DE2249647A1 - Indikator zur bestimmung von harnstoff - Google Patents

Indikator zur bestimmung von harnstoff

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    • Y10T436/171538—Urea or blood urea nitrogen

Description

Die Erfindung betrifft einen Indikator zum Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, insbesondere in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma und Urin. Die HarnstoffbeStimmung ist vor allem zur Diagnose einer Mereninsuffizienz von großer Bedeutung. Dabei wird ein Indikator angestrebt, der es auch ungeschultern Personal erlaubt, selbst bei Verwendung von unvorbehandelteio Vollblut eine sichere und schnelle Harnstoffbestlimnung durchzuführen.
Neben den genauen photometrischen Tests gibt es bereits Indikatoren, mit denen Harnstoff halbquantitativ ohne apparativen Aufwand bestimmt werden kann. Der Nachweis beruht auf der enzymatisch katalysierten Hydrolyse des Harnstoffs mittels Urease zu im wesentlichen. Ammoniak und Kohlendioxid. Das dabei enbstehende Ammoniakgas wird mit Hilfe eines pH-Indikatorsystems bestimmt.
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Der in Z. med. Labortechnik j>, 319 (1964) beschriebene Indikator besteht aus einem Filterpapierstreifen, der getrennt von einander zwei Zonen aufweist, eine Urease und Phosphatpuffer enthaltende Reaktionozoiie und eine pH-Indikatorsone. Dieser Indikator hat jedoch den entscheidenden Nachteil, daß er selbst bei Aufbewahrung in einer dunklen Flasche und ira Exsiccator nur einen Monat haltbar ist. Durch die fortschreitende Zersetzung ist es erforderlich, den Teststreifen vor jeder Harnstoffbestimmung neu au eichen, urn einigermaßen zuverlässige Analysenwerte zu erhalten. Hinzu koiaint, daß das auf der Reaktionszone vorliegende Phosphatpuffer-Ureasegeiaiach nur einen pH-Wert von etwa 7,5 aufweist; in diesem pH-Bereich ist der Dampfdruck des bei der Harnstoff bestimmung fre.1 werdenden AiBEspniaks jedoch noch zu gering, um einwandfreie halbquantitative Bestimmungen zu gewährleisten. Die geringe und nicht mit ausreichender Geschwindigkeit erfolgende Ammoniakentwicklung äußert sich in einer geringen Färbintensitat und Zonenschärfe auf der Indikatorzone und der damit verbundenen schlechten Ablesbarkeit des
Ein weiterer im DBP 1 245 619 beschriebener Iridikafcorstreifen weist auf einem »augfähigcn Träger drei Reaktionssysteme auf. Dieser Indikator hat jodoch eine Reihe von Nachteilen. Die Bestinimtng kann nur mit Serum, nicht jedoch mit Blut durchgeführt werden. Das setzt ein Zentrifugieren des Blutes zur Soruragewinnung voraus, d. h. die benötigte Probenmenge ist viel größer als z. B. auo einen .Lanzettstich zu gewinnen ist. Neben dem zusätzlichen Arbeitsaufwand wie Pipettierung des Serums und Fixierung des Indikatorstreifens im Reagenzglas kommt als weiterer Kachteil
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hinzu, daß das UntersuchungDergebnis erst nach etwa einer halten Stunde vorliegt, da das im ersten Reaktionssystem gebildete und in Lösung vorliegende Ammoniak chromatographisch in das zweite Reaktionssystem wandern muß, wo das Gas quantitativ freigesetzt wird. Der Indikatorstreifen benötigt größere Mengen an Serum und verlangt mindestens eine Pipettierung, so daß man nicht mehr von einem einfachen Test sprechen kann. PUr seine Punktion ist ein Transport zwischen zwei Zonen erforderlich. Dafür ist Vollblut kaum geeignet, weil die Erythrocyten die Poren verstopfen und eine Chromatographie nur sehr langsam vonstatten geht.
Alle bisher bekannten Indikatorstreifen zur Bestimmung you Harnstoff weisen demnach wesentliche Mangel auf. Es bestellt: daher für das klinische Labor ein echtes Bedürfnis nach einem Indikatorstreifen, der ohne Pipettierung die Verwendung von möglichst wenig Vollblut gestattet und dennoch eine möglichst genaue und schnelle Ablesung des Harnstoffgehaltes garantiert. Ein derartiger Indikatorstreifen wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Indikator zürn Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flussigkeite.u:. bestehend aus einem Urease enthaltenden Reaktionssintern und einem Indikatorsystem auf einem Träger, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Realctionssystem zusätzlich Alkalicarbonat und/oder -hydroxid und gegebenenfalls eine oder mehrere organische Säuren enthält und einen pH-Bereich von höher als 8 bis zu etwa 10 aufweist.
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Besonders hervorzuheben ist die Stabilität der Urease im Indikator nach der vorliegenden Erfindung. Daß Aktivitätsoptimum der Urease liegt bekanntlich in einem pH-Bereich von 7-8. Die Haltbarkeit der Urease ist pH-abhängig und auf einem saugfähigen Träger, v/ie z. B. Papier, liegt das Maximum der Haltbarkeit bei einem pH-Wert von etwa 7. Bis zu einem pH-Wert von 8 ist die Haltbarkeit bei Verwendung eines in ausreichender Konzentration vorliegenden Puffers noch gut, doch ist in diesem pH-Bereich der Dampfdruck des freizusetzenden Ammoniaks noch zu gering, um einwandfreie halbquantitative Bestimmungen zu gewährleisten. Bei höheren pH-Werten ist die Haltbarkeit der Urease unzureichend; so ist z. B. bei einem pH-Wert von 8,7 bei den meisten Puffern weder ausreichende Haltbarkeit der Urease noch ausreichender Dampfdruck des Ammoniaks gegeben. Überraschenderweise wurde gefunden, daß in Gegenwart von Alkalicarbonat und/oder -hydroxid und gegebenenfalls einer oder mehrerer organischer. Säuren eine Dampf druckerhöhung den Aoviaoniaks resultiert, die das Arbeiten in einem pH-Bereich von hoher als 8 bis /λι etwa 10 ermöglicht, wobei die Aktivität der Urease nicht beeinträchtigt wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Indikator ist es möglich, einen exakten Harnstoffschnelltest zur Verfügung zu stellen, bei dem sämtliche Bestandteile des Reaktionstjysteffis in einer einzigen, vom Indikatorsystem getrennten Zone vorliegen. Dieser Test zeichnet sich dadurch aus, daß bereits mit eirifin Tröpfchen unvorbehandeltem Vollblut eine sehr genaue imd reproduzierbare Harnstoffbestimmung durchgeführt werden kann. Die Bestandteile des Reaktionssystems des erfindungsgemäßen Indikators, nämlich Urease, Alkalicarbonat und/oder -hydroxid, gegebenenfalls organische Säuren und Stabilisierungsmittel, sind so gewählt,· daß die Urease bei Auf-
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Bewahrung, des Indikatorstreifens "bei etwa 0 - 4 C eine Haltbarkeit von über einem Jahr erreicht und andererseits. der Dampfdruck des "bei der enzyraatischen Hydrolyse des Harnstoffs entstehenden Ammoniaks oo hoch ist, daß das Gas in ausreichender Geschwindigkeit aus der Reaktionszeit;-; freigemacht wird. " -
Anstelle von Urease kann grundsätzlich jedes Enzym benutzt werden, das in der Lage ist, Harnstoff zu hydrolysieren.' Urease ist jedoch wegen ihrer Spezifität bevorzugt. Insbesondere eignet sich eine Urease mit einer Aktivität von ^5 U/mg für den· Indikator nach der vorliegenden Erfindung.
Zur Erhöhung des Ammoniakdampfdrucks in einem relativ niedrigen pH-Bereich von ca. 8 - 10, in dem normalerweise Ammoniak nicht in ausreichender Geschwindigkeit ausgetrieben werden kann, dienen die erfindungsgemäßen Alkalicarbonate und/oder -hydroxide gegebenenfalls zusammen mit organischen Säuren. - .
Als Alkalicarbonate bzw. -hydroxide eignen sich Kalium-, und vor allem Rubidium- und Cäsiumearbonat und/oder Rubidium- und Cäsiümhydroxid, insbesondere Cäsiumearbonat.
Bei den im Indikator der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls enthaltenen organischen Säuren handelt es sich vor allem um substituierte Benzoesäure!!., wobei die Substituenten gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff, Carboxy, Hydroxy, Nitro, Halogen und/oder die Sulfonsäure.-gruppe bedeuten. Ferner eignen sich Pyridincarbonsäuren und Pyridinsulfonsäuren sowie auch Chloressigsäure, Oxydiessigsäure, Methantrisulfonsäure, \Ärainomethansulfonsäure, Oxalsäure oder 4,6-Dichlorresorcin.. Bevorzugte Säuren sind
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ζ. B. Phthalsäure, iso-Phthalsäuro, Benzol-1,2,3,5~tebracarbonsäure, Mellithsäure, Salicylsäure, 5-ChlorsaÜcylsäure, 5-Nitrosalicylsäure, 5-Sulfosalicylsäure, 2-Nitrcbenzoesäure, 3-Nitrobenzoesäure und Pyridln-2,4-d!carbonsäure. Als besonders geeignet erwiesen sich Phthalsäure, iso-Phthalsäure, Salicylsäure, 5-Sulfosalicylsäure, 5-Nitrosalicylsäure und Mellithsäure.
Das Reaktionssystein kann als zusätzliche Stabilisierungsmittel noch SH-gruppenhaltige organische Substanzen v/ie z. B. 1,4-Dithioerythrit, Cystein, Glutathion, Thioglykolsäure usw. enthalten, insbesondere 1,4-Dithioerythrit.
Der Nachweis der aus dem Reaktionssystem freigemachten Ammoniakmenge erfolgt in an sich bekannter Weine mit Hilfe eines Indikatorsystems, das eine oder mehrere Säuren bzw. saure Salze bzw. saure Puffergemische sowie einen oder mehrere Säure-Base-Indikatoren enthält, di« in Gegenwart von Ammoniak einen Farbumschlag anzeigen. Als Säuren bzw. saure Salze bzw. Puffergemische eignen sich z. B. Weinsäure, Oxalsäure, Citronensäure, Phthalsäure, Amidosulfonsaure, Natriumhydrogensulfat, Kaliumhydrogensulfat, Eisenammoniuinsulfat, Kupfersulfat, Hydroxylammoniumsalze, Weinsäure/ Alkalicarbonat, Oxalsäure/Alkalioxalat, Oxalsäure/Alkalitartrat usw. .,,
Als Säure-Base-Indikatoren können prinzipiell die üblichen organischen pH-Indikatoren benutzt werden, die im pH-Bereich zwischen 7 und 1 umschlagen. Für die Empfindlichkeit und Zonenschärfe des Indikatorstreifens ist es jedoch vorteilhafter, einen Indikator zu wählen, der im pH-Bereich von
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6,8 TdIs 3,0 umschlägt. Geeignete Indikatoren'sind z. B. : Bromkresolgrün, Brorophenolrot, Bromkresolpurpur, Bromphenolblau, Kongorot, Methylorange, Ithylorange, fluorescein, Resazurin, Methylrot, Äthylrot, Propylrot, Chlorphenolrot, o-Nitrophenol, Lackmus. - . - . . '·■·
Statt eines der üblichen organischen pH-Indikatoren kann auch eine andere pH-abhängige Reaktion verwendet "werden, ■wie z. B. die Entfärbung des Eisenrhodanidkomplexes im "basischen Bereich. Als "besonders geeignete pH-Indikatoren erwiesen sich Bromkresolgrün, Bromphenolrot, Bromkresolpurpur und Eisenrhodanid.
Als saugfähige Träger für den Indikator nach der Erfindung können alle verwendet werden, die üblicherweise für solche Schnelltests im Gebrauch sind. Am weitesten verbreitet ist die Verwendung von Filterpapier, jedoch können auch andere saugfähige Cellulose- oder Kunststoffprodukte eingesetzt werden. Die Baugfahigen Träger, vorzugsweise Filterpapier, werden in an sich bekannter Weise mit Tränklösungen imprägniert, die die zur Bestimmung des Harnstoffs notwendigen Reagenzien enthalten. Die getränkten und getrockneten Papiere können zu quadratischen bzw. rechteckigen Zonen verarbeitet werden, die ihrerseits in bekannter Weise auf Kunststofffolien, Papier- oder Metallstreifen aufgeklebt bzw. aufgesiegelt werden können.
Die saugfähigen Träger für das Reaktions- und das Indikatorsystem können auch vor dem Imprägnieren in Streifenform auf ein Kunststoffband aufgebracht und nach dem Imprägnieren senkrecht zur Streifenrichtung in handliche Stäbchen geschnitten werden.
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Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Indikatorstreifens geht man zweckmäßigerweise wie folgt vor: Auf eine Kunststoffolie von z. B. 7 - 8 cm Breite werden zwei Streifen saugfähigen Materials, vorzugsweise Filterpapier, aufgebracht. Der erste Streifen, der zur Aufnahme des Reaktionssystems vorgesehen ist, ist 2 - 20 mm, vorzugsweise etwa 6 rom breit und schließt mit der unteren Kante der Kunststofffolie ab. Der zweite Streifen wird mit seiner unteren Kante in einem Abstand von 1 - 20 mm, vorzugsweise etwa 3 - 7 mm, zur oberen Kante des ersten Streifens aufgebracht. Dieser Streifen ist 2 - 50 mm, vorzugsweise etwa 15-30 Ein breit und ist zur Aufnahme der Reagenzien für das Indikatorsystem vorgesehen. Nach dem Imprägnieren und Schneiden erhält man auf diese Weise Nachweisstäbchen von etwa 7 - 8 cm Länge und etwa 5 - 7 mm Breite.
Zur Herstellung des Reaktionssystems enthält die Tränklösung für den saugfähigen Träger in einem Liter destilliertem Wasser zweckmäßigerweise z. B. die folgenden.Bestandteile:
10-10Og Urease, vorzugsweise 30-5Og wasserlösliche Urease mit einer Aktivität von ^ 5 U/mg,
5 - 500 mMol Alkalicarbonat und/oder -hydroxid, vorzugsweise 20 - 100 mMol Rubidium- oder Cäsiumcarbonat,
0 - 500 mMol einer oder mehrerer organischer Säuren, vorzugsweise 20 - 70 mMol und
0,1 - 1,0 g einer SH-gruppenhaltigen organischen Substanz,^ vorzugsweise 0,3 - 0,6 g 1,4-Dithioerythrit.
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Die Mengen an Urease, Alkalicarbonat bzw. -hydroxid und gegebenenfalls organischer Säure müssen so aufeinander abgestimmt sein, daß nach dem Auftragen der Imprägnierlösung auf das Papier und Trocknen, bei erneutem Befeuchten mit Wasser eine Lösung vom pH-Wert 8 - 10, vorzugsweise 8,5 9,5 resultiert. .
Die Konzentration der sauren Bestandteile im Indikatorsystern muß auf die Menge des im Reaktionssystem entwickelten Ammoniaks abgestimmt werden. Ist der mögliche Konzentrationsbereich des Harnstoffs in der Untersuchungsflüssigkeit sehr groß, wie es z. B. im Blut und Serum der Fall sein kann, so ist es unter Umständen zweckmäßig, zwei Indikatorzonen mit unterschiedlicher Konzentration an sauren Bestandteilen zu verwenden. Die verschiedenen Indikatorsysteme werden durch Imprägnieren in entsprechenden Lösungen hergestellt. Vorzugsweise wird das Indikatorsystera auf eine einzige Zone aufgebracht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der saugfähige Träger für das Indikatorsystem vor dem Aufsiegeln bzw. Aufkleben mit einer Millimetereinteilung bedruckt. ■♦
Das Indikatorsystem erhält man durch Tränken des saugfähigen Trägers mit einer wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Lösung,
/Z.x>.
die in einem Liter'folgende Bestandteile gelöst enthält:
0,01 - 200 g eines oder mehrerer saurer Salze, vorzugsweise 3 - 7 g und/oder
0,02 - 2 g einer oder mehrerer Säuren, vorzugsweise 0,2 - 0,8 g und ,
0,1 - 3 g' eines oder mehrerer pH-Indikatoren, vorzugsweise 1 - 1,5 g.
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Zur Durchführung des Tests wird der eaugfähige Träger des Reaktionosystems etwa 5-10 Sekunden in die Untersuchungsflüssigkeit getaucht oder mit einea Tropfen Blut an der Pingerbeere oder am Ohrläppchen direkt in Kontakt gebracht. Dabei darf das darüber angeordnete Indikatorsystem nicht befeuchtet werden. Überschüssige Untersuchungsflüssigkeit wird mit einem Spatel oder einem Kartenblatt abgestreift. Um Luftbewegungen zwischen dem Reaktionssysteis und dem Indikatorsystem zu verhindern, wird das Indikatorstäbchen in ein spezielles Gefäß überführt. Dieses Gefäß ist so konstruiert, daß die Überführung den am Reaktionssystern befeuchteten Indikatorstäbchens ohnu Beeinträchtigung des Indikatorsystems möglich ist. Das wtihrend der Bestimmung entwickelte Ammoniakgas bewirkt einen Farbumschlag des Indikatorsystems von dessen unterem Rand her. Die Strecke des entstandenen Farbumschlags kann auf der Millimetereinteilung des Indikatorsystemo direkt abgelesen werden und ist proportional dem in der Probeflüssigkeit vorhandenen Harnstoff. Die Ablesung erfolgt nach 5» 10, 15, 20 oder 30 Hinuten. Anhand einer Tabelle oder einer graphischen Darstellung wird der zu der abgelesenen Steighöhe und der gewählten Reaktionszeit gehörige Harnstoffv/ert abgelesen.
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Die Steighöhe korreliert insbesondere bei längerer Reaktionsdauer auch bei Harnstoffwerten im Mormalbereich mit dem nach der photometrischen Methode gefundenen Harnstoffgehalt.
Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung ' „; der Erfindung. '
Beispiel 1 ■
Herstellung des Reaktionssystems ■
Filterpapier (Nr, 601, 14500V, 2668 oder VS 320 der Firma Schleicher und Schüll) wird mit einer Lösung getränkt, die
in 1 1 Wasser ·
40,0 g Urease (entsprechend 2 » 10 U/1), 16,3 g Cäsiumcarbonat,
3,4 - 9,8 g einer der in Tabelle Γ angeführten organischen
Säuren und 0,4 g 1,4-Dithioerythrit
gelöst enthält und anschließend getrocknet. Das so erhaltene imprägnierte Filterpapier wird in kleine Quadrate von etwa 6 χ 6 mm geschnitten und auf Kunststoffstreifen von etwa 6 χ 75 mm am unteren Ende aufgebracht. Der pH-Wert des feuchten Reaktionssystems liegt im Bereich von 8,9 - 9,2.
Herstellung des Indikatorsystems Filterpapier (Nr. 597 L, 2992, 2040 oder 2668 der Firma
Schleicher und Schüll) wird- in einer 5 $igen alkoholischen
Lösung getränkt, die pro Liter 5,6 g Natriumhydrogentartrat,
0,56 g Weinsäure und ' -
1,1g Bromkresolgrün
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gelöst enthält und anschließend getrocknet. Das so erhaltene imprägnierte Filterpapier wird in Rechtecke Ton etwa 6 χ 25 hub geschnitten und etwa 4 mm oberhalb des ob even Randes dee Reaktionssystems auf den Kunststoffstreifen aufgebracht.
Bringt man einen Tropfen Serum mit einem Gehalt von 80 mg Harnstoff/100 ml Probeflüssigkeit auf das Reaktionssystern des Indikatorstreifens auf und überführt den Streifen in das dem Testsatz beigegebene Gefäß, so können nach 30 Hinuten, je nach der verwendeten organischen Säure, die in Tabelle I angegebenen Steighöhen auf dera Indikatorsystea abgelesen werden.
Tabelle I
Nr. Säure Menge
(g/l iränk-
lösung)		 ■Steighöhe
(pa)
1 Chloressigoäure 4,5 0,0
2 Oxydicsoigoäurc 3,4 8,5 V
3 Methantriaulfon-
säuro		 5, R 8,0
4 Aminoracthanüulfon-
Bäure		 6,0 8,5
VJ! Oxalsäure 3,5 8,5
6 Phthalsäure 4,9 7,5
7 5-Chlorsalicylsäuro β,5 , 8*5
8 2~Kitrobcnzoesäure 9,8 7,5
9 5-Witroüalicyl3äure 7,5 8,0
10
11
12		 4,6-Dichlor-
rosorcin
Fyridin-2,A-
dicixrhoxvj'axxr e
ß iil foil :j;iure		 7,5
4,9
9,3		 8,5
7,0
B1O
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Die Auswertung erfolgt entweder anhand einer Tabelle oder einer graphischen Darstellung, in der je nach Steighöhe und Reaktionszeit der zugehörige Harnstoffwert abgelesen werden kann. Hält man die Reaktionszeit konstant, so kann durch geeignete Konzentration der Bestandteile im Reaktionssystera erreicht wenden, daß die Steighöhe in mra multipliziert mit 10 direkt den.Harnstoff gehalt in mg/100 ml angibt, wie aus der obigen Tabe'llchervorgeht. ■
Beispiel 2
Filterpapier (Nr. 2668 der Firma Schleicher und Schüll) wird zur Herstellung des Reaktionssystems mit einer Lösung analog Beispiel 1 getränkt, die jedoch anstelle von Cäsiumcarbonat 7,5 g Cäsiumhydroxid oder 5,1 g Rubiäiumhydroxid und 1,4 2,4 g einer der in Tabelle' II angeführten organischen Säuren enthält. Das Indikatorsystem ist das gleiche wie in Beispiel
Ein so hergestelltes Indikatorstäbchen zeigt nach Aufbringen der Probeflüssigkeit und nach einer'Reaktionszeit von 30 Minuten, je nach der verwendeten Säure auf dem Indikatorsystom die in Tabelle II angegebenen Steighöhen.
Tabelle II
Nr. Säure Menge . Steighöhe
(g/l Tränk- mm
lösung)
13 3-Nitrobenzoesäure 2,4 5,5
14 2-Nitrobenzoesäure 2,4 5,5
15 5-Nitrosalicylsäure . 2,4 8,0
16 5-Chlorsalicylsäure 2,3 6,5
17 Benzöl-1,2,3,5-tetra-
carbonsäure 1,4 5,0
18 4,6-Dichlorresörcin •2,4 6,5
19 Pyridin-3-sulfonsäure 2,3 5,0
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Auch mit diesem Indikatorßtäbchen lassen sich einwandfrei halbquantitative Harnstoffbestimmungen im Bereich von 20.bis 200 mg Harnstoff/100 ml Probefliissigkeit durchführen.
Beispiel 3
Analog Beispiel 1 wird ein Indikatorstäbchen hergestellt. Das Indikatorsystem besteht jedoch aus einem saugfähigen Träger, der durch Imprägnieren eines Filterpapiers (Nr. 597 J* der Firma Schleicher und Schiill) in einer wäßrigen Lösung hergestellt wird, die pro Liter
0,01g Hydroxylammoniumchlorid und 1 g Bromphenolrot
enthält. Dieser Indikatorstreifen ist besonders geeignet zur Bestimmung niedriger Harnstoffkonzentrationen bio herab zu 0,5 mg/100 ml.
Ähnliche Ergebnisse werden mit Indikatorsystemen erzielt, die z. B. durch Imprägnieren mit folgenden Tränklö'oungen hergestellt wurden:
a) 5 g Hydroxylammoniumoxalat, 1 g Weinsäure und
1,1 g Bromkresolgrün in 1 1 5 tigern wäßrigem Äthanol
b) 100 g Eisen(lII)-amiuoniumsulfat und
1 g Bromkresolgrün in 1 1 5 tigern wäßrigem Äthanol
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c) 340 g Kaliumrhodanid und
15 g Eisen(lII)-aiDmonIuiDsulfat in 1 1 Wasser.
Be i spiel 4
Ein Indikatorstäbchen wird -wie in Beispiel 1 be schrieben hergestellt. Beim Eintauchen des Reaktionssystems dieser Indikatorstäbehen in eine Reihe von Seren und Vollblut steigender Harnstoffkonzentration (24 - 57 mg Harnstoff/100 ml) ergeben sich bei verschiedenen Reaktionszeiten die in Tabelle III angegebenen Steighöhen auf deia Indikätorsystern
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Tabelle III
Steighöhe bzw. Länge (mm) der umgeschlagenen Indikatorzone in Abhängigkeit vom Harnstoffgehalt
in der Probe bei verschiedenen Reaktionszeiten
Probe
' Nr.		 photometrisch er-
nittelter Harnstoff
gehalt (mg/100 ml)r 		30 Min. 1 Ser
20 Min.		 um
15 Min.		 10 Min. 5 Min. Vollblut
30 Min.		 5 Min. 1 -
1 24 1,5 Rand - - — Rand - «*; -
2 25 1,5 1 Rand — — 0,5-1,0 - -
3 26 2 1 Rand - — 0,5-1,0 - -
4 27 1,5 j 1 Rand — — 1 - Rand
-- 5 28 2 1 Rand - — Rand —
to b 29 2 1,5 1 — — 1,5 —
CO J 33 3 1 1 - — 1
r 8 36 2,5-3,0 2 1,5 Rand — 1
ο 9 37 2,5-3,0 2 1 • Rand - 1,5
40 3,5-4,0 2 1,5 Rand - 2
43 4-4,5 2,5 2 1 — 2,5
12 44 5 3 2 1,5 Rand 2
13 53 5,5 3 2,5 2 0,5 3
14 57 4 •3 2 1,0 4
Bei der Untersuchung von'Vollblut zeigt.die einzige Probe (Nr. 14), die die Obergrenze des normalen Harnstoffwertes gerade überschreitet nach 5 Minuten eine leichte Verfärbung des unteren Randes des Indikatorsysteras, während die Proben mit normalen Harnstoffgehalten keinen Umschlag zeigen. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten lassen sich bereits 24 mg-# Harnstoff deutlich nachweisen; die Länge des umgeschlagenen Indikatorsystems (Steighöhe) korreliert sehr gut mit den photometrisch ermittelten Harnstoffgehalten. Die Gegenüberstellung der Untersuchungsergebnisse an Vollblut und Serum zeigt auch, daß die Analysenwerte, die- mit Vollblut nach 30 Minuten erhalten werden, bei Serum bereits nach 15-20 Minuten vorliegen.
Die Auswertung erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben.
Beispiel 5 ' ,.
Analog Beispiel 1 wird ein Indikatorstäbchen hergestellt. Das Reaktionssystem besteht aus einera saugfähigen Träger, der durch Imprägnieren eines Filterpapiers (1450 CV der Firma Schleicher & Schüll) in einer wäßrigen Lösung hergestellt wird, die pro Liter folgende Bestandteile enthält:
100,0 g Urease
16,3 g Cäsiumcarbonat
2,2 g Phthalsäure und
0,4-g 1,4-Dithioerythrit.
409817/0942
22Λ9647
Ähnliche Ergebnisse werden mit Reaktionssysteraen erzielt, die durch Imprägnieren mit folgenden Tränklösungeii hergestellt wurden:
a) 10,0 g Urease
11,6 g RubidiuiDcarbonat
6,4 g Phthalsäure
0,4 g 1,4-Dithioerythrit
b) 10,0 g Urease
1,63g Cäsiumcarbonat
0,1 g Glutathion
c) 40,0 g Urease
116,0 g Rubidiumcarbonat
75,Og Phthalsäure
0,4 g Thioglykolsäure
d) 40,0 g Urease
1,63 g CäsiuiDcarbonat
0,4 g Cystein.
409817/0942

Claims (4)

  1. Patentansprüche
    .Jlndikator zum Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten,bestehend aus einem Urease enthaltenden Reaktion s sy s tem und einem 'Indikator sy st em auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionssystem zusätzlich Alkalicarbonat und/oder -hydroxid und gegebenenfalls eine oder mehrere organische Säuren enthält und einen pH-Bereich von höher als 8 bis zu· etwa 10 aufweist.
  2. 2. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalicarbonat und/oder -hydroxid Cäsium- und/oder Rubidiumcarbonat bzw. -hydroxid ist.
  3. 3. Indikator nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Säuren substituierte Benzoesäuren sind.
  4. 4. Indikator nach den Ansprüchen 1- 35 dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Säuren Phthalsäure, isc-Phthalsäure, Salicylsäure, 5-Sulfosalicylsäure,.'5-Nitrosalicylsäure und/oder Mellithsäure sind. . ■ -
    4098 17/09 42
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