Sposób wytwarzania ryfamycyny B Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia ryfamycyny B na drodze fermentacji.Z wczesniejszych prac wiadomo, ze w czasie fermentacji na normalnej pozywce, Streptomyces mediterranci wytwarza szereg antybiotyków kla¬ syfikowanych ogólnie jako ryfamycyna kompleks (P. Sensi i wspólpr. 1959, Antibiotics Annual 1959— 1960 str. 262). Wiadomo równiez, ze dodanie do pozywki wegetatywnej dwuetylobarbituranu sodu, który spelnia role inhibitora powstawania ryfa- mycyn A, C, D i E powoduje powstawanie jednego produktu, a mianowicie ryfamycyny B (Margalith P. i Pagani H., Applied Microbiology 9, 325, 1961).Stwierdzono, ze wyizolowany mutant Streptomy¬ ces mediterranei wytwarza wylacznie ryfamycyne B, niezaleznie od obecnosci dwuetylobarbituranu sodu w brzeczce fermentacyjnej.W celu wyizolowania mutanta, zadaje sie zawie¬ sine zarodników Streptomyces mediterranei ATCC 13685 N-metylo-N'-nitrozo-N-nitroguanidyna w obe¬ cnosci 1 mg/ml trójhydroksymetyloaminometanu ja¬ ko buforu o wartosci pH = 9,0 w ciagu 60 minut w temperaturze 28°C. Zarodniki przemywa sie na¬ stepnie i umieszcza na plytkach Petriego na aga¬ rze Bennetta. Po czternastodniowej inkubacji w temperaturze 28°C oddziela sie pojedyncze kolonie i przeszczepia na pozywki plynne z dodatkiem lub bez dodatku dwuetylobarbituranu sodu i bada sie na zdolnosc wytwarzania ryfamycyny B. Mutanty, wytwarzajace duze ilosci ryfamycyny B bez do¬ lo 15 25 datku dwuetylobarbituranu sodu, byly badane da¬ lej. Sposród mutantów, wzrastajacych bez dodatku dwuetylobarbituranu sodu, wybrano jeden i zde¬ ponowano w ATCC pod numerem 21789 jako mu¬ tant M 18. Charakterystyka jego bedzie dalej opi¬ sana szczególowo. Inne uzyskane mutanty róznia sie od szczepu M 18 tylko drugorzednymi wlasci¬ wosciami. Odbiegaja one istotnie od opisu szczepu M 18 zamieszczonego w tablicy 4.Sposób wytwarzania ryfamycyny B na drodze fermentacji polega na tym, ze na pozywce, za¬ wierajacej zródlo przyswajalnego wegla, zródlo przyswajalnego azotu oraz niezbedne sole mineral¬ ne, poddaje sie fermentacji mutant Streptomyces mediterranei M 18 ATCC 21789 az do uzyskania aktywnosci antybiotykowej i z brzeczki wyizolo- wuje sie ryfamycyne B. Przemyslowy szczep Stre¬ ptomyces mediterranei ATCC 13685 oraz mutant M 18 hoduje sie na agarze Bennetta w ciagu 6—8 dni w temperaturze 28°C. Kolbki z pozywka we¬ getatywna szczepi sie ze skosów (w ilosci 172 skosu na kolbke) i nastepnie inkubuje sie w tempera¬ turze 28°C w ciagu 72 godzin. Pozywka sklada sie z nastepujacych skladników: ekstrakt wolowy 5 g ekstrakt drozdzowy 5 g pepton 5 g kazeina hodrolizowana 3 g sól kuchenna 1,5 g woda do objetosci 1 litra 82 636$ 3 82 636 4 Odczyn pozywki doprowadza sie do wartosci pH = 7,3 za pomoca roztworu NaOH. Przygotowana pozywke rozlewa sie do kolbek Erlenmayera o ob¬ jetosci 500 ml w ilosci po 100 ml na kolbke. Po 72 godzinach inkubacji, zawartosc kolbki wykorzystu¬ je sie jako inokulum do zaszczepienia pozywki fer¬ mentacyjnej (5°/o objetosciowych inokulum). Do fermentacji uzywa sie dwóch pozywek o nastepu¬ jacych skladach. RFB 744 jest pozywka syntetycz¬ na, a RFB 2244 kompleksowa.Fermentacje prowadzi sie zawsze w kolbach Er¬ lenmayera o objetosci 500 ml, zawierajacych 50 ml pozywki.RFB 744: glukoza (NH4)2S04 KH2P04 MgS04'7H20 P CaC03 CuS04-5H20 FeS04-7H20 ZnS04-7H20 MnS04-4H20 CoCl2-6H20 (NH4)6Mo7024-4H20 Dwuetylobarbituran sodu woda pH przed sterylizacja pH po sterylizacji RFB 2244: glukoza glikol propylenowy CaC03 maczka orzechowa maczka sojowa (NH4)2S04 MgS04-7H20 FeS04-7H20 CuS04-5H20 ZnS04-7H20 MnS04-5H20 CoCl2-6H20 (NH4)6M07O24-4H2O dwuetylobarbituran sodowy 96 g 15 g 2 g 1 g 17 g 0,0033 g 0,01 g 0,05 g 0,04 g 0,002 g 0,001 g 2 g 1000 ml 6,8 6,3 126,5 g 5 g 9,5 g 25 g 10 g 1 g 1 g 0,01 g 0,0033 g 0,050 g 0,004 g 0,002 g 0,001 g 1,5 g wartosc pH przed sterylizacja, korygowana 15% roztworem NaOH 7,4 wartosc pH po sterylizacji Tablica 1 6,2—6,3 Szczep Streptomyces medi¬ terranei ATCC 13685 Mutant M 18 ATCC 21789 Ilosc ryfamycyny B w ug/ml z berbitura- nem 2210 2290 bez barbi¬ turanu <390C) 2240 | 30 35 40 45 50 Fermentacje prowadzono na pozywce RFB 2244 z do¬ datkiem lub bez dodatku 1,5 g dwuetylobarbituranu sodu na litr. Fermentacje prowadzono w temperaturze 28°C w ciagu 190 godzin. (*) wynik ten stanowi górna granice ilosci ryfamycyny B, oznaczanej w obecnosci ryfamycyny kompleks za po¬ moca normalnej analizy. 60 65 Antifoam A (srodek przeciw pienieniu) 0,2 ml na kolbke, zawierajaca 50 ml pozywki.Pozywki fermentacyjne o podanych skladach przygotowuje sie równiez bez dodatku dwuetylo¬ barbituranu sodu, celem przeprowadzenia fermen¬ tacji porównawczych.Uzyskane wydajnosci ryfamycyny B oraz warun¬ ki fermentacji i proporcje podano w tablicach 1 i 2. 10 15 20 Szczep Streptomyces mediterranei ATCC 13685 Mutant M 18 ATCC 21789 Tablica 2 ryfamycyna B lig/ml z bar¬ bitura¬ nem 344 580 bez bar¬ bituranu <107 513 ryfamycyna komp eks ug/ml [ y barbi- tunorem bez bar- | Dituranu [ 99 Fermentacje prowadzono na pozywce RFB 744 z dodat¬ kiem lub bez dodatku 15g/l dwuetylobarbituranu sodu.Fermentacje prowadzono w temperaturze 28°C w ciagu 144 godzin na trzesowkach.Zawartosc ryfamycyny B w odfiltrowanym bulio¬ nie oznacza sie, stosujac spektrofotometryczna me¬ tode porównawcza opisana przez Pasqualucci'ego i wspólpr. Journal of Pharmaceutical Sciences, 59, 685, 1970. Oznaczenie ryfamycyny kompleks prowa¬ dzi sie w nastepujacy sposób. Kwasowosc próbek brzeczki doprowadza sie do wartosci pH = 2,0 kwa¬ sem solnym i ekstrahuje sie octanem etylu. War¬ stwe organiczna przemywa sie buforem fosforano¬ wym o wartosci pH = 7,38. W takich warunkach ryfamycyna B przechodzi calkowicie do warstwy wodnej, natomiast ryfamycyna kompleks pozostaje w warstwie organicznej. Ryfamycyne kompleks oznacza sie spektrofotometrycznie w octanie etylu przy dlugosci fali 460 m^, rozcienczajac odpowied¬ nie porcje roztworu alkoholem etylowym, zawie¬ rajacym l°/o kwasu askorbinowego.Tablica 3 Przyswajalnosc zwiazków wegla przez szczep Streptomyces mediterranei i mutanta M 18 Streptomyces zródlo wegla mediterranei ATCC 13685 Inozytol + + Fruktoza + + Ramnoza + + Ksyloza + + Rafinoza — Arabinoza + + Celuloza — Sacharoza (próba pozytywna) + + Bezweglowe (pr. negatywna) — MetantM18 ATCC 21789 + + 1 + + + + + + — 1 + + — + + — W tablicy 4 zebrano dane dotyczace cech morfo¬ logicznych i rozwojowych badanych szczepów.5 82 636 6 Tablica 4 Porównanie morfologicznych i rozwojowych wlasciwosci Streptomyces mediterranei ATCC 13685 oraz mutanta M 18 ATCC 21789 Podloze Streptoniyces medite¬ rranei ATCC 13685 Stereptomyces mediterra¬ nei M 18 ATCC 21789 2 Agar owsiany Agar drozdzo- wo-glukozowy (podloze nr 2 Gottlieb i Shirling) Agar glukozowy Emerson'a Agar Bennetfa Agar Penassay Agar drozdzo- wo-melasowy Agar glikozowy Czapek-Dox Agar ziemnia¬ czany Agar glukozo- wo-asparagino- wy Dosc dobry rozwój o gladkiej powierzchni.Grzybnia wegetatyw¬ na szklista do zólta¬ wej z rózowym odcie¬ niem. Slady zóltego barwnika rozpuszczal¬ nego w podlozu.Obfity rozwój zóltawy do rózowego z szorstka powierzchnia. Slaba grzybnia powietrzna.Brak zabarwienia pod¬ loza.Rozwój obfity, zólta¬ wy do rózowo-poma- ranczowego z chropo¬ wata powierzchnia. U- boga grzybnia powie¬ trzna, rózowawa. Brak barwnika w podlozu.Dobry rozwój, zólty przechodzacy w zólto- -pomaranczowy. Grzy¬ bnia powietrzna rózo¬ wiejaca. Jasny burszty¬ nowy barwnik w pod¬ lozu.Rozwój ubogi.Rozwój obfity, chropo¬ waty, bezbarwny do zóltawego. Biala grzy¬ bnia powietrzna. W podlozu bursztynowy barwnik.Rozwój slaby, cienki, bezbarwny do jasno melonowego. Slady ró- zowawo bialej grzybni powietrznej. Brak barwnika w podlozu.Rozwój ubogi, cienki, bezbarwny. Slady bie¬ lejacej grzybni powie¬ trznej. Brak barwnika w podlozu.Dosc dobry rozwój z gladka powierzchnia.Grzybnia wegetatyw¬ na cienka, jasno po¬ maranczowa z zólta- Rozwój obfity o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wegeta¬ tywna zielonkawa do poma¬ ranczowej z bursztynowym cieniem. Brak grzybni po¬ wietrznej. Zólty barwnik rozpuszczalny w podlozu.Obfity rozwój o pomarszczo¬ nej powierzchni. Grzybnia wegetatywna bursztynowo brazowa z brazowo poma¬ ranczowymi brzegami. Sla¬ dy rózowej grzybni powie¬ trznej. Bursztynowo brazo¬ wy barwnik rozpuszczalny w podlozu.Rozwój obfity o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wege¬ tatywna pomaranczowa.Brak grzybni powietrznej.Zólto zloty barwnik rozpu¬ szczalny w podlozu.Rozwój obfity z silnie po¬ marszczona powierzchnia.Grzybnia wegetatywna bur¬ sztynowo brazowa z brazo¬ wo pomaranczowymi brze¬ gami. Slady rózowiejacej grzybni powietrznej. W pod¬ lozu rozpuszczalny barwnik bursztynowo brazowy.Rozwój obfity ó cienkiej, gladkiej powierzchni. Grzyb¬ nia wegetatywna jasno poma¬ ranczowa. Brak grzybni po¬ wietrznej. W podlozu jasno cytrynowy barwnik.Rozwój obfity z powierzch¬ nia pomarszczona. Grzybnia wegetatywna w kolorze pa¬ lonego brazu, z pomaranczo¬ wymi brzegami. Slady rózo¬ wej grzybni powietrznej.Zólto ochrowy barwnik w podlozu.Obfity rozwój o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wege¬ tatywna jasno pomaranczo¬ wa. Brak grzybni powietrz¬ nej. W podlozu jasno cytry¬ nowy barwnik.Obfity rozwój z gladka po¬ wierzchnia. Rózowo burszty¬ nowa grzybnia wegetatywna.Obfity rozwój z gladka po¬ wierzchnia. Grzybnia wege¬ tatywna pomaranczowa.Brak grzybni powietrznej.W podlozu slady barwnika82 636 8 c.d. tablicy 4 Agar asparagi¬ nowy (podloze nr 5 Gottlieb i Shirling) Agar odzywczy Agar Pridhama Agar skrobio¬ wy (podloze nr 4 Gottlieb i Shirling) Agar dekstrozo- -tryptonowy Agar kobalto¬ wy Hickey'a i Tresner'a Agar tyryzyno- wy (podloze nr 7 Gottlieb i Shirling) Agar jablczanu wapniowego wym odcieniem. Brak grzybni powietrznej.Slady jasno zóltego barwnika w podlozu.Dosc dobry rozwój o gladkiej powierzchni.Grzybnia wegetatywna cienka, jasno rózowo pomaranczowa z zól¬ tym odcieniem. Brak grzybni powietrznej.W podlozu slady barw¬ nika jasno zóltego.Rozwój umiarkowany o gladkiej powierzch¬ ni, melonowy do po¬ maranczowego z zólto pomaranczowym od¬ cieniem. Grzybnia po¬ wietrzna bialo rózowa.Brak barwnika rozpu¬ szczalnego w podlozu.Umiarkowany rozwój, gladki, bezbarwny z czerwonymi plamka¬ mi. Grzybnia powie¬ trzna rózowa. Brak za¬ barwienia podloza.Ubogi rozwój, bezbar¬ wny do jasno poma¬ ranczowo rózowego.Uboga biala grzybnia powietrzna. Hydroliza skrobii watpliwa.Obfity rozwój rózowo pomaranczowy z od¬ cieniem zólto zlotym do pomaranczowego.Rózowawa grzybnia powietrzna, Jasno zlo¬ to zólty barwnik w podlozu.Umiarkowany rozwój, szklisty do jasno rózo¬ wo pomaranczowego.Nieco rózowej grzybni powietrznej. Slady zól¬ tego barwnika rozpu¬ szczalnego w podlozu.Rozwój ubogi.Dosc dobry rozwój, bezbarwny. Grzybnia powietrzna biala z ró¬ zowym odcieniem.Brak rozpuszczalnego barwnika. Czesciowe wylugowanie jablcza¬ nu wapnia. cytrynowo zóltego.Rozwój obfity o cienkiej, gladkiej powierzchni. Grzybr nia wegetatywna jasno po¬ maranczowa. Brak grzybni powietrznej. Brak barwnika rozpuszczalnego w podlozu.Obfity rozwój o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wegeta¬ tywna pomaranczowa. Brak grzybni powietrznej. Barw¬ nik rozpuszczalny jasno zól¬ ty.Obfity rozwój o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wegeta¬ tywna jasno pomaranczowa z malymi latkami, zabarwio¬ nymi ceglasto-czerwono. Sia¬ dy rózowej grzybni powie¬ trznej. W podlozu zólty barwnik.Obfity rozwój z gladka po¬ wierzchnia. Grzybnia wege¬ tatywna gleboko pomaran¬ czowa z odcieniem brazo¬ wym. Obfita grzybnia po¬ wietrzna. Zólty barwnik w podlozu. Brak hydrolizy skrobii.Obfity rozwój z pomarszczo¬ na powierzchnia. Pomaran¬ czowa grzybnia wegetatyw¬ na. Brak grzybni powietrz¬ nej. Zólty barwnik w pod¬ lozu.Obfity rozwój o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wegeta¬ tywna rózowo bursztynowa.Siady rózowawej powietrz¬ nej grzybni. Rózowo bur¬ sztynowy barwnik w podlo¬ zu.Rozwój obfity z pomarszczo¬ na powierzchnia. Grzybnia wegetatywna gleboko poma¬ ranczowa z brazowym od¬ cieniem. Brak grzybni po¬ wietrznej. Zólty barwnik w podlozu. Reakcja tyrozono- wa silnie dodatnia.Dosc dobry rozwój o glad¬ kiej powierzchni. Grzybnia wegetatywna jasno poma¬ ranczowa. Brak grzybni po¬ wietrznej. W podlozu barw- •nik jasno cytrynowy. Slabe wylugowanie jablczanu wa¬ pnia.82 636 10 c.d. tablicy 4 1 Zelatyna Bulion azotanowy Mleczko lakmusowe Agar mleczny spieniony Peptynowo drozdzowy agar zelazisty (pod¬ loze nr 6 Gottlieb i Shirling). 2 Brak zabarwienia. U- plynnianie powolne i niecalkowite.Powierzchnia rozwoju z rózowym nalotem grzybni powietrznej.Brak redukcji azoty¬ nów. Bulion zólknie.Brak peptyzacji i ko¬ agulacji. Reakcja lek¬ ko alkaliczna.Obfity rozwój o glad¬ kiej powierzchni.Grzybnia wegetatyw¬ na pomaranczowa. Hy¬ droliza kazeiny pozy¬ tywna. Rózowa grzyb¬ nia powietrzna. Brak barwnika rozpuszczal¬ nego.Umiarkowany rozwój o gladkiej powierzch¬ ni. Bezbarwna grzyb¬ nia wegetatywna. Sla¬ dy barwnika rozpusz¬ czalnego. Nie wytwa¬ rza siarkowodoru. 3 1 Brak zabarwienia. Uplyn¬ nianie dobre.Powierzchnia rozwoju z ró- zowawym nalotem grzybni powietrznej. Redukcja azo¬ tanów. Bulion zólknie.Brak peptyzacji i koagula¬ cji.Obfity rozwój o gladkiej po¬ wierzchni. Grzybnia wege¬ tatywna pomaranczowa. Zól¬ to zloty barwnik rozpusz¬ czalny. Brak grzybni powie¬ trznej. Hydroliza kazeiny wyraznie dodatnia.Umiarkowany rozwój o glad¬ kiej powierzchni. Grzybnia wegetatywna bezbarwna.Brak grzybni powietrznej.Brak barwnika rozpuszczal¬ nego. Nie wytwarza siarko¬ wodoru.Oznaczenia kolorów prowadzono metoda, opisa¬ na w Maerz A. and M.R. Paul, A Dictionary of colour, Mc Grow-Hill Inc., N.Y. 1950.Do charakterystyki rozwoju Streptomyces medi- terranei i szczepu M 18 stosowano rózne standar¬ dowe podloza wedlug dziela Shirling E. B. and D. Gottlieb: Methods of characterization of Strep¬ tomyces species, Intern. J. Syst. Bact. 16, 313-340, 1966 oraz podloza zalecane przez Waksman S.A.: The actinomycetes, Vol. II. The William and Wil- kins Co., 1961. 30 PL PL PL PL PL