paraffin-Kohlenwasserstoff-Fraktion mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen) und eine assimilierbare Stickstoff quelle enthält, in Suspension bringt.

Man kann die heterocyclischen Stickstoffverbindungen dem Inoculum beifügen oder erst später einführen.

Das Milieu wird zum Beispiel 36 Stunden lang bei einer Temperatur von 25 bis 3O°C gerührt.

Wenn man eine ausreichende Dichte der Zellen von Candida oder einer anderen Hefe in der Impfkultur erhalten hat, wird ein Teil derselben dem Fermentationsmilieu beigefügt, welches eine n-paraffinisehe Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle sowie verschiedene Kationen, Anionen und Vitamine enthält, die als Wachstumsförderer bekannt sind. Die erfindungsgemäß benutzte heterocyclische Stickstoffverbindung wird entweder am Anfang der Fermentation beigefügt oder vorzugsi^eise sobald das Wachstum der Hefe ausreichend ist (am Ende der exponentiellen Phase), man kann aber auch jeweils einen Teil zu jedem dieser Zeitpunkte beifügen.

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Als Stickstoff quelle benutzt man im Fermentationsmilieu zum· Beispiel mineralische Ammoniumsalze, vorzugsweise Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und Ammoniumcarbonat.

Die folgenden Kationen und Anionen sind gleichfalls dem Wachstum von Hefepilzen vom Stamme Candida förderlich:

Kalium, Natrium, Zink, Magnesium, Mangan, Eisen, Phosphat, Carbonat.

Es ist ebenfalls bekannt, daß die Zugabe, von Spuren von Oligoelementen und Vitaminen (z.B. Thiamin und Biotin) zu Hefekulturen das Zellwachstum günstig beeinflußt.

Nach der Animpfung findet 'die Fermentation in einem kräftig belüfteten Milieu unter Rühren bei einer Temperatur statt, die üblicherweise zwischen 25 und 35°C liegt, vorzugsweise bei etwa 30°0.

Komprimierte sterile Luft wird im Fermentationsmilieu verteilt und zwar 1 bis 2 Lifter Luft/mn/Liter des Milieus.

In den ersten Stunden der Fermentation, das he ißt während der Wachstumsphase, wird der pH-Wert vorzugsweise so eingestellt, daß die Multiplikationsgeschwindigkeit der Hefezellen optimal ist, das heißt auf einen Wert von vorzugsweise 4,5 bis 5,5.

Diese Regulierung des pH-Werts wird zum Beispiel durch Zugabe einer wässrigen basischen Lösung bewirkt, wie einer Ammoniaklösung, Natronlauge, Kalilauge, Natrium- oder. Kalium-Carbonat.

Vorzugsweise hält man den pH-Wert durch Zugabe von Natrium- oder Kalium-Carbonat im gewünschten Bereich, und zwar nicht nur v/eil die Natrium- und Kalium-Ionen,sondern auch die Carbonationen

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einen aktivierenden Effekt auf das Wachstum haben, letztere gehen anscheinend in den Metabolismus der Hefezellen ein und aktivieren ihr Wachstum.

Sobald die Hefezellen ausreichend gewachsen sind (Ende der exponentiellen Wachstunisphase), fügt man vorzugsweise die organischen heterocyclischen Stickstoffverbindungen in einer Konzentration von 0,05 bis 1Og/Liter zu; besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 0,1 bis 5g/liiter. Dann läßt man die Fermentation weiterlaufen, ohne daß es nötig ist, den pH-Wert durch Zugabe einer basischen Lösung zu regulieren; der pH-Wert wird dabei laufend geringer und liegt am Ende der Fermentation bei etwa 3 bis 3,5.

Sobald sich ausreichende Mengen Zitronensäure angehäuft haben, wird diese Verbindung durch klassische Methoden isoliert, zum Beispiel in Form ihres Calciums'alzes. Nach Eliminierung der Zellen kann man zum Beispiel das Milieu durch Zugabe einer stoechiometrischen Menge Kalk basisch machen, worauf man das Calciumcitrat durch Erhitzen der überstehenden Flüssigkeit ausfällt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, welches wie folgt verläuft:

In mindestens einer belüfteten Fermentationszone befindet sich eine kontinuierliche Spur eines Hefepilzes, der zur Assimilation von η-Paraffinen befähigt ist, in einem Milieu, das permanent alle zum Wachstum dieses Hefepilzes erforderlichen Elemente, sowie mindestens ein n-^raffln enthält. Die Hefepilze wex'den in einem solchen Rythmus abgezogen, daß pie in ihrer Sntv/icklungsphase in der ersten Fermentationszone verbleiben. Die abgezogenen Hefepilze werden in mindestens

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eine zweite "belüftete Eermentationszone eingefüllt, welche Wachstumselemente enthält, aber arm an assimilier"baren mineralischen Stickstoffquellen (insbesondere Ammoniumsalzen) ist. Man läßt die Hefepilze solange in der zweiten Zone, "bis sich eine signifikante Menge Zitronensäure abgeschieden hat, worauf man in bekannter Weise Zitronensäure und Hefepilze vom Kulturmedium der zweiten Zone abtrennt. Bei diesem Verfahren

—1 arbeitet man mit einem Yerdünnungsgrad von 0,05 bis 0,3 h

-1

in der ersten Zone, und vorzugsweise 0,01 bis 0,04 h in der zweiten Zone.

Bei dem oben genannten Verfahren handelt es sich um die kontinuierliche Gewinnung von Metaboliten, im vorliegenden Fall Zitronensäure, durch Fermentation mit Hilfe von Hefepilzen unter Verwendung von η-Paraffinen. Die völlig kontinuierliche Fermentation von Hefepilzen ist bislang zur Gewinnung /Proteinen entwickelt worden, da sie zahlreiche Vorteile hinsichtlich der Ge\tfinnung von getrennten Chargen besitzt. Bei der Gewinnung von Metaboliten sind die Schwierigkeiten jedoch viel größer, da die Abscheidung häufig bei Bedingungen erfolgt, bei denen das Wachstum begrenzt ist, da zvd.sehen Wachstum und Ausscheidung ein Gegensatz besteht.· Schließlich sei erwähnt, daß man bei kontinuierlichen Fermentationen häufig inhibierende Wirkungen durch die abgeschiedenen Produkte, insbesondere durch das Hauptprodukt, beobachtet. Das eingangs beschriebene Verfahren kann kontinuierlich durchgeführt 'werden, jedoch besitzt es noch die folgenden Nachteile: Man hat beobachtet, daß die Abscheidung der Zitronensäure dann erfolgt, wenn das Wachstum der Mikroorganismen schwach oder lull ist; daraus folgt die einzige Alternative, nämlich die Abscheidung bei schwachem Wachstum, da man die Entwicklung der Mikroorganismen aufrecht erhalten muß. Bei diesen Ver-

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2O C Π 0 Q1 -J Q U U Ό J .ο —

Suchsbedingungen ist die Produktion an Zitronensäure pro Gewichts einheit Hefe weniger groß als "beim Arbeiten mit getrennten Chargen, was su niedrigen Ausbeuten führt.

!rennt man die Waah.stumspfa.ase von der Kultur-Abscheidungsphase in mehrere Stufen, so erhält man erhöhte Mengen Zitronensäure und größere Ausbeuten. Es ist überraschend, daß bei diesem Typ der Kultur die Stabilität des Systems groß ist. Das erfindungsgemäße kontinuierliche Verfahren zur Herstellung γοη Zitronensäure umfasst also zwei Fermentationsstufen, wobei * die erste das Wachstum der Hefe und die zweite die Abscheidung von Zitronensäure betrifft. Bei diesem Verfahren kann man gewünschtenfalls die gebildete Säure und die Hefepilze kontinuierlich entnehmen; letztere kann man für Nahrungsmittel— zwecke verwenden.

Unter einem an mineralischem Stickstoff armen Milieu (in der zweiten Fermentationszone) versteht man ein Milieu, dessen mineralischer Stickstoffgehalt nicht ausreicht, um die Hefepilze sich wesentlich vermehren zu lassen; vorzugsweise ist er quasi-Null.

In der Praxis beschickt man die erste Fermentationszone mit einer gerade ausreichenden Menge an mineralischen Stickstoffverbindungen, um das Wachstum der Hefepilze zu gewährleisten, wobei der Entwicklungsgrad der für diese erste Zone gewählten Hefepilze berücksichtigt wird; das von der ersten in die zweite Fermentationszone. geleitete mineralische Milieu darf nur eine für die Entwicklung der Hefe in dieser zweiten Zone unzureichende Menge an mineralischer Stickstoffquelle enthalten. Vorteilhaft konzentriert man die Hefe Tor der Einführung in die zweite Zone, sodaß der Übergang von mineralischen Stickstoff-

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■verbindungen von der ersten in:die zweite Zone maximal vermieden wird.

Wie oben erwähnt, erreicht man diese Ergebnisse mit einem Terdünnunggrad D von o,'o5 bis 0,3 h in der ersten Stufe

-1
und vorzugsweise 0_s01 bis 0,04- Ii in der zweiten Stufe.

Es sei daran erinnert ₉ daß der Verdünnungsgrad für eine gegebene Fermentationszone das folgende Verhältnis ist?

Einführungs- (oder Abzugs-) -Menge des fermentationsmediums (Volumen pro Stunde)

Reaktorvolumen Es handelt sich also tim den reziproken Wert der Verweildauer«,

Das zweite Verfahren zur Gewinnung von Zitronensäure wird also in folgender Weise durchgeführt?

In der ersten Stufe (der sogenannte 'Start¹⁸) gibt man einen Hefestamm, der η-Paraffine verzehrt, in einen stark belüfteten ersten Eermentator_? der ein übliches Kulturmilieu unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffs als Kohlenstoffquelle enthält« Die üblichen Kulturmilieus sind bekannt\ es.sind die gleichen,, wie die bei der oben beschriebenen Methode verwendeten«, Sie enthalten üblicherweise mindestens einen nparaffinischen Kohlenwasserstoff, die zum Wachstum nötigen Mineralsalze, insbesondere eine Quelle für Stickstoff und mineralischen Phosphor ₉ zum Beispiel Ammoniumsalze- und Phosphate_s ferner Wachstumselemente (Vitamine, Oligoelemente).

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Sobald man die gewünselite Zellkonzentration erreicht hat₉ wird.die Kultur kontinuierlich, weitergeleitet, indem man frisches Milieu und Kohlenwasserstoff einführt und das ÜPermentationsmilieu in einem dem gewählten Verdünnungsgrad entsprechenden Eythmus abzieht. Der ph-Wert wird auf 2,5 "bis 6 eingestellt, vorzugsweise 4,5 WLs 5,5, indem man eine Base zufügt, zum Eeispiel Ammoniak, Alkalicarbonat, Kalilauge oder Katronlauge. EUn "bestehen zwei Möglichkeiten:

1. Man gibt das aus der ersten Stufe abgezogene Milieu direkt in die zweite Stufe, v/eiche ein an Stickstoff quelle armes Kulturmilieu enthält.

2» Man gibt die Hefe in die zweite Sfefe^ nachdem man das v/ässrige Milieu abgetrennt hat_f zxce Beispiel durch DeKan— tieren um die Biomasse zu konzentrieren. Diese zweite Stufe enthält die selben Elemente wie bei der ersten Lösung.

Welche Lösung man auch wählt_s so ist es zweckmäßig, den zweiten Reaktor mit dem kompletten Eulturmilieu zu beschicken, mit Ausnahme der mineralischen Stickstoff quelle, d. h. alle Mineralsalze (außer den Stickstoffsalzen), Vitamine, Oligoelemente und mindestens ein Paraffin, sodaß die Umwandlung der Kohlenwasserstoffe in Zitronensäure axt erhöhter Ausbeute gewährleistet ist«.

Das in der zweiten Stufe abgesogene Milieu wird dann in bekannter Weise behandelt, um die Zitronensäure zu isolieren.

Las Verfahren dieser zweiten Methode -hat hinsichtlich seines Funktionierens gewisse Besonderheiten, die erwähnt werden sollen:

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1. Das Yolumenverhältnis der-Reaktoren in der zweiten Stufe (Vp) und der ersten Stufe (V,.) beträgt üblicherweise 5 "bis 20; optimal ist ein Wert von etwa 10_o

2* Das Verdünnungsverhältnis (D) in der ersten Stufe "beträgt 0,05 Ms O_S3O h , vorzugsweise 0,15 Ms 0,20 h , denn unter diesen Bedingungen ist die Zitronensäure-Synthese am stärksten.

3. Der Verdünnungsgrad in der zweiten Stufe ist beispiels-

—1 -1

weise 0,01 Ms 0,04 h , vorzugsweise etwa 0₉02 h ; das "bedeutet eine Verweildauer in dem Reaktor von etwa 50 Stunden. Im Ende dieser Zeit ist die Aktivität der Hefe noch konstant.

4. Die Zellkonzentration ( Trockengew.j) in den-zwei Stufen kann zum Beispiel zwischen 5 und 40 g/Liter schwanken. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 20 g/Liter| unterhalb dieses ¥ertes ist die Produktivität niedrig«, oberhalb desselben beginnt die Ausbeute sich zu vermindern,,

5. Die Temperatur beträgt vorzugsweise 25 - 38° G,

6. Die Einführungsgeschwindigkeit des η-Paraffins in die zweite !Fermentationszone beträgt vorzugsweise 0,2 bis 2 g/ Liter/Stunde.

Eine weitere Variante dieses Kultursystems wurde für die Gewinnung von Metaboliten in halbkontinuierlicher Kultur entwickelt, insbesondere im Pail von Stämmen,, welche gegenüber den Ausscheidungsprodukten empfindliche Enzyme haben.

Es ist nämlich möglich, einen Metaboliten (im vorliegenden !Falle Zitronensäure) zu gewinnen, indem man in einer kontinuierlich durchgeführten ersten Stufe Hefepilze züchtet, die

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in verschiedene Abscheidungsreaktoren eingeführt werden, welche chargenweise betrieben werden.

Bei diesem zweiten Verfahren erhält man überraschende Vorteile gegenüber dem Verfahren mit getrennten Chargen oder gegenüber der einstufig durchgeführten kontinuierlichen Kultur.

Das aweite Verfahren hat auch zahlreiche Vorteile gegenüber den bislang bekannten Methoden. Es liefert nicht nur extrem hohe Ausbeuten, sondern auch eine wirtschaftlichere Produktion, da der Produktionszuwachs pro Stunde etwa 30 fo gegenüber den diskontinuierlichen Verfahren beträgt.

Weiterhin erhält man durch diese zweite Methode ein Produkt, dessen Zusammensetzung von einem Tag zum andern völlig reproduzierbar ist, was für die Behandlung und Verwendung von großem Vorteil ist.

Schließlich erlaubt das kontinuierliche System eine völlige Beherrschung des Verfahrens sowohl in technologischer als physiologischer Hinsicht.

Es sei noch erwähnt, daß sich dieses System auf alle Metaboliten-Synthesen anwenden läßt, insbesondere auf Metaboliten, die in der stationären Phase gebildet werden* zum Beispiel

oo-Ketoglutarsäure, Fumarsäure, Äpfelsä.ure und gewisse Aminosäuren.

Eine Verbesserung der zweiten Methode besteht darin, daß man die zweite iermentationszone eine der oben genannten organischen heterocyclischen Verbindung zufügt, um die erste Methode der Zitronensäure-Gewinnung durchzuführen, wobei die

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organische heterocyclische Verbindung in der gleichen Konzentration wie oben angegeben verwendet wird.

In den folgenden Beispielen sind die beiden erfindungsgemäßen "Verfahren näher erläutert, ohne daß die Erfindung hierauf beschränkt werden soll.

Selbstverständlich kann man bei den erfindungsgemäßen Verfahren Hefe-Mutanten, zum Beispiel Candida-Mutanten oder Varianten, die man durch physikalische Methoden erhalten hat, zum Beispiel durch Röntgen- oder UV-Strahlen, oder durch chemische Methoden, zum Beispiel durch Verwendung von Nitrosomethylurethan oder Mitrosoguanidin, deren mutagene Wirkung bekannt ist.

Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)

Man beimpft mittels eines Röhrchens, welches Zellen von Candida Lipolytica LlP 29 auf einem Nährboden enthält, einen 100 ml Erlenmeyerkolben, der 20 ml eines flüssigen PrOkultur-Milieus der folgendejn^2^^amnren~se"tzung ^enthält:

^ ₄ .... .^. „. *v. 3,4 g/Liter

HaHPO₄; 12 H₂O 2,5 g/Liter

; 7 H₂O 0,7 g/Liter

_?S0_A 4 ' g/Liter

CaCIp , 0,1 g/Liter

PeSO₄; 7 H₂O ....... 2 mg/Liter

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CuSO₄; 5H₂O 5 ug/Liter

H₃BO₃ 10 ug/Liter

D-InSO₄; H₂O 10 ug/Liter

ZnSO₄; 7 H₂O 10 ug/Liter

(Mi₄)₆M_?0₂₄; 4 H₂O 100 - ug/Liter

Co (NO₃)₂; 6 H₂O 10 jig/Liter

Hefeextrakt 100 mg/Liter

Leitungswasser ab 1 Liter

n-Paraffin-Fraktion C^₂- C, _g . „ 15 g/Liter

Die n-Paraffin-IPraktion hat die folgende Zusammensetzung:

Kohlenwasserstoff	io relatives Gev/icht
C₁₂ ^C13 ^G14 ⁰16 C₁₇ c¹⁸	0,07 2,05 15,71 32,00 30,83 17,90 1,38 0,06

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Die Candidazellen werden bei 3O°C ineubiert, nach dem man den das Inoculum enthaltenden Erlenmeyerkolben auf einer Schüttelvorrichtung befestigt hat, die sich mit einer Geschwindigkeit von 14-0 t/mn bewegt. Nach 36 Stunden Incubation werden 10 ml dieses Inoculums benutzt, um einen 1,5 Liter-Fernbach-Kolben zn beimpfen, der 200 ml steriles Nährmedium .A der folgenden Zusammensetzung enthält:

₂₄ 2 g/Liter

MgSO₄, 7 H₂O ' 1 g/Liter

EH₄NO₃- 2,5 g/Liter

CaCO₃ 20 g/Liter

FeSO₄, 7 H₂O 0,2 g/Liter

MnSO₄, 7H₂O. 0,026 g/Liter

Hefeextrakt .·.,.. 100 mg/Liter

Leitungswasser ab 1 Liter

n-P ar af f in-3Fr akt i ο η

C₁₂-C₁₉ 25 g/Liter

Der Fernbach-Kolben wird auf einer Schüttelvorrichtung befestigt und das Milieu sechs lage"lang bei 30 C geschüttelt.

Die Konzentration an Zitronensäure beträgt 10,1 g/Liter. Beispiel 2

Wiederholt man die-in Beispiel 1 beschriebene Fermentation unter Zugabe von 1,2 g/LiterotPicolinsäure zum Milieu A, so beträgt die Konzentration an Zitronensäure 26 g/Liter,

Beispiel 3

Die im Beispiel 2 beschriebene Fermentation ist mit vergleichbaren

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Resultaten reproduzierbar, wenn man anstelle des Stammes Candida Lipolytica IFP 29 einen der folgenden Hefestämme der Art Candida verwendet:

Candida-Stamm	Ur.
Lipolytica	IFP 102
Lipolytica-	IFP 88
Lipolytica	ELF 8
Lipolytica	ELF 19
Lipolytica	ELP 25
Tropicalis	IFP 114
Lipolytica Diploid	D 1805
Lipolytica Diploid	D 1806
Lipolytica Diploid j	D 1807

Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel)

Man sterilisiert einen Fermentator mit einer Kapazität von 2,5 Liter, der 1,2 Liter eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthält;

4 g/Liter

MgSO₄^ 7 H₂O 2 g/Liter

NH₄UO₅ 5 g/Liter

FeSO₄, 7 H₂O 0,4 g/Liter

MnSO₄, 7 H₂O 0,052 g/Liter

Hefeextrakt 200 mg/Liter

ihiamin-Hydr 0 chlor id 50 x(g/Liter

Leitungswasser , ab 1 Liter

η-Par af £ in-ITr akt ion

O₁O-G₁Q 100 g/Liter

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Der Fermentator wird ait 200 ml eines Prekultur-Milieus der im Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung beimpft, wobei man den Stamm Candida Lipolytica IFP 29 verwendet.

Der pH-Wert wird in der ersten Phase auf 5 eingestellt, in dem man eine 0,5 molare Kaliumcarbonatlösung zusetzt. Das Milieu wird dann etwa 30 Stunden lang bei 3O⁰G mit 2300 t/mn geschüttelt. Anschließend läßt man das Milieu sich selbst ansäuern, wobei der pH-Wert sich auf einen Wert zwischen 3 und 3,5 einstellt. Fach 150 Stunden Kultur beträgt die Konzentration an Zitronensäure 65 g/Liter.

Beispiel 5

Die im Beispiel 4 beschriebene Fermentation wird wiederholt, wobei man 1,2 g/Liter ix-picolinsäure nach 30 Stunden Kultur in das Milieu gibt. Die Konzentration an Zitronensäure beträgt nach 150 Stunden 135 g/Liter.

Beispiel 6 bis 11

Die im Beispiel 5 beschriebene Fermentation wird wiederholt, in dem man anstelle von ^-Picolinsäure 1,2 g/Liter der folgenden Stickstoff-Heterocyclen verwendet:

Pyridin-2,6-Dicarbonsäure

Chinaldinsäure

Bi-Pyridyl

o-Phenantrolin -

8-Hydroxy-Chinolin

5-Hydroxy-Ohinoxalin.

Mit Pyridin-2,6-Dicarbonsäure und Chinaldinsäure erhält man eine Zitronensäure-Konzentration von etwa I30 g/Liter nach

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150 Stunden. Bei Verwendung von Bi-Pyridyl, o-Phenantrolin, 8-Hydroxy-Chinolin und 5-Hydroxy-Chinoxalin erhält man nach 30 Stunden eine Zitronensäure-Konzentration von etwa 115 g/Liter.

Beispiel 12

Die im Beispiel 4 beschriebene Fermentation wird unter Zugabe von 0,06 g/Liter Chinaldinsäure zum Milieu nach 30 Stunden Kultur wiederholt.

Nach 150 Stunden Kultur bei 3O⁰C und einem pH-Wert von 4,5 beträgt die Zitronensäure-Konzentration 85 g/Liter.

Beispiel 13

Die im Beispiel 4 beschriebene Fermentation wird unter Zusatz von 0,15 g/Liter Ghinaldinsäure zum Milieu nach 30 Stunden Kultur wiederholt.

Nach 150 .Stunden Kultur beträgt die Zitronensäure-Konzentration 117 g/Liter.

Beispiel 14

Dieses Beispiel zeigt den Fall einer kontinuierlichen Kultur in einer einsigen Stufe.

Man macht zuerst eine PrSlcultur des Stammes Candida Lipolytica IFP 29 in einem Fernbach-Kolben.

Die Zusammensetzung des Milieus ist wie folgt (pro Liter):

KH₂PO₄ : 2 g, MgSO₄, 7 H₂O : 1 g, M₄IIO₅ : 2,5 g ; CaCO₃ : 20 g, FeSO₄, 7 H₂O : 0,2 g, 1'InSO₄, 7 H₃O : 0,026 g, Hefeextrakt 100 mg,

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Leitungswasser ab 1 000 ml, η-Paraffin-Fraktion C₁₂-C₁Q : 25 g«

Der Fernbach-Kolben wird auf einer Rührvorrichtung befestigt und das Milieu drei Tage lang bei 30°G geschüttelt; man yerwendet 200 ml der Prakultur als Inoculum für den Fermentator.

Der Fermentator ist ein Reaktor mit einer Kapazität von 2,5 Liter, der 1,3 Liter eines sterilen wässrigen Milieus A, der folgenden Zusammensetzung enthält (pro Liter)ι

PO₄ : 4 g, MgSO₄, 7 H₂O : 2 g, NH₄NO₃ : 5 g, FeSO₄, 7 H₂O 0,4 g, MnSO₄, 7 H₂O : 0,052 g, Hefeextrakt : 200 mg,- Thiamin-Hydrochlorid : 50 ^ig, Leitungswasser ab 1000 ml..

Dieses Milieu versetzt man mit der ο,.ρ-ο-ια-ϊ'Γ^'βίοη, sodaß deren Konzentration 20 g/Liter "beträgt, und man startet die Kultur bei 30⁰C und pH 5 unter Belüftung. Nach 30 Stunden Kultur beträgt das Trockengewicht etwa 15 g/Liter. Dies ist der Moment, in dem man die kontinuierliche Kultur beginnt, indem man einerseits das Milieu A einspritzt, welches außerdem 1,2 g/Liter 00-Picolinsäure enthält, und andererseits 1,65 g/Liter/Stunde der C₁₂-C_1Q-Kohlenwasserstoffe. Man zieht ein gleiches Volumen aus dem

-1

Kulturmilieu ab. Der Yerdünnungsgrad beträgt 0,05 h ; die stündliche Leistung beträgt 1,02 g/Liter Zitronensäure und 0,98 g/Liter Hefe. Hieraus ergibt sich eine Ausbeute von 62 Gew.-fo Zitronensäure, bezogen auf verbrauchten . Kohlenwasserstoff. ·

Hat man keine «^-Picolinsäure zugesetzt, so beträgt die. Ausbeute an Zitronensäure nur 32 Gew.-^.

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Beispiel 15

Man wiederholt die in Beispiel 14 beschriebene kontinuierliche Fermentation, indem man mit einem Yerdünnungsgrad von 0,02 h und einem stündlichen Barchsatz von 1,04 g/Liter Kohlenwasserstoff arbeitet.

Auf diese Weise erhält man 1,03 g/Liter/Stunde Zitronensäure und 0,40 g/Mt er/Stunde Hefe. Die Ausbeute an Zitronensäure ist 99 G-ew.~$ bezogen auf verbrauchten Kohlenwasserstoff.

Beispiel 16

Dieses Beispiel zeigt insbesondere die zweite Methode zur Gewinnung von Zitronensäure, Die Prakultur wird wie im Beispiel 14 beschrieben hergestellt. Man beimpft mit dieser Prekultur einen Reaktor ("1. Stufe") mit 2,5 Liter Kapazität, wobei man wie in Beispiel 14 beschrieben, arbeitet. Fach 30 Stunden Kultur

σ
bei pH 5 und 30 0 wird das Milieu kontinuierlich weitergeleitet, sobald das Trockengewicht sich bei 15 g/Mt er befindet. Der ?er-

—1

dünnungsgrad beträgt 0,1 h , Der stündliche Durchsatz an Kohlenwasserstoff 2 g/liiter. Man zieht das Kulturmilieu in der gleichen Menge ab, wie die Zufuhr erfolgt* Unter diesen Bedingungen bleibt die Hefekonzentration praktisch konstant. Man gibt keine <** -Picolinsäure in das Milieu in diesem Fermentator. Die Hefe wird der Reihe nach in die zweite Stufe ("Abscheidungsstufe") überführt, deren Volumen 25 Liter beträgt.

Dieser Reaktor enthält ein Milieu, dessen Zusammensetzung die gleiche ist wie die des Milieu A, aber ohne Stickst off quelle.

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Beim Start der Hefe-Injektion in die zweite Stufe gibt man η-Paraffine in einer Menge von 0,57 g/Liter/Stunde sowie soviel oc-Picolinsäure zu, daß die stationäre Konzentration dieser Säure ,1,2 g/Liter "beträgt. Der pH-Wert stellt sich automatisch auf 3,2 ein. Die Temperatur beträgt 30⁰C. Man zieht das Milieu in der gleichen Menge ab, wie die Zufuhr erfolgt. Der Fermentator stabilisiert sich bei einer Zellkonzentration von 19,5 g/Liter bei einem Verdünnungsgrad von 0,01 Ta. ,

Die kontinuierlich abgezogene Flüssigkeit enthält 99,2 g/Liter Zitronensäure. Die stündliche Ausbeute an Zitronensäure beträgt also 0,99 g/Liter, diejenige an Zellen 0,395 g/Liter. Die Ausbeute der Zitronensäure in der zweiten Stufe beträgt demnach 174 Gew.$, die Gesamtausbeute 128 Gew.-^, bezogen auf · verbrauchten Kohlenwasserstoff.

Hat man in der zweiten Stufe keine <*■»-Picolinsäure zugefügt, so beträgt die Ausbeute an Zitronensäure in der zweiten Stufe 78 Gew.-5^, bezogen auf verbrauchten Kohlenwasserstoff.

Beispiel 17

Die Bedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 16, jedoch vermindert man in der zweiten Stufe die Verweildauer durch kontinuierliche Zugabe von Milieu A ohne Stickstoffquelle, sodaß der Verdünnungsgrad 0,02 h beträgt. Unter diesen Bedingungen ist die Zellkonzentration am Fermentatorausgang 10,3 g/Liter. Die ausfließende Flüssigkeit enthält 49,2 g/Liter Zitronensäure, was einer stündlichen Ausbeute von 0,98 g/Liter entspricht. Die stündliche Ausbeute an Hefe beträgt 0,206 g/ Liter. Die Gesamtausbeute an Zitronensäure liegt bei 124 Gev/,-%, bezogen auf verbrauchten Kohlenwasserstoff.

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Beispiel 18·

Die Bedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 16, jedoch ist der Verdünnungsgrad in.der ersten Stufe 0,2 h~ . Wenn die Kultur sich im Gleichgewicht befindet, hat sie eine Zellkonzentration von 10,4 g/Liter und man gibt sie in die Abscheidungsstufe. Bei diesen Kulturbedingungen ist der Verdünnungsgrad im Abscheidungsreaktor 0,02 h wie beim Beispiel 17, aber die Aktivität der Hefe ist viel höher. In diesem Fall gibt man 0,80 g/Liter/Stunde der C^-C-ig-ITaktion zu, und man findet in der ausfließenden Flüssigkeit 71 g/Liter Zitronensäure. Die stündliehe Ausbeute dieser Säure beträgt also 1,42 g/Liter, die der Hefe 0,2 g/Liter. Die Gesamtausbeute an Zitronensäure liegt bei 142 %.

Beispiel 19

Die Bedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 16, jedoch, ist der Verdünnungsgrad in der ersten Stufe 0,08 h~ . Bei diesen Bedingungen beträgt das !Trockengewicht im Gleichgewicht 30,4 g/Liter. Der Ausfluss der ersten Stufe wird in die zweite Stufe eingeführt, wo man, wie vorher beschrieben, oo-Picolinsäure in einer solchen Menge zusetzt, daß die stationäre Konzentration dieser Säure 1,2 g/Liter beträgt, ferner η-Paraffine in einer Menge von 0,84 g/Liter. Gleichzeitig gibt man in die Abscheidungsstufe Milieu A, sodaß der Verdünnungsgrad (Bp) 0,01 h" beträgt. Die Zellkonzentration im Gleichgewicht dieser zweiten Stufe beträgt 24,5 g/Liter.

Bei diesen Bedingungen beträgt die Konzentration an Zitronensäure im Gleichgewicht 122 g/Liter. Die stündliche Ausbeute an dieser Säure liegt bei 1,22 g/Liter, die Gesamtausbeute beträgt

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Beispiel 20

Man wiederholt das Beispiel 16, wobei in der ersten Stufe ein Verdünnungsgrad von 0,2 h aufrecht erhalten wird. Mach Stabilisierung der Kultur wird das abgezogene Milieu zweimal hinsichtlieh der Zellen konzentriert, und zwar durch ein für diesen Zweck "vorgesehenes DeKantierungssystem; anschließend gibt man es in einen Abseheidungsreaktor, dessen Volumen 12,5 Liter beträgt. Gleichzeitig gibt man 0,90 g/Mter/Stunde Kohlenwasserstoff und soviel oo -Picolinsäure zu, daß deren stationäre Konzentration 1,2 g/Liter beträgt» Unter diesen Bedingungen ist der Verdünnungsgrad (Dp) ia der zweiten Stufe 0,02 h~" , die Zellkonzentration 19,8 g/Liter.

Im Abscheidungsreaktor ist die Konzentration an Zitronensäure 82 g/Liter, was einer stündlichen Ausbeute von 1,64 g/Mter entspricht. Die Gesamtäusbeute an Zitronensäure beträgt 127 ^.

Beispiel 21

Man wiederholt das Beispiel 16, wobei der Verdünnungsgrad (D₁)

—1
in der ersten Stufe 0,13 h ist. Der stündliche Durchsatz an Kohlenwasserstoffen in dieser Stufe liegt bei 2,1 g/Liter, Im Gleichgewicht beträgt das Srockengewicht der Zellen 16,3 g/Mter* Dieses Milieu wird kontinuierlich in den Abscheidungsreaktor eingespritzt, dessen Volumen 25 Mter beträgt*.Nach Einstellung des Gleichgewichts in der zweiten Stufe (Dg - Ö_fö13f Zugab© von 1 g/Liter/Stunde Kohlenwasserstoff voaxL soviel ö£* -3?ieoli:Et** säure, daß die stationäre Konzentration 1;2 g/Mter beträgt) misst man ein Zeil-Trockengewicht von 16,1 g/Mter tffid ©ine

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Säurekonzentration von 87 g/Liter. Die stündliche Ausbeute "beträgt also 1,13 g/Liter, die Ge samt ausbeute an Zitronensäure 123 1o.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Züchtung von Hefepilz-Stämmen in einem Milieu, welches mindestens ein η-Paraffin und eine wässrige Nährstoffphase enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das Milieu mit mindestens einer organischen heterocyclischen Stickstoffverbindung versetzt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische heterocyclische Verbindung oo -Picolinsäure, 2,6-Di-Picolinsäure oder Chinaldinsäure verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterocyclische Stickstoffverbindung Bi-Pyridin, o-Phenantrolin, 8-Hydroxy-Chinolin oder. 5-Hydroxy-öhinoxalin verwendet.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die heterocyclische Stickstoffverbindung nach der exponentiellen Wachstumsphase in einer Konzentration von 0,5 bis 10 g/Liter zugibt.
5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die heterocyclische Stickstoffverbindung nach der exponentiellen Wachsturnsphase in einer Konzentration von 1 bis 5 g/Liter zugibt.
6. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert während der Wachstumsphase durch Zugabe

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von Natrium- oder Kalium-Carbonat eingestellt wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einer ersten belüfteten Fermentationszone eine kontinuierliche Kultur von Hefepilzen, die zur Assimilation von η-Paraffinen befähigt sind, in einem Milieu durchführt, welches dauernd alle zum Wachstum dieser Hefe nötigen Elemente, sowie mindestens ein η-Paraffin enthält, die Hefepilze in einem solchen Rythmus abzieht, daß ..sie in ihrer Entwicklungsphase in der ersten Permentationszone verbleiben, die abgezogenen Hefepilze in mindestens eine zweite belüftete Fermentationszone einführt, welche die Wachstumselemente enthält, aber arm an assimilierbaren mineralischen Stickstoffquellen ist, die Hefepilze eine ausreichende Zeit in der zweiten Zone behält, sodaß eine signifikante Menge Zitronensäure abgeschieden werden kann, und in bekannter Weise die Zitronensäure und die Hefe vom Kulturmilieu der zweiten Zone abtrennt, wobei der Verdünnungsgrad in der ersten Fermentationszone bei 0,05 bis 0,3 h liegt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Verdünnungsgrad von 0,01 bis 0,04 'h~ in der zweiten Permentationszone arbeitet.
9. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der zweiten Zone das 5 bis 20-fache des Volumens der ersten Zone beträgt.
10. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkonseiitration 5 bis 4-0 g/Liter beträgt.

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11. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 "bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-¥ert in der ersten Fermentationszone auf 2,5 Isis 6 gehalten wird.
12. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-*¥ert in· der zweiten Fermentationszone nicht kontrolliert wird, sodaß er sich frei einstellen kann.
13. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Einführung des η-Paraffins in die zweite Fermentationszone in einer Menge von 0,2 "bis 2 g/Liter/Stunde erfolgt.
14·. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in der aus der ersten Fermentationszone entnommenen Flüssigkeit die Hefezellen einer Konzentrierung unterworfen v/erden, bevor man sie in die zweite Fermentations zone ein-. führt.
15. Verfahren gemäß-Ansprüchen 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in die zweite Fermentations zone mindestens eine organische heterocyclische; Stickstoffverbindung in einer Konzentratiorjvon 0,5 bis 10 g/Liter .einführt.
16. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Hefestamm der G-attung Candida verwendet.

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