DE2302744A1 - Verfahren zur reinigung von roher chenodesoxycholsaeure - Google Patents

Description

Anmelder i UNION INTERNATIONAL COMPANY LIMITED
13-16 West Smithfield, London, E.C.1., England

Verfahren r,ur Reinigung von roher

Chenodesoxycholaäure

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von ChenodesoxycholeUuxe und insbesondere auf ein Verfahren zur Reinigung von roher Chenodesoxycholsäure.

Chenodesoxycholaäure ist eine Verbindung der folgenden Formel

GlI

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ORIGINAL INSPECTED

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die aus dem Gallensäure-Bestandtoil der Galle hergestellt wird. Das Standardverfahren zur Herstellung von Chenodesoxycholsäure aus der Cholsaurefraktion der Galle besteht in der Eliminierung der 12-Hydroxylgruppe aus Cholsäure mit Hilfe eines Ver- \ fahrens, welches die Veresterung, Acetylierung, Oxydation, Hydrazonbildung und abschließende Eliminierung von Stickstoff und Hydrolyse des Produkts unter Bildung von Chenodesoxycholsäure umfaßt. Die Reaktion findet nach folgendem Reaktionsschema statt:

Veresterung

OH

CO₀CH,

Acetylierung

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^V°2^CCII3 Oxydation

CH₅CO₂

O₂CH₃

O₂CCH₃ Hydrazonbildung

N. NIT₀

Cn₃CO₂

O₀CH, Eliminierung > von Stickstoff und Hydrolyse

(nicht isoliert)

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ORIGINAL INSPECTED

HO

CO₂H

Chenodesoxycholsäure (roh)

Ungünstigerweise ist die durch das vorstf^^nd beschriebene
Veifahren gebildete Chenodeeoxycholsäure ausnahmslos ungewöhnlich schwierig zu reinigen, insbesondere deshalb, weil die
Chenodesoxycholsäure auch in hochgereinigter Porin außergewöhnlich schwierig zur Kristallisation zu bringen ist.

Eine spezielle Stufe des Verfahrens, die zur Anreicherung beträchtlicher Verunreinigungen in dem Produkt führt, ist die
Reduktion des 3 e< , 7oi.-Oiacetoxy~12~ketocholanats. Eine Reduktionsmethode ist die sogenannte Wolff-Kishner-Reduktion, die
unter Erhitzen der Ketoverbindung in einem hochsiedenden Lösungsmittel, beispielsweise Äthylenglykol oder Triäthylenglykol in Gegenwart von Kaiiumhydroxid und Hydrazinhydrat mehrere Stunden bei etwa 200° C durchgeführt wird. Das Reduktionsprodukt ist stark verunreinigt mit Produkten, die durch Abbau infolge der scharfen Reaktionsbedingungen gebildet wurden.
Nach einer anderen Ausführungsform kann die Reaktion nach einer Modifizierung der Wolff-Kishner-Methode erfolgen (Sarel
und Yanuka, J. Org. Chem. , 24, 2018 (19i?9)), wobei das 12-Keton zusammen mit Hydrazinhydrat und Äthylenglykol 1 Stunde
bei 100° C gerückflußt wird, das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt wird, festes Kaliumhydroxid während einer
Dauer von 30 Minuten zugesetzt und das überschüssige Hydrazin-

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hydrat und Wasser während einer Dauer von 1 Stunde abdestilliert, werden, während man die Temperatur auf 200° C ansteigen läßt. Das Gemisch v/ird dann weitere 2 Stunden bei dieser Temperatur gehalten, um die Reduktion zu vervollständigen. Auch bei diesem Verfahren ist das Produkt stark verunreinigt mit Abbauprodukten und zahlreiche Umkriställisationsstufen sind erforderlich, um nur einen brauchbaren Reinheitsgrad zu erzielen, wobei die Schwierigkeit auftritt, daß die Kristallisation im Hinblick auf das Produkt nicht einfach ist.

Es wurde nun gefunden, daß rohe Chenodescxycholsäure, die durch irgendein beliebiges übliches Verfahren hergestellt wurde, in einfacher V/eise gereinigt werden kann, indem die rohe Säure in methanolischer Lösung mit einem Calcium- oder Strontiumsalz behandelt wird -.-nd die Lösung dann alkalisch gemacht wild, um das Calcium- oder Strcntiv.msala der Säure auszufällen. Die Herstellung der Säure aus ihrem Calcium- oder Strontiumsalz erfolgt durch einfaches Ansäuern und geeignete Extraktion.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reinigung von roher Chenodesoxycholsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Gemisch aus Methanol, der rohen Säure und einem Calcium- oder Strontiunisalz gebildet wird, die Lösung durch Zugabe einer geeigneten Base alkalisch gemacht v/ird und das kristalline Calcium- oder Strontiumsalz der Chenodesoxycholsäure abgetrennt, das abgetrennte Salz mit einem sauren Reagenz behandelt und die gereinigte Chenodesoxycholsäure abgetrennt wird.

Beispiele für geeignete Calcium- und Strontiumsalze sind Calciumchlorid und Strontiumnitrat (wasserfrei) und Strontiumchlorid-hexahydrat.

Es v/ird bevorzugt, entwedex* eine methanolische Lösung des Calcium- oder Strontiuinßalzes, beispielsweise Calciumchlorid, mit

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einer methanolisclien Lösung der Säure zusammenzugehen und danach die Base den kombinierten Lösungen zuzusetzen, oder, v/as bequemer ist, das Salz, beispielsweise Calciumchlorid, direkt in einer Lösung der Säure in Methanol zu lösen. Diese Ausführungsform wird wegen der erhöhten Lösungsrate (und möglicherweise Löslichkeit) des Salzes unter diesen Bedingungen bevorzugt.

Die Base, die zum Alkalinisieren der Lösung von Salz und roher Säure verwendet wird, kann Ammoniumhydroxid oder gasförmiges Ammoniak oder eine stickstoffhaltige Base sein, die in wässriger Lösung eines pK -Wert von mindestens 6,6 aufweist.

el

Alkalimetallhydroxide können ebenfalls verwendet werden, jedoch nur dann, wenn sie in stöchiometriscn äquivalenter Menge zu einer methanolischen Lösung der rohen Säure gegeben werden, bevor die Zugabe des Calcium- oder Strontiumsalzes erfolgt,
weil sonst die Ausfällung von Calcium- oder Strontiumhydroxid aus der Lösung von Salz und roher Säure eintritt.

Zu den erfindungsgemäß verwendbaren stickstoffhaltigen Basen gehören Methylamin, A'thylamin, sec.-Butylamin, Tri-n-butylamin, Diäthylamin, Triäthylamin, Ä'thanolamin, 1,2-Diaminoäthan, Cyclohexylamin, Tetramethylammoniumhydroxid, Hydrazinhydrat, Piperidin, Piperazin, Pyrrolidin, Benzylamin, Morpholin,
Ν,Ν-Diäthylanilin, 2-Aminopyridin, 1-Methylimidazolin, 2,4-Lutidin und Symcollidin,

nicht jedoch schwache Basen, wie Pyridin, Chinolin oder Anilin. Hexamethylentetramin (Hexamin) ist partiell wirksam, da es verminderte Ausbeuten des Säuresalzes ergibt.

Eine weitere und ziemlich gesonderte Möglichkeit zum Verbessern der Reinheit des Endprodukts betrifft Modifiziert -\ der Aeetylierungsstufe in dem Verfahren zur Herstellung der Chenodesoxycholsäure. Diese umfassen die Auswahl des Reaktionslösungsmittels und der Reaktionsbedingungen in Hinblick auf die Reaktionsdauer und -temperatur. Unter Verwendung von Dioxan als Iö~

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ist die Reaktion (bestimmt durch die Werte der Dünnschichtchromatographie) nach nur 30 Minuten bei S5° C fast vollständig und das Produkt besteht überwiegend aus der gewünschten Diac et oxy verbindung, die nur Spuren an mono- und trisubstituierten Komponenten enthält. Nach 2 Stunden bei dieser Temperatur ist die Reaktion vollständig fibgelaufen, das; Procukt ist jedoch ein Öl, das schwierig zu reinigen ist. Die Reaktion in Tetrahydrofuran bei 50 C während 4 Stunden fülrr t zur vollständigen Diacetylierung, wobei nur Spuren an mono- und triacetylierten Verbindungen vorliegen. Daß vorteilhafteste Lösungsmittel ist Acetonitril, da die Reaktion bei 50° C wähl-end 2 Stunden zu einem geeignexen Material in sehr guter Ausbeute führt. Der Hauptvorteil liegt darin, daß das Produkt aus dem Reaktionsgemisch in einfacher Weise durch Verdünnung mit V/asser kristallisiert und das als erste Ausbeute so gebildete Material wurde erfolgreich ohne weitere Reinigung durch die Ketostufe geführt. Die Acetylierung wurde auch erfolgreich in Dimethylsulfoxid bei 20° C während 22 Stunden vorgenommen, ohne daß jedoch ein besonderer Vorteil erzielt wurde.

Eine weitere Möglichkeit, die Reinheit des Endprodukts gesondert zu verbessern, besteht in einer Modifizierung des Verfahrens zur Herstellung der rohen Säure, bei der die etwas strengen Reaktionsbedingungen vermieden werden, die zur Bildung des Hydrazone durch die Wolff-Kishner-Reduktion oder die Modifizierung der Wolff-Kishner-Reduktion dxireh Sarel und Yanuka erforderlich sind. Es wurde gefunden, daß das 12-Ketodeiivat reduziert werden kann, ohne daß es erforderlich ist, ein Hydrazon zu bilden und die damit verbimdenen strengen Peaktionsbedingungen anzuwenden, indem die Reduktion auf kathodisch cm Weg durchgeführt wird. Es hat sich jedoch gezeigt, daß selbst bei Anwendung dieser milderen Reduktionsmethode das Endprodukt immernoch stark mit Verunreinigungen kontaminiert war. Die Anwendung der kathodischen Reduktions»

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methode in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren führt jedoch zu der Möglichkeit, ein noch reineres Produkt zu erhalten.

Bei dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren kann die Volumenmenge an Methanol, die zum Lösen des Calcium- oder Strontiumsalzes und der rohen Säure verwendet wird, kritisch sein und ist von der Methode abhängig, nach der die rohe Säure ursprünglich hergestellt wurde. Wenn beispielsweise das 3^-7fK-Diacetoxy-12-ketocholanat durch die unmodifizierte Wolff-Kishner-Reduktion hergestellt wurde und ein i^iciumsalz verwendet wird, beträgt die Menge an Methanol, die zum Erzielen des optimalen Reinheitsgrads erforderlich ist, 35 bis 40 ml/g der rohen Säure. Bei Verwendung von Strontiumsalzen vermindert sich das Methanolvolumen auf die Hälfte, das heißt, auf maximal 20 ral/g, um entsprechende Ausbeuten zu erzielen, und kann auf 10 ml/g der rohen Säure vermindert werden. Unterhalb dieses Werts besteht die Neigung, daß bei Zugabe von wässrigem Ammoniumhydroxid die Gallensäure zusammen mit Verunreinigungen durch einen einfachen Verdünnungseffekt ausgefällt wird. Die Verwendung von gasförmigem Ammoniak oder einer anderen wasserfreien stickstoffhaltigen Base, gelöst in Methanol, vermeidet diesen Effekt und in diesem Fall kann eine so geringe Menge Methanol wie 5 ml/g der rohen Säure verwendet werden. Höhere Volumina an Methanol führen zu einem sehr reinen Produkt, jedoch in niedrigeren Ausbeuten.

Es wurde gefunden, daß bei Anwendung des erfindungsgemäPen Reinigungsverfahrens die Dauer, die bis zum Auftreten eines kristallinen Salzes der Säure verstreicht, ein geeignetes Kriterium für die Qualität der rohen Säure darstellt, wenn sie in Relation zu einer festgelegten Volumenmenge des Methanols betrachtet wird. Im allgemeinen ist die Verzögerung bei Iron-

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stanten Ansätzen dea !Materials um so langer, je größer das Volumen des 1" aihs.no Is ist. So beträgt die zur Durchführung des Verfahrens erforderliche Zeit "beispielsweise 30 bis 60 Sekunden bzw. ungefähr 4 Stunden, wenn einerseits 35 his 40 ml und andererseits 125 ml Methanol/g der Säure verwendet v/erden.

Das erfindun^ogemäß erhaltene Produkt, Chenodesoxycholsäure, wird zum Auflösen von Gallensteinen als Therapie zur Behandlung von Cholelithiasis verwendet. Die verbesserte Reinheit des erfindimgsgemäß erhaltenen Produkts führt zu offensichtlichen Vorteilen bei seiner Verwendung als therapeutisches Mittel.

Nachfolgend wird die quantitative Darstellung eines im wesentlichen üblichen Verfall? ons zur Herstellung von roher Chenodesoxycholsäure gegeben, wobei das Produkt danach durch das erfinäungsgetfäße Verfahren gereinigt werden kann. Die Dünnschichtchromatographie wird an 0,25 mm dicken Schichten von Silicagel G durchgefüln-t, das durch Erhitzen auf 105° C während 30 Minuten aktiviert wurde. Testsubstanzen werden als 1#—ige Lösungen (10 p.1) in Aceton zur Beschickung verwendet. Deutliche Veresterung tritt be Mn Stehen.'¹ as sen in methanolischer Lösung ein. Calcium-/Str.ontium-Salz-Pr-äparate werden in Aceton suspendiert und durch Zugabe eines Tropfens Eisessig gelöst. Diese Lösungen sollten frisch bereitet werden, da beim Stehenlassen partielle Acetylierung unter Bildung einer Substanz eintritt, die an der gleichen Stelle wie Lithocholsäure erscheint, das heißt, R 1,7 (CDCA*= 1,0). Die Platten werden in dem Lösun^emitteüsystem Trimethylpentan-Äthylacetat-Essigsäure (5:5:1) entwickelt. Nach dem Trocknen während 10 Minuten bei 105° C wordon die noch warmen Platten entweder mit (a) 10 $ Phosphomo;tybdänöäuro in Äthanol oder mit (b) 5 % PhosphomolybdänsUure in Eisessig - im Gemisch mit konzentrierter Schwefelsäu- * Chenode.soyycholöäuro

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re (19:1) (Reagenz nach Usui, J. Biochem. Tokyo, 1963, 283-6) besprüht. Zur vollen Färbentwicklung werden die Platten weitere 5 Minuten bei 105° C 'erhitzt. Keines dieser Reagenzien entwickelt eine zufriedenstellende Färbung mit der 12-Ketoverbindung und es ist in diesem Fall erforderlich, die entwickelte Platte in der durch Usui beschriebenen Weise mit einer methanolischen Lösung von Natriumborhydrid vorzubehandeln..

500 g Choleäure mit niederem Gehalt an Desoxycholsäure wurden in 1500 ml Methanol in einem Rundkolben «"spendiert. Der Kolben wurde auf einem Dampfbad vorsichtig erwärmt und 21,5 ml konzentrierte Schwefelsäure wurden tropfenweise während einer Dauer von 30 Minuten zu der gerührten Suspension gegeben, wonach 20 Kiimten a.m Rückfluß erhitzt wurde. Nach dieser Zeit hatte sich die gesamte Cholsäure gelöst.

Die klare Lösung wurde unter Rückfluß unter Rühren 20 Minuten erhitzt, um die Veresterung zu vervollständigen, dann rasch unter fortgesetztem Rühren gekühlt, wobei kleine Kristalle ausgebildet -wurden. Die Suspension wurde über Nacht in einen Kühlschrank (O bis 5° C) gekühlt, die Kristalle abfiltriert und mit eiskaltem Methanol (200 ml) gewaschen, um den Hauptanteil der Mneralsäure zu entfernen. Die Kristalle von Methylcholat wurden aus Methanol umkristallisiert, bevor sie der nächsten Verfahrensstufe unterworfen wurden.

400 g Methylcholat wurden bei Raumtemperatur in 1920" ml Benzol, 480 ml Pyridin und 480 ml Essigsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen und danach in einen großen WasserÜberschuß (Gesamtvolumen etwa 8 1) gegossen und damit geschüttelt. Die Benzolschicht wurde abgetrennt und wiederholte Male mit Wasser (4 mal 2 000 ml) gewaschen, um überschüssiges Pyridin zu entfernen. Die wässrigen Schichten wurden verworfen.

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Die Benzollösung wurde über Nacht mit Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockene eingedampft, Der feste Rückstand wurde in Methanol (etwa 1 200 ml) aufgenommen und aus 700 ml dieses Lösungsmittels kristallisiert.

Der grobkristalline (chunky) Feststoff wurde filtriert und mit 100 ml eiskaltem Methanol gewaschen und danach in einem Vakuumtrockenschrank "bei 100° C 10 Stunden getrocknet. Ausbeute 355 g (74 $); F 178 his 182° C. Die Dünnschicht Chromatographie (unter Verwendung des Reagenz nach Usui) der genannten Verbindung zeigte vorherrschend das· 3c^-7c<-Diacetoxy~12-C!(-bydroxy-cholanat mit drei in Spuren vorhandenen Verunreinigungen. Durch UEkristallirioren aus Methanol konnte die Reinheit der Verbindung nicht verbessert werden, wie durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen wurde; es wurde jedoch der Schmelzpunkt (P) auf 182 bis 185° C erhöht.

Methyl-3^-7oC-diaeetpxy-12^-hydroxycholanat (300 g, F 178 bis 182° C; Daten der Dünnschicht Chromatographie wie vorstehend "beschrieben) wurde unter mechanischem Rühren in 1800 ml Eisessig gelöst.

Diese Lösung wurde durch langsame tropfenweise Zugabe einer Lösung von 162 g Natriumchromat (analytisch rein, wasserfrei, Reagenz) in 240 ml Wasser, die während einer Dauer von 1 Stunde erfolgte, oxidiert. Es wurde eine tiefrote Locung erhalten und die Temperatur während der Zugabe wurde zwischen 20° C und 35° C gehalten , ohne daß ein äußeres Kühlbad verwendet wurde.

Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen und am Morgen weitere 30 Minuten erneut gerührt. Dann wurden tropfenweise 1800 ml Wasser zugegeben, wobei ein körniges Produkt ausgefällt wurde. Dieses wurde abfiltrierfc und mit destilliertem Wasser (etwa 3000 ml) gewaschen, bis es farblos war. Das weiße körnige 3c*-7(£-Diacetoxy-12-ketocholanat wurde in einem Vakuumtrockenschrank bei 100° C während 10 Stunden getrocknet.

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Ausbeute 260 g (87 96), F 181 bis 183° C. Die Dünnschichtcb.romatograph.ie (Usui-Sprühreagenz) zeigte überwiegend das 12-Keton mit einer in größeren Mengen und zwei in geringen Mengen vorliegenden Verunreinigungen. Die Kristallisation aus Methanol (2 mal) verbesserte die Daten der Dünnschichtehro-. matographie des 12-Ketons, es wurde nur eine in Spuren vorliegende Verunreinigung beobachtet. Der Schmelzpunkt wurde auf 182 bis 184° C erhöht.

Ein Gemisch aus 5 g des 3c<-7o(-Diacetoxy-12-ketocholanats (2 mal aus Methanol uraicristallisiert), 20 ml Hydrazinhydrat (99 bis 100 $) und 30 ml Ithylenglykol (Reinheit nicht geringer als 95 fo, Siedebereich zwischen 194⁰C und 199⁰C) wurde 2 Stunden bei 140° C (Flüssigkeitstemperatur) gerückflußt. Eine 40 $-ige Lösung von 10 g Kaliumhydroxid in 25 ml Wasser wurde dann zu diesem heißen klaren Reaktionsgemisch zugegeben und ein Überschuß an Hydrazinhydrat und Wasser wurde während 1 Stunde -'abdestilliert, während die Flüssigkeitstemperatur auf 200° C anstieg. Diese Temperatur wurde weitere 2 Stunden aufrechterhalten, um die Reduktion zu vervollständigen.

Das Reaktionsgemisch wurde über Facht auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann mit -etwa 200 ml Wasser verdünnt. 2n-Chlorwasserstoffsäure wurde tropfenweise zu der mechanisch gerührten Lösung bis zu einem pH-Wert von 1 (festgestellt mit Hilfe von Indikatorpapier) zugesetzt, wobei ein weißer niederschlag erhalten wurde. Es waren etwa 110 ml der. Säure erforderlich.

Die rohe Chenodesoxycholsäure wurde abfiltriert, mit Wasser von Säure freigewaschen (etwa 2000 ml) und während 10 Stunden in einem Vakuumtrockenschrank bei 60° G biß zaun Erzielen eines spröden nichtkristallinen Feststoffes getrocknet. Es wurden 3,8 g (theoretisches Gewicht 3,9 g) erhalten» Es ist wesentlich, daß in dieser Stufe die gesamte Minexslsäure ausgewaschen wird, weil sonst während des Troeknungsvorgangs star*-

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ker Abbau der Chenodesoxycholsäure erfolgt. Um sicherzustellen, daß die gesamte Säure entfernt ist, kann die ausgefällte Säure wieder mit V/asser aufgeschlämmt werden, der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 5 bis 6 eingestellt werden und wieder filtriert werden, bevor sie getrocknet wird.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beisnißl 1

3 g rohe Chenodesoxycholsäure wurden bei Raumtemperatur in 120 ml Methanol gelöst und filtriert, um alles suspendierte Material zu entfernen. 0,57 g Calciumchlorid-dihydrat (Analar) wurde bei Räumtempertür in dieser Lösung gelöst. Bei Zugabe von 0,8 ml Ammoniumhydroxidlösung (Dichte 0,910) bis zu einem pH-Wert von 7,5 (bestimmt mit angefeuchtetem Indikatorpapier) wurde innerhalb einer Dauer von 10 Sekunden bis 2 Minuten ein weißer kristalliner Niederschlag des Calciumsalzes beobachtet. Dieses wurde über Nacht bei Raumtemperatur absitzen gelassen, filtriert, mit 40 ml Methanol gewaschen und 10 Stunden in einem Vakuumtrockenschrank bei 100° C getrocknet. Ausbeute 2,3 g. Die Dünnschichtchromatographie (Sprühreagenz 10 $ Phosphomolybdänsäure iri Äthanol) zeigte, daß das Material nur einen Flecken bildete. Das Calciumsalz (2,3 g) wurde mit 50 ml 2n-0hlorwasserst off säure angesäuert und mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetat-Extrakt wurde 5 mal mit je 50 ml Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und die rohe Chenodesoxycholsäure wurde durch langsame Zugabe von 150 ml Petroläther (80 bis 100° C) ausgefällt. Der Feststoff wurde filtriert und in einem Vakuumtrockenschrank bei 60° C 10 Stunden getrocknet. Es wurden 1,75 g (58 $-ige Wiedergewinnung) erhalten. Die Dünnschichtchromatographie (Sprühreagenz 10 fi Phοsphοmolybdänsäure in Äthanol) zeigte , daß Chenodesoxycholsäure erhalten wurde, die nur einen Flecken bildete.

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Beispiel 2

2,36 kg in vorstehend beschriebener Weise hergestellte rohe Chenodesoxycholsäure, die einer Vorreinigung durch Extraktion mit Wasser und Trocknen unterv/orfen worden war, wurden in 95 1 Methanol unter Rühren gelöst. Ein Anteil (etwa 8 1)'der Lösung wurde entfernt und in diesem Anteil wurden 450 g Calciumchlorid-dihydrat (Reinheitsgrad für analytische Reagenzien) unter mechanischem Rühren gelöst und die Lösung wurde dann in den Hauptanteil zurückgeführt. Konzentrierte Ammoniaklösung (Dichte 0.880, 285 ml) wurde in einem Anteil zu der gerührten Lösung gegeben. Big kristallisation des Calciumsalzes begann innerhalb 1 Minute und innerhalb von 15 Minuten hatte sich das ,Gemisch zu einer pastösen Masse verfestigt. Unmittelbar vor der Kristallisation hatte das Reaktionsgemisch gemäß der Bestimmung mit angefeuchtetem Indikatorpapier einen pH-Wert von 10, jedoch nach 15 Minuten war dieser pH-Wert auf etwa pH 6 gefallen.

Nachdem das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen worden war, wurde das Calciumsalz durch Vakuumfiltration entfernt und der Filterkuchen wuide mit 5 1 Methanol gewaschen. Bas Produkt wurde über Nacht bei 105° C in einem Heißluft-Trockenschrank getrocknet, v/obei das Calciumsalz (1,78 kg, 75,3 $ des Rohmaterials) als grobes weißes Pulver erhalten wurde.

Zum Regenerieren der gereinigten Säure wurde das Salz unter Rühren während 1 Stunde in einem Gemisch aus verdünnter Chlorwasserst off säure (2n, 24 1) und Äthylacetat (20 1.) gelöst. Nach der Trennung der Phasen wurde die wässrige Schicht mit Äthylacetat (5 l) rückextrahiert und dann verworfen. Bie kombinierten organischen Phasen wurden nacheinander mit Wasser (1 mal 7 1), Salzlösung (2 mal 5 1) und Wasser (2 mal 5 1) gewaschen. Bie abschließende Wäsche zeigte eine Reaktion von pH 5. Bie Äthylacetatlösung wurde in eine Bestillationsapparatur überge-

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führt und mit frischem lösungsmittel (5 1) gewaschen, wobei ein Gesamtvolumen von etwa 25 1 erhalten wurde, aus dem das Wasser azeotrop unter Anwendung des Dean-Stark-Prinzips entfernt wurde. Während 6-stündiger !Destillation wurde eine Gesamtmenge von 1,5 1 sit Äthylacetat gesättigten Wassers entfernt.

Petroläther (Ep 80 bis 100° C) wurde langsam zu einem gerührten Anteil (100 ml) der getrockneten Lösimg gegeben. Nach der Zugabe von 75 ml wurde eine permanente leichte. Trübung erhalten und innerhalb von 1 bis 2 Minuten schied sich ein Anteil an Chenodesoxycholsäure (CDGA) in ihrer charakteristischen Form eines strukturierten Gels ab. Die Ausfällung verstärkte sich bei weiterer Zugabe von Petroläther; es wurden insgesamt 200 ml zugesetzt, ohne daß die Form der ausgefällten Säure verändert wurde.

Der Hauptteil der getrockneten Lösung wurde durch leichtes Eindampfen unter Vakuum auf etwa 30° C gekühlt und danach in ein 100 1-Gefäß übergeführt und mit Äthylacetat (5 1) gewaschen, wobei ein Gesamtvolumen von etwa 24 1 erreicht wurde. Zu dieser gerührten lösung wurde Petroläther zugesetzt, bis eine leichte Trübung erhalten wurde« Das zur Orientierung erzeugte Fällungsgemisch wurde da.nn in den Hauptanteil zurückgeführt und das Rühren ohne weitere Zugabe fortgesetzt, bis die Ausfällung der Säure begann (5 bis 10 Minuten). Die Zugabe von Petroläther wurde dann unter Rühren fortgesetzt, bis eine Gesamtmenge von 48 1 zugesetzt war. Das Gemisch wurde weitere 1,5 Stunden gerührt und der Feststoff dann durch Vakuumfiltration entfernt. Nach dem Waschen mit einem Äthylaeetat-Petroläther-Gemisch (T :2; 3 1) wurde der feuchte Filterkuchen, der eine große Menge an Lösungsmittel enthielt, in emaillierte Schalen übergeführt und bei 50° C während 90 Stunden im Trockenschrank getrocknet.

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Die Analyse durch Gas-Flüssigphasenehromatographie (GLC) in dieser Stufe zeigte, daß das Produkt (zu diesem Zeitpunkt ein klumpiges weißes Pulver) 0,8 $ Äthylacetat und 3 % Petroläther enthielt. Das Produkt wurde erneut bei 65° C im Vakuum während 24 Stunden getrocknet, wonach die Analyse durch Gas-Flüssigphasenchromatographie (GLC-Analyse) weniger als 0,1 % Ä'thylacetat und 0,6 $ Petroläther zeigte. Das Trocknen wurde unter diesen Bedingungen weitere 48 Stunden durchgeführt, wonach der Petroläthergehalt weniger als 0,1 % "betrug und kein Äthylacetat mehr feststellbar war.

Wie vorstehend angegeben, können auch Strcntiumsalze verwendet werden, insbesondere Strontiumnitrat und Strontiumchlorid.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren unter Verwendung von Strontiumsalzen ist grundsätzlich das gleiche wie bei Verwendung von Calciumsalzen. Bei Vervendung von Strontiumsalzen neigt jedoch das als Produkt erhaltene Chenodesoxycholsäuresalz dazu, stärker makroskopisch kristallin zu sein, als "bei Verwendung von Calciumsalzen, während die Ausbeute des Säuresalzes (berechnet auf Basis der Wolff-Kishner-Prüdukte) bei Strontiumsalzen einige 10 $ geringer ist als bei Calciumsalzen. Typische Ausbeuten für die letztgenannten Salze liegen in der Größenordnung von 78 bis 88 Gew.-?£, während die Ausbeuten der aus dem Calciumsalz regenerierten, getrockneten Säure gewöhnlich zwischen 85 und 88 Gew.-^ betragen.

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Claims (1)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Reinigung von roher Chenodesoxyeholsäure, dadurch gekennzeichnet , daß ein Gemisch aus Methanol, der rohen Säure, einer Base und einem Calcium- oder Strontiumsalz hergestellt, das kristalline Calcium- oder Strontiumsalz der Chenodesoxycholsäure ausgefällt wird, das Salz abgetrennt w'rd, das abgetrennte Salz mit einem sauren Reagenz behandelt und die gereinigte Chenodesoxycholsäure abgetrennt v/'rd.

2. Verf alrr en nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Calcium- oder Strontiumsalz Calciumchlorid, Strontiumnitrat oder Strontiumchlorid verwendet wird.

3. Verfall! en nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Base gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder eine stickstoffhaltige Base verwendet wird, die in wässriger Lösung einen pK -Wert von mindestens 6,6

et

auf v/ei st.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß eine methanolische Lösung des

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Calcium- oder Strontiumsalzes mit einer methanolischen Lösung der rohen Säure kombiniert und die Base danach zu den kombinierten Lösungen zugesetzt wird. .

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch g e ■ kennzeichnet , daß das Calcium- oder Strontiumsalz direkt in einer Lösung der rohen Säure in Methanol gelöst wird, bevor die Ease zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Base ein Alkalimetallhydroxid verwendet wird und dieses in stöchiometrisch äquivalenter Menge zu der rohen Säure in methanolischer Lösung zugesetzt wird, wonach die Zugabe des Calcium- oder Strontiumsalzes erfolgt.

7- Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch g e kennzeichnet , daß als stickstoffhaltige Base Methylamin, Äthylamin, sec.-Butylarain_r Tri-n-butylamin, Biäthylamin, Triäthylamin, A'thanolamin, Hexamethylentetramin, 1,2-Diaroinoäthan, Cyclohexylamin-tetramethyl-ammoniumhydroxid, Hydrazinhydrat, Piperidin, Piperazin, Pyrrolidin, BenzylaiEin oder Morpholin verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeieh net, daß die rohe Chenodesoxycholsäure, Calciumchlorid und

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35 bis 40 ml Methanol pro Gramm dex* rohen Säure kombiniert und durch Zugabe von Ammoniumhydroxid alkalinisiert v/erden, das kristalline Calciumsalz der Säure abgetrennt und angesäuert wird und die gereinigte Säure extrahiert und gewonnen wird.

9- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rohe Chenodesoxycholsäure, wasserfreies Strontiuimiitrat oder Strontiumchlorid-hexahydrat als Strontiumsalz und 10 bis 20 ml Methanol pro Gramm der rohen Säure kombiniert und mit wasserfreiem gasförmigem Ammoniak oder mit Ammoniumhydroxid alkalinisiert v/erden, das kristalline Strontiumsalz der Säure abgetrennt und angesäuert wird und die gereinigte Säure extrahiert und gewonnen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die rohe Chenodesoxycholsäure, wasserfreies Strontiumnitrat oder StrontiumchloTid-hexahydrat und 5 bis 10 ml Methanol pro Gramm der rohen Säure kombiniert werden und mit wasserfreiem gasförmigem Ammoniak oder einer anderen wasserfreien stickstoffhaltigen Base alkalinisiert werden, das kristalline Strontiumsais der Säure abgetrennt und angesäuert wird und die gereinigte Säure extrahiert und gewonnen wird.

11. Verfahren zur Herstellung von gereinigter Chenodesoxycholsäure, dadurch gekennzeichnet , daß Cholsäure der

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Veresterung unterworfen wird, der erhaltene Cholsäureester acetyliert wird, der acetylierte Ester unter Bildung des 12.-Ketoderivats oxidiert wird, das Keton unter Bedingungen, die zur Bildung des entsprechenden Hydrazons führen, der Reduktion unterworfen wird, das Hydrazon in situ der Stickstoff-Eliminierung und Hydrolyse unterworfen wird, die so gebildete rohe Chenodesoxycholsaure abgetrennt und die rohe- Saure mit Methanol und einem Calcium- oder Strontiumsalz vermischt wird, das in dem Gemisch löslich ist, da° das Gemisch mit einer Base, die gasförmiges Ammoniak, Ammoniumhydroxid oder eine stickstoffhaltige Base ist, alkalinisiert wird, das so gebildete kristalline Salz abgetrennt wird, das Salz mit einem sauren Reagenz unter Freisetzen der Chenodesoxycholsaure behandelt wird und die gereinigte Säure gewonnen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von gasförmigem Ammoniak, Ammoüiumhydroxid oder einer stickstoffhaltigen Base ein Alkalimetallhydroxid verwendet wird und in 3töchiometrisch äquivalenter Menge zu der rohen Säure in methanolischer Lösung gegeben wird, wonach das Calcium- oder.S ti-ont rumsalz zugesetzt wird, um das kristalline Salz der Säure auszufällen.

1-3. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet , daß der Ester durch Umsetzung in Acetonitril bei 50 C während 2 Stunden acetyliert wird.

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14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 "bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß das Keton kathodisch reduziert wird.

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