DE2319322B2 - Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B

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Description

Es ist bekannt, daß Streptomyces mediterranei in normalen Wachstumsmedien eine Gruppe von Antibiotika erzeugt, die gemeinsam als Rifamycinkomplex bezeichnet werden (P. S e η s i und Mitarbeiter, Antibiotics Annual 1959—1960, S. 262). Nachfolgende Untersuchungen ergaben, daß die Zugabe von Natriumdiäthylbaibiturat zum Kulturmedium zur Bildung eines einzigen Fermentationsproduktes, Rifamycin B, führt (Margalith P. und Paeani H.. Applied Microbiology, Bd. 9, S. 325, 1961)." Die Zugabe von Barbituraten bei technischen Fermentationsprozessen ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden, z. B. höhere Kosten der Kulturmedien und einer verlangsamten Wachstumsgeschwindigkeit der Stamme, die sich in einigen Fällen nachteilig auf die Antibiotikumausbeute auswirkt
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B durch Züchten von Streptomyces-Stämmen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Stamm Streptomyces mediterranei M 18. ATCC 21 789 verwendet.
Die erfindungsgemäße Mutante von Streptomyces mediterranei M 18, ATCC 21 789 erzeugt unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Natriumdiäthylbarbiturat im Fermentationsmedium nur Rifamycin B.
Isolierung der Mutante
Eine Suspension von Sporen von Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 wurde 60 Minuten bei 28° C in einer Menge von 1 mg/ml mit N-Methyl-N'-nitroso-N-nitroguanidin in tris-Hydroxymethylaminomethan-Puffer vom pH-Wert 9,0 behandelt. Die so behandelten Sporen wurden dann gewaschen und auf Petrischalen gegeben, die Bennett-Agar enthielten. Nach 14tiigiger Inkubation bei 28 C wurden die überlebenden Kolonien aufgenommen und auf ihre Fähigkeit zur Rifamycin B Bildung in flüssigem Medium mit und ohne Natriumdiäthylbarbiturat untersucht. Diejenigen Mutanten, die in Abwesenheit von Natriumdiäthylbarbiturat große Mengen an Rifamycin B erzeugten, wurden weiter untersucht. Eine dieser Mutanten wurde mit M 18 bezeichnet und als ATCC 21789 hinterlegt. Ihre Eigenschaften sind nachfolgend im Detail beschrieben. Analoge Ergebnisse wurden erhalten, wenn man Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 einer UV-Bestrahlung aussetzte oder mit anderen chemischen Mitteln behandelte, die üblicherweise zur Herbeiführung einer Mutation angewandt werden.
Beschreibung von Streptomyces mediterranei M 18, ATCC 21 789
Zur Feststellung der Wachstumseigenschaften wurden Streptomyces mediterranei und seine Mutante M 18 in einer Vielzahl von Standardmedien nach G ο 111 i e b und S h i r 1 i η g (Methods of characterization of Strep-omyces species, Intern. J. Syst. Bact. Bd. 16, S. 3!3 bis 340, 1966) und außerdem in einiger, von W a k s m a n empfohlenen Medien gezüchtet (The actinomycetes, Bd. II, The William and WiI-kings Co., 1961).
In den nachfolgenden Tabellen sind die Wachstumscharakteristika und Eigenschaften der Mutante M 18, ATCC 21 789 und von Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 aufgeführt.
30
Tabelle 1
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen durch Streptomyces mediterranei und seine Mutante M 18
35 Kohlcnstofiqucllcn
Incsil
Fruktose
Rhamnose
Xylose
Raffinose
Arabinose
Zellulose
Saccharose
(positive Kontrolle)
Kein Kohlenstoff
(negative Kontrolle)
Streptomyces
mediterranei
ATCC 13685
Mutanlc
M 18
ATCC 21789
Tabelle
Vergleich der morphologischen und Wachstumseigenschaften von Streptomyces medilerranei ATCC 13 685
und der Mutante M 18, ATCC 21
Medien
Hafermehl-Agar1)
Strepiomyces mediterranei ATCC 13 685
gutes Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel durchscheinend bis gelblich mit rosafarbener Unterseite; weißliches Luftmycel mit rosafarbener Unterseite; Spuren von gelblichem löslichem Pigment Streptomyces mediterranei M 18
ATCC 21 789
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel grünlich bis
orange mit bernsteinfarbener Schattierung; kein Luftmycel; gelbgrünes
lösliches Pigment
Fortsetzung
Medien
Strepiomyces mediierninei ATCC 13 6SS Streptomyces medüerranei M IS ATCC 21 7S9
Hefeextrakt-Glukose Agar
(Radius Nr. 2,
Gottlieb und
Shirling)2)
Emersons Glukose-Agar1)
Bennetts Aaar1)
Ponassay Agar3)
Hefeextrakt-Melasse
Agar4)
Czapek-Dor Glukose
Agar1)
Kartoffel Agar1)
Gl ukose-As paragi η
Agar1)
Asparagin Agar
(Medium Nr. 5
G ο 111i e b und
Shirling)2)
Nähragar1)
Pridhams Agar2
Stärke-Agar
(Medium Nr. 4
Gottlieb und
Shirling)2)
reichliches Wachstum, gelblich bis rosafarben mit rauher Oberfläche; wenig Luftmycel; keine Pigmentierung des Mediums
reichliches Wachstum, gelblich bis rosaorange mit rauher Oberfläche; dürftiges Luftmycel, wird rosafarben; keine Pigmentierung des Mediums
gutes Wachstum; gelblich, übergehend in orangegelb: Luftmycel wird rosafarben; hellbraunes Pigment
geringes Wachstum
reichliches rauhes Wachstum, farblos bis gelblich: weißliches Luftmycel; dunkles bernsteinfarbenes lösliches Pigment
geringes Wachstum, dünn und farblos bis leicht mclonfarben; Spuren von rosaweißem Luftmycel; kein lösliches Pigment
geringes Wachstum, dünn und farblos; Spuren von weißlichem Luftmycel; kein lösliches Pigment
gates Wachstum mit glatter Oberfläche; dünnes vegc* 'ives Mycel, leicht orangerosa mit gelblicher Unterseite; kein Luftmycel; etwas hellgelbes lösliches Pigment
gutes Wachstum mit glatter Oberfläche; dünnes vegetatives Mycel, hell orangerosafarben mit gelblicher Unterseite kein Luftmycel; etwa hellgelbes lösliches Pigment
mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche; melonfarben bis orange mit gelblichorangefarbener Unterseite; Luftmycel rosaweiß; kein lösliches Pigment
mäßiges Wachstum, glatt farblos mit hummerroten Flecken; rosa Luftmycel; keine Pigmentierung des Mediums
geringes Wachstum, farblos bis leicht orangerosa; spärliches weißes Luftmycel; Stärkehydrolyse; zweifelhaft
reichliches Wachstum mit runzliger Oberfläche; vegetatives Mycel bernsteinbraun mit orangebraunen Rändern; Spuren von rosafarbenem Luftmycel; dunkles bernsteinbraunes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; orangefarbenes vegetatives Mycel; kein Luftmycel; goldgelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit sehr runzliger Oberfläche; vegetatives Mycel bernsteinbraun mit orangebraunen Rändern; Spuren von rosafarbenem Luftmycel; tief bernsteinbraunes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit dünner und glatter Oberfläche; vegetatives Mycel leichtorange; kein Luftmycel; Spuren von hellgelbem löslichem Pigment reichliches Wachstum mit sehr runzliger Oberfläche; vegetatives Mycel verbrannt braun mit orangebraunen Rändern; Spuren von rosafarbenem Luftmycel; tiefgelbes ockerfarbenes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel leichtorange; kein Luftmycel; helles zitronengelbes Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; bernsteinrosafarbenes vegetatives Mycel
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; orangefarbenes vegetatives Mycel; kein Luftmycel; Spuren von zitronengelbem löslichem Pigment
reichliches Wachstum mit dünner glatter Oberfläche; hell orangefarbenes vegetatives Mycel; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche: orangefarbenes vegetatives Mycel; kein Luftmycel; hellgelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel leicht orange mit kleinen Stellen von ziegelroter Farbe; Spuren von rosafarbenem Luflmycel; gelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel tief orange mit bräunlicher Färbung; reichliches rosa Luftmycel; Chromgelbes lösliches Pigment; Stärkehydrolyse; negativ
Fortsetzung
Medien
Dextrose-Trypton Agar1)
Ffickeys und Tresners
Kobaltagar5)
Tyrosin Agar
(Medium Nr. 7
G ο 111i e b und
Shirling)2)
Ca-Malat Agar1)
Gelatine1)
Nitrat brühe1)
Lackmusmilch1)
Magermilch Agar3)
Pepton-Hefe Extrakt
Eisen Agar
(Medium Nr. 6
Gott lieb und
Shirling)2)
Streptomyces medilarnmci ATCC I3 6S5
reichliches Wachstum, orangerosa mit goldgelber bis orangefarbener Unterseite; rosa Luftrnycel; hell goldgelbes lösliches Pigment
mäßiges Wachstum, durchscheinend bis hclirosaürange; etwas rosa Luftmycel; etwas gelbliches lösliches Pigment
geringes Wachstum
gutes Wachstum, farblos; Luftmycel weißlich mit rosa Färbung; kein lösliches Pigment; partielle Auflösung des Ca-Malats
keine Pigmentierung, Verflüssigung: langsam und unvollständig
Oberflächen λ achstum mit rosafarbene Luftmycel; keine Reduktion zu Nitriten; die Brühe wird gelblich
keine Peptonisierung oder Koagulierung; leichte alkalische Reaktion
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives M>cel orange; Casein hydrolyse: positiv; rosa Luflmycel; kein lösliches Pigment
mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche; farbloses vegetatives Mycel; Spuren von weißlichem Luftmycel; kein lösliches Pigment; H2S Produktion: negativ
Streptomyces rriL-dilerranei M J 8 ATCC 21 789
reichliches Wachstum mit runzliger Oberfläche; orangefarbenes vegetatives Mycel; kein Luftmycel; gelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel bernsteinfarbenrose; Spuren von rosa Luftmycet, bernsteinrosefarbenes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit runzliger Oberfläche; vegetatives Mycel tief orange mit bräunlicher Färbung; kein Luftmycel; gelbes lösliches Pigment; Tyrosinasereaktion; stark positiv
gutes Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives leicht orangefarbenes Mycel; kein Luftmycel; hell zitronengelbes lösliches Pigment; geringe Auflösung von Ca-Malat
keine Pigmentierung; Verflüssigung: positiv
Oberflächenwachstum mit rosa Luftmycel; Reduktion der Nitrate; die Brühe wird gelblich
keine Koagulierung; keine Peptonisierung
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche; vegetatives Mycel orange; goldgelbes lösliches Pigment; kein Luftmycel; Caseinhydrolyse: stark positiv
mäßiges Wachstum mit dünner und glatter Oberfläche; farbloses vegetatives Mycel; kein Luftmycel; kein lösliches Pigment; H2S Produktion: negativ
Die Farbbestimmung erfolgte nach der Methode von M a e r ζ und Paul (A dictionary of colour, McGraw-Hill, Inc., N. Y. 1950). Die verwendeten Nährmedien sind in den folgenden Literaturstellen näher beschrieben: ') S. A. Wales man, The Actinomyceles, The Williams and Wilkins Co., Baltimore 1961, Bd. 2, S. 328 bis 334.
-) Pridham und Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966), S. 313 bis 340.
3) Difco Manual 1962, Difco Labs. Detroit, Michigan, S. 67 und 63.
4) P. Margali lh und G. Beretta. Mycopalhol. et Mycol. Applicata 13 (1960), S. 321 bis 330.
5) R. J. H ic key und Tr es η er. J bacteriol. 64. S. 891 und 892.
Fermentation 6o
Ein technischer Stamm von Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 und der Stamm M 18 (ATCC 789) wurden 6 bis 8 Tag. bei 28° C auf Bennett-Agar gezüchtet. Vegetatives Medium wurde mit 65 einem Schrägnährboden aus Bennett-Agar beimpft (1/2 Schrägnährboden je Flasche). Die Flaschen wurden 72 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler gehalten. Das verwendete vegetative Medium enthielt:
Rinderextrakt 5 g
Hefeextrakt 5 g
Pepton » 5 g
Kaseinhydrolysat 3 g
NaCl 1,5 g
H, O auf 11
Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,3 eingestellt. In 500-ml-Erlenmeyerkölben wurde 100 ml vegetatives Medium verwendet. Nach 72stündigem Wachstum wurden 5 Volumteile des vegetativen Mediums zum Beimpfen von 100 Volumteilen Fermentätionsmcdium verwendet.
Es wurden zwei Fermentationsmedien eingesetzt:
RFB 744: ein synthetisches Medium, RFB 2244; ein komplexes Medium.
Die Fermentationen wurden jeweils mit 50 ml Medium in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt.
Die beiden Medien hatten die folgende Zusammensetzung:
RFB 744
Glukose 96 g
(NHJ2SO4 15 g
Tabelle 3
Suniiin Rifamycin ß
in Medium
mit Daibiliiiat		 ohne Barbilurat
Streptomyces
mediterranei
ATCC 13 685
Mutänlc M 18
ATCC 21 789 		2210
2290		 <39O(O) ;f
2240
KH2PO4
MgSO4-7H2O
CaCO3
CuSO4 -5H2O.
7H2O
7H2O
2g Ig 17 g
U,OO33 g 0,01g Das verwendete Fermentauonsmedium war RFB 2244 mit und ohne 1,5 g Natriumdiäthylbarbi-•5 lurat je Liter. Temperatur 28° C, Dauer der Fermentation 190 Stunden.
(o) Dieses Ergebnis stellt eine obere Grenze für die vorhandene Menge Rifamycin B dar, die Gegenwart des Rifamycinkomplexes die normale Untersuchung beeinträchtigt.
Tabelle 4
0,04 g 0,002 g
FeSO4
ZnSO4
MnSO4 · 4H2O
CoCl2 ■ 6H2O .
(NH4J6Mo7O24 · 4H2O 0.0Oi g
Natriumdiäthylbarbiturat 2 g
H2O 100° ml
pH vor dem Sterilisieren 6,8
pH nach dem Sterilisieren ... 6,3
RFB 2244
Rifamycin
mit
Bar hu urai
^p, Streptomyces
mediterranei
ATCC 13 685 344
MutanteM 18
ATCC 21 789 | 580
Glukose
CaCO3
Erdnußmehl
Soiamehl
(NH4J2SO4
MgSO4 -7H2O
FeSO4-7H2O
CuSO4 -5H2O
ZnSO4-7H2O
MnSO4 -5H2O
CoCl2-6H2O
(NH4J6Mo7O24 -4H2O
Natriumdiäthylbarbiturat
pH vor dem Sterilisieren
korrigiert mit 15%igem NaOH
pH nach dem Sterilisieren
Antischaummittel A 0,2 ml je Flasche mit 50 ml Wachstumsmedium
Die gleichen Medien wurden zu Vergleichszwecken ohne Natriumdiäthylbarbiturat hergestellt. Die Fermentationsbedingungen und -geschwindigkeiten sind in den Tabellen 3 und 4 zusammen mit den erhaltenen Rifamycin B Ausbeuten aufgeführt.
126,5 g
9,5 ε
25 g ~
10 ε
Ig
1 g
0.01 g 0,0033 g 0,050 g 0,004 g 0,002 g 0,001 g 1,5 g 7,4
6,2 bis 6,3
ollllf
Barhiti'rai
< 107
513
Rifamycinknmplcx
ΙμΒΠΐΙ]
mit I ohne
Sdibiliiut Barbiturat
99
Das verwendete Fermentationsmedium war RFB 744 mit und ohne 1,5 g je Liter Natriumdiäthylbarbiturat. Die Fermentationszeit betrug 144 Stunden bei 28° C auf einem Rotationsschüttler.
Feststellung des Rifamycin B Gehalts
Der Rifamycin B Gehalt der filtrierten Brühen wurde durch Differentialspektrophotometrie nach Pasqualucci und Mitarbeiter, Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd. 59, S. 684 (1970), ermittelt.
Feststellung der Menge an Rifamycinkomplex
Proben des Fermentationsmediums wurden mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wurde dann mit Phosphatpuffer vom pH 7,38 extrahiert, Unter diesen Bedingungen wird das Rifamycin B vom Puffer extrahiert, während der Rifamycinkomplex in der organischen Phase verbleibt. Der Rifamycinkomplex im Äthylacetat wird spektrophotometrisch durch Messen der optischen Dichte be: 460 ιημ einer Probe festgestellt, die in geeignete Weise mit Äthylalkohol verdünnt wurde, der 1°Λ Ascorbinsäure enthält.
409 521.'36.
4^69

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B durch Züchten von Streptomyces-Stäramen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm Streptomyces mediterranei M 18, ATCC 21 789 verwendet.
DE2319322A 1972-05-05 1973-04-17 Verfahren zur Herstellung von Rifamycin B Expired DE2319322C3 (de)

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