DE2249647C3

DE2249647C3 - Indikator zur Bestimmung von Harnstoff

Info

Publication number: DE2249647C3
Application number: DE19722249647
Authority: DE
Inventors: Friedrich Dipl.-Chem. Dr. 6110 Dieburg; Helger Roland Dipl.-Chem. Dr. 6100 Darmstadt Kraffczyk
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Filing date: 1972-10-11
Publication date: 1976-05-20

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf einen Indikator zum Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, bestehend aus einem Träger mit einer Urease enthaltenden Reaktionszone und einer davon getrennten Indikatorzone. Die Harnstoff bestimmung in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma und Urin ist vor allem zur Diagnose einer Niereninsuffizienz von großer Bedeutung. Dabei wird ein Indikator angeitrebt, der es auch ungeschultem Personal erlaubt, ■elbst bei Verwendung von unvorbehandeltem Vollblut eine sichere und schnelle Harnstoffbestimmung durchzuführen.

Neben den genauen photometrischen Tests gibt es Indikatoren, mit denen Harnstoff halbquantitativ ohne apparativen Aufwand bestimmt werden kann. Der Nachweis beruht auf der enzymatisch katalylierten Hydrolyse des Harnstoffs mittels Urease zu im weserrtlichen Ammoniak und Kohlendioxid. Das dabei entstehende Ammoniakgas wird mit Hilfe eines pH-Indikatorsystems bestimmt.

Der in Z. med. Labortechnik 5, 319 (1964) beschriebene Indikator besteht aus einem Filterpapierstreifen, der getrennt voneinander zwei Zonen aufweist, eine Urease und Phosphatpuffer enthaltende Reaktionszone und eine pH-Indikatorzone. Dieser Indikator hat jedoch den entscheidenden Nachteil, daß er selbst bei Aufbewahrung in einer dunklen Flasche und im Exsiccator nur einen Monat haltbar ist. Durch die fortschreitende Zersetzung ist es erforderlich, den Teslstreifen vor jeder Harnstoffbestimmung neu zu eichen, um einigermaßen zuverlässige Analysenwerte zu erhallen. Hinzu kommt, daß das auf der Reaktionszone vorliegende Phosphatpuffer-Ureasegemisch nur einen pH-Wert von etwa 7,5 aufweist; in diesem pH-Bereich ist der Dampfdruck des bei der Harnstoffbestimmung frei werdenden Ammoniaks jedoch noch zu gering, um einwandfreie halbquantitative Bestimmungen zu gewährleisten. Die geringe und nicht mit ausreichender Geschwindigkeit erfolgende Ammoniakentwicklung äußert sich in einer geringen Farbintensität und Zonenschärfe auf der Indikatorzone und der damit verbundenen schlechten Ablesbarkeit des Testergebnisses.

Ein weiterer im DBP 12 45 619 beschriebener Indikatorstreifen weist auf einem saugfähigen Träger drei Reaktionssysteme auf. Dieser Indikator hat jedoch eine Reihe von Nachteilen. Die Bestimmung kann nur mit Serum, nicht jedoch mit Blut durchgeführt werden. Das setzt ein Zentrifugieren des Blutes zur Serumgewinnung voraus, d. h. die benötigte Probenmenge ist viel größer als z. B. aus einem Lanzettstich zu gewinnen ist. Neben dem zusätzlichen Arbeitsaufwand wie Pipeitierung des Serums und Fixierung des Indikatorstreifens im Reagenzglas kommt als weiterer Nachteil hinzu, daß das Untersuchungsergebnis erst nach etwa einer halben Stunde vorliegt, da das im ersten Reaktionssystem gebildete und in Lösung vorliegende Ammoniak chromatographisch in das zweite Reaktionssystem wandern muU, wo das Gas quantitativ freigesetzt wird. Der Indikatorstreifen benötigt größere Mengen an Serum und verlangt mindestens eine Pipettierung, so daß man nicht mehr von einem einfachen Test sprechen kann. Für seine Funktion ist ein Transport zwischen zwei Zonen erforderlich. Dafür ist Vollblut Kaum geeignet, weil die Erythrocyten die Poren verstopfen und eine Chromatographie nur sehr langsam vonstatten geht.

Alle bisher bekannten Indikatorstreifen zur Bestimmung von Harnstoff weisen demnach wesentliche Mängel auf. Es besteht daher die Aulgabe, für das klinische Labor einen Indikatorstreifen zu schaffen, der ohne Pipettierung die Verwendung von möglichst wenig Vollblut gestattet und dennoch eine möglichst genaue und schnelle Ablesung des Harnstoffgehaltes garantiert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei einem Indikator der eingangs genannten Art die Reaktionszone Alkalicarbonat und/oder -hydroxid enthält und einen pH-Bereich von höher all» 8 bis zu etwa 10 aufweist.

Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Indikators sind in den Patentansprüchen 2 bis 5 beschrieben.

Besonders hervorzuheben ist die Stabilität der Urease im Indikator nach der vorliegenden Erfindung. Das Aktivitätsoptimum der Urease liegt bekanntlich in einem pH-Bereich von 7 bis 8. Die Haltbarkeil der Urease ist pH-abhängig und auf einem saugfähigen Träger, wie z. B. Papier, liegt das Maximum der Haltbarkeit bei einem pH-Wert von etwa 7. Bis zu einem pH-Wert von 8 ist die Haltbarkeit bei Verwendung eines in ausreichender Konzentration vorliegenden Puffers noch gut, doch ist in diesem pH-Bereich der Dampfdruck, des freizusetzenden Ammoniaks noch zu gering, um einwandfreie halbquantitative Bestimmungen zu gewährleisten. Bei höheren pH-Werten ist die Haltbarkeit der Urease

■nzureichend; so ist z. B. bei einem pH-Wen von 17 bei den meisten Puffern weder ausreichende Haklarkcit der Urease noch ausreichender Dampfdruck des Ammoniaks gegeben. Überraschenderweise wurde gefunden, daß in Gegenwart von Alkalicarbonat jnd/oder -hydroxid und gegebenenfalls einer oder iiehrerer organischer Säuren eine Dampfdruckerfcöhung des Ammoniaks resultiert, die das Arbeiten ρ einem pH-Bereich von höher als 8 bis zu etwa 10 ermöglicht, wobei die Aktivität der Urease nicht lieeinträchtigt wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Indikator ist es mögich, einen exakten Harnstoffschnelltest zur Verfügung zu stellen, bei dem sämtliche Bestandteile des Reaktionssystems in einer einzigen, vom Indikatorsystem getrennten Zone vorliegen. Dieser Test zeichnet jich dadurch aus, daß bereits mit einem Tröpfchen envorbehandeltem Vollblut eine sehr genaue und reproduzierbare Harnstoffbestimmung durchgeführt werden kann. Die Bestandteile des Reaktionssystems des erfindungsgemäßen Indikators, nämlich Urease, Alkalicarbonat und/oder -hydroxid, gegebenenfalls organische Säuren und Stabilisierungsmittel, sind so gewählt, daß die Urease bei Aufbewahrung des Indikatorstreifens bei etwa 0 bis 4^CC eine Haltbarkeit von über einem Jahr erreicht und andererseits der Dampfdruck des bei der enzymatischen Hydrolyse des Harnstoffs entstehenden Ammoniaks so hoch ist, daß das Gas in ausreichender Geschwindigkeit aus der Reaktionszone freigemacht wird.

Die Erhöhung des Ammoniakdampfdrucks in einem relativ niedrigen pH-Bereich von etwa 8 bis 10. in dem normalerweise Ammoniak nicht in ausreichender Geschwindigkeit ausgetrieben werden kann, wird durch den Zusatz des Alkalicarbonats und oder -hydroxids gegebenenfalls zusammen mit organischen Säuren erreicht.

Als Alkalicarbonate bzw. -hydroxide eignen sich Kalium-, und vor allem Rubidium- und Cäsiumcarbonat und/oder Rubidium- und Cäsiumhydroxid, insbesondere Cäsiumcarbonat.

Bei den im Indikator der vorliegenden Erfindung in weiterer Ausbildung enthaltenen organischen Säuren handelt es sich bevorzugt um substituierte Benzoesäuren, wobei die Substituenten gleich oder verschieden sein können, und Wasserstoff, Carboxy, Hydroxy, Nitro, Halogen und/oder die Sulfonsäurcgruppe bedeuten. Ferner eignen sich Pyridincarbonsäuren und Pyridinsulfonsäuren sowie auch Chloressigsäure, Oxydiessigsäure, Methantrisulfonsäure, Aminomethansulfonsäure, Oxalsäure oder 4,6-Dichlorresorcin. Bevorzugte Säuren sind z. B. Phthalsäure, Iso-Phthalsäure, Benzol-l^^^-tetracarbonsäure, Mellithsäure, Salicylsäure, 5-Chlorsalicylsäure, 5-Nitrosalicylsäure, 5-Suifosalicylsäure, 2-Nitrobenzoesäure, 3-Nitrobenzoesäure und Pyridin-2,4-dicarbonsäure. Als besonders geeignet erwiesen sich Phthalsäure, Iso-Phthalsäure, Salicylsäure, 5-Sulfosalicylsäure, 5-Nitrosalicylsäure und Mellithsäure.

Die Reaktionszone kann als zusätzliche Stabilisierungsmittel noch SH-gruppenhaltige organische Substanzen wie z. B. 1,4-Dithiocrythrit. Cystein. Glutathion, Thioglykolsäure usw. enthalten, insbesondere 1,4-Dithioerythrit.

Der Nachweis der in der Reaktionszone frcigemachten Ammoniakmenge erfolgt in an sich bekannter Weise in einer Indikatorzone, die eine oder mehrere Säuren bzw. saure Salze bzw. saure Puffergemische sowie einen oder mehrere Säure-Base-lndikatoren enthält, die in Gegenwart \on Ammoniak einen Farbumschlag anzeigen. Als Säuren bzw. saure Salze bzw. Puffergemische eignen sich z. B. Weinsäure, Oxalsäure, Citronensäure, Phthalsäure, Amidosulfonsäure, Natriumhydrogensulfat, Kaliumhydrogensulfat, Eisenammoniumsulfat, Kupfersulfat, Hydroxylammoniumsalze, Weinsäure/Alkalicarbonat, Oxalsäure,^!Alkalioxalat, Oxalsäure/Alkalitartrat usw.

Als Säure-Base-lndikatoren können prizipiell die üblichen organischen pH-Indikatoren benutzt werden, die im pH-Bereich zwischen 7 und 1 umschlagen. Für die Empfindlichkeit und Zonenschärfe des Indikatorstreifens ist es jedoch vorteilhafter, einen Indikator zu wählen, der im pH-Bereich von 6,8 bis 3,0 umschlägt. Geeignete Indikatoren sind z. B.: Bromkresolgrün, Bromphenolrot, Bromkresolpurpur, Bromphenolblau, Kongorot, Methylorange, Äthylorange, Fluorescein, Resazurin, Meihylrot, Äthylrot, Propyirot, Chlorphenolrot, o-Nitrophenol, Lackmus.

Statt eines der üblichen organischen pH-Indikators kann auch eine andere pH-abhängige Reaktion verwendfcl werden, wie z. B. die Entfärbung des Eisenrhodanidkomplexes im basischen Bereich. Als besonders geeignete pH-Indikatoren erwiesen sich Bromkresolgrün, Bromphenolrot, Bromkresolpurpur und Eisenrhodaiiid.

Als Träger für den Indikator nach der Erfindung können alle verwendet werden, die üblicherweise für solche Schnelltests im Gebrauch sind. Am weitesten verbreitet ist die Verwendung von Filterpapier, jedoch können auch andere saugfähige Cellulose- oder Kunststoffprodukte eingesetzt werden. Die saugfähigen Träger, vorzugsweise Filterpapier, werden in an sich bekannter Weise mit Tränklösungen imprägniert, die die zur Bestimmung des Harnstoffs notwendigen Reagenzien enthalten. Die getränkten und getrockneten Papiere können zu quadratischen bzw. rechteckigen Zonen verarbeitet werden, die ihrerseits in bekannter Weise auf Kunststoffolien, Papier- oder Metallstreifen aufgeklebt bzw. aufgesiegelt werden können.

Die Träger für das Reaktions- und das Indikatorsystem können auch vor dem Imprägnieren in Streifenform auf ein Kunststoffband aufgebracht und nach dem Imprägnieren senkrecht zur Streifenrichtung in handliche Stäbchen geschnitten werden.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Ausführungsbeispiele erläutert, wobei zunächst die Herstellung eines Indikators zum Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff näher beschrieben wird. Dabei geht man zweckmäßigerweise wie folgt vor: Auf eine Kunststoffolie von z. B. 7 bis 8 cm Breite werden zwei Streifen saugfähigen Materials, vorzugsweise Filterpapier, aufgebracht. Der erste Streifen, der zur Aufnahme des Reaktionssystems vorgesehen ist, ist 2 bis 20 mm, vorzugsweise etwa 6 mm breit und schließt mit der unleren Kante der Kunststofffolie ab. Der zweite Streifen wird mit seiner unteren Kante in einem Abstand von 1 bis 20 mm, vorzugsweise etwa 3 bis 7 mm, zur oberen Kante des ersten Streifens aufgebracht. Dieser Streifen ist 2 bis 50 mm, vorzugsweise etwa 15 bis 30 mm breit und ist zur Aufnahme der Reagenzien für das Indikatorsystem vorgesehen. Nach dem Imprägnieren und Schneiden erhält man auf diese Weise Nachweisstäbchen von etwa 7 bis 8 cm Länge und etwa 5 bis 7 mm Breite.

Zur Herstellung der Reaktionszone enthält die Tränklösung für den saugfähigen Träger in einem

Liter destilliertem Wasser zweckmäßigerweise ζ. B. katorzone möglich »st. Das _

j· r ι j r> i J₄ -ι entwickelte AmmoniaKgas oewinu einen r-arbum- s~ -m,

die folgenden Bestandteile: *nt*ic ^ _{Indikatorsystem}s der Indikatorzone von

^ _y

d^pren unterem Rand her. Die Strecke des ent-

10 bis 100 g Urease, vorzugsweise 30 bis 50 g 5 sundenen Farbumschlags kann auf der Millimeter-

wasserlösliche Urease mit einer einteilung der Indikatorzone direkt abgeesen werden

Aktivität von > 5 U/me und ist proportional dem in der Probeflussigkeit vor-

Aktivität von > 5-U/mg. _handenen Harnstoff. Die Ablesung erfolgt nach 5. 10,

5 bis 50OmMoI Alkalicarbonat und/oder -iiydro- ^ jq oder 30 Minuten. An Hand einer Tabelle oder

xid, vorzugsweise 20 bis 100 mMol ^ ^_ej, g_raphi_schen Darstellung wird der zu der ab-

Rubidium- oder Cäsiumcarbonat, _gei_esenen Steighöhe und der gewählten Reaktionszeit

0 bis 500 mMol einer oder mehrerer organischer gehörige Harnstoffwert abgelesen.

Säuren, vorzugsweise 20 bis Die Steighöhe korreliert insbesondere bei längerer

70 mMol und Reaktionsdauer auch bei Harnstoffwerten im Normal-

_n1 .· , _n ■ _OII .η· ο Ii bereich mit dem nach der photometrischen Methode

0,1 bis 1,0 g einer SH-gruppenhaltigen orga- ¹S ucicu.»

4f

0,3 bis 0,6 g 1,+ Dithioerythnt. _Erläuteru*_{g der Erfin}dung beschrieben.

Die Mengen an Urease, Alkalicarbonat bzw. 20 B e i s ρ i e 1 1
-hydroxid und gegebenenfalls organischer Säure

müssen so aufeinander abgestimmt sein, daß nach Herstellung der Reaktionszone
dem Auftragen der Imprägnierlösung auf das Papier

und Trocknen, bei erneutem Befeuchten mit Wasser Filterpapier (Nr. 601, 1450 CV 2668 oder VS j20

eine Lösung vom pH-Wert 8 bis 10, vorzugsweise *5 der Firma Schleicher und Schull) wird mit einer

8,5 bis 9,5 resultiert. Lösung getränkt, die in 1 1 Wasser

Die Konzentration der sauren Bestandteile in der
Indikatorzone muß auf die Menge des in der Reaktionszone entwickelten Ammoniaks abgestimmt wer- 40,0 g Urease (entsprechend 2-10 b I).
den. Ist der mögliche Konzentrationsbereich des 3° 16 3 g Cäsiumcarbonat,
Harnstoffs in der Untersuchungsflüssigkeit sehr groß, ',·„„ · j -τ-uni 1-1
wie es z. B. im Blut und Serum der Fall sein kann, so 3,4 b.s 9,8 g einer der in Tabelle I angeführten ist es unter Umständen zweckmäßig, die Indikator- organischen Sauren und
zone mit zwei Bereichen mit unterschiedlicher Konzen- 0,4 g 1,4-Dithioerythrit
tration an sauren Bestandteilen auszubilden. 35

Die Indikatorzone erhält man durch Imprägnieren

des saugfähigen Trägers mit einer wäßrigen oder gelöst enthält und anschließend getrocknet. Das so

wäßrig-alkoholischen Lösung, die in einem Liter erhaltene imprägnierte Filterpapier wird in kleine

z.B. folgende Bestandteile gelöst enthält: Quadrate von etwa 6 χ 6 mm geschnitten und auf

40 Kunststoffstreifen von etwa 6 χ 75 mm am unteren Ende aufgebracht. Der pH-Wert des feuchten Reak-

0.01 bis 200 g eines oder mehrerer saurer Salze, tionssystems liegt im Bereich von 8,9 bis 9,2.
vorzugsweise 3 bis 7 g und/oder

0,02 bis 2 g einer oder mehrerer Sf uren, Vorzugs- Herstellung der Indikatorzone

weise 0,2 bis 0,8 g und ⁴⁵ _{Filterpapicr (Nn 597 L}, ₂992, 2040 oder 2668 der

0,1 bis 3 g eines oder mehrerer pH-Indikatoren, Firma Schleicher und Schüll) wird in einer 5"„igen

vorzugsweise 1 bis 1,5 g. alkoholischen Lösung getränkt, die pro Liter

., ■ ..„. . . , ..... _ .. ⁵° 5,6g Natriumhydrogentartrat,

Zweckmaßigerweise kann der saugfahige Trager

im Bereich der Indikatorzone vor dem Aufsiegeln °'⁵⁶ S Weinsäure und

bzw. Aufkleben mit einer Millimetereinstellung be- ij g Bromkresolgrün
druckt werden.

Zur Durchführung des Tests wird der saugfähige 55

Träger im Bereich der Reaktionszone etwa 5 bis gelöst enthält und anschließend getrocknet. Das so 10 Sekunden in die Untersuchungsflüssigkeit getaucht erhaltene imprägnierte Filterpapier wird in Rechtecke oder mit einem Tropfen Blut an der Fingerbeere oder von etwa 6 >: 25 mm geschnitten und etwa 4 mm am Ohrläppchen direkt in Kontakt gebracht. Dabei oberhalb des oberen Randes der Reaktionszone auf darf die darüber angeordnete Indikaiurzonc nicht 60 den Kunststoffstreifen aufgebracht,
befeuchtet werden. Überschüssige Untersuchungs- Bringt man einen Tropfen Scrum mit einem Gehalt flüssigkeit wird mit einem Spatel oder einem Karten- von 80 mg Harnstoff/100 ml Probeflüssigkeit auf die blatt abgestreift. Um Luftbewegungen zwischen der Reaktionszone des Indikatorstreifens auf und über-Reaktionszone und der Indikatorzone zu verhindern. führt den Streifen in das dem Testsatz beigegebene wird das Indikatorstäbchen in ein spezielles Gefäß 65 Gefäß, so können nach 30 Minuten, je nach der verüberführt. Dieses Gefäß ist so konstruiert, daß die wendeten organischen Säure, die in Tabelle 1 an-Üherführung des in der Reaktionszonc befeuchteten gegebenen Steighöhen auf der Indikatorzone abge-Indikalorstäbchcns ohne Beeinträchtigung der Indi- lesen werden.

Tabelle I

Säure

Menge (g/l
Tränklösung)

Steighöhe mm

Auch mit diesem Indikatorstäbchen lassen sich einwandfrei halbquantitative HarnstofTbestimmungen im Bereich von 20 bis 200 mg Harnstoff/100 ml Probefiüssigkeit durchführen.

1	Chloressigsäure	4,5	8,0
2	Oxydiessigsäure	3,4	8,5
3	Methantrisulfonsäure	5,8	8,0
4	Aminomethansulfon-	6,0	8,5
	säure
5	Oxalsäure	3,5	8,5
6	Phthalsäure	4,9	7,5
■7	S-Chlorsalicylsäure	8,5	8.5
8	2-Nitrobenzoesäure	9,8	7,5
9	5-Nitrosalicylsäure	7,5	8,0
10	4,6-Dichlorresorcin	7,5	8,5
11	Pyridin-2,4-dicarbon-	4,9	7,0
	säure
12	Pyridin-3-sulfonsäure	9,3	8,0

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Beispiel 3

Analog Beispiel 1 wird ein Indikatorstäbchen hergestellt. Die Indikatorzone besteht jedoch aus einem saugfähigen Träger, der durch Imprägnieren eines Filterpapiers (Nr. 597 L der Firma Schleicher und Schüll) in einer wäßrigen Lösung hergestellt wird, die pro Liter

0,01 g Hydroxylammoniumchlorid und
1 g Bromphenolrot

ao enthält. Dieser Indikatorstreifen ist besonders geeignet zur Bestimmung niedriger Harnstoffkonzentrationen bis herab zu 0,5 mg/100 ml.

Ähnliche Ergebnisse werden mit Tndikatorzonen erzielt, die ζ B. durch Imprägnieren mit folgenden Tränklösungen hergestellt wurden:

Die Auswertung erfolgt entweder an Hand einer Tabelle oder einer graphischen Darstellung, in der je nach Steighöhe und Reaktionszeit der zugehörige Harnstoffwert abgelesen werden kann. Hält man die Reaktionszeit konstant, so kann durch geeignete Konzentration der Bestandteile in der Reaktionszone erreicht werden, daß die Steighöhe in Millimeter multipliziert mit 10 direkt den Harnstoffgehalt in mg/100 ml angibt, wie aus der obigen Tabelle hervorgeht.

Beispiel 2

Filterpapier (Nr. 2668 der Firma Schleicher und Schüll) wird zur Herstellung der Reaktionszone mit einer Lösung analog Beispiel 1 getränkt, die jedoch an Stelle von Cäsiumcarbonat 7.5 g Cäsiumhydroxid oder 5,1 g Rubidiumhydroxid und 1,4 bis 2,4 g einer der iii Tabelle II angeführten organischen Säuren enthält. Die Indikatorzone ist die gleiche wie im Beispiel 1.

Ein so hergestelltes Indikatorstäbchen zeigt nach Aufbringen der Probeflüssigkeit und nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten, je nach der für die Indikatorzone verwendeten Säure die in Tabelle II angegebenen Steighöhen.

Tabelle II	Säure	Menge (g/l	Steighöhe
Nr.		Tränklösung)	(mm)
	3-Nitrobenzoesäure	2,4	5,5
13	2-Nitrobenzoesäure	2,4	5,5
14	5-Nitrosalicylsäure	2,4	8,0
15	5-Chlorsalicylsäure	2,3	6,5
16	Benzol-l,2,3,5-tetra-	1,4	5,0
17	carbonsäure
	4,6-Dichlorresorcin	2,4	6,5
18	Pyridin-3-sulfonsäure	2,3	5,0
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a) 5 g Hydroxylammoniumoxalat,
1 g Weinsäure und

1,1 g Bromkresolgrün
in 11 5%igem Äthanol;

b) 100 g EiiSen(IlI)-ammoniumsulfat und
1 g Bromkresolgrün

in II 5%igem wäßrigem Äthanol;

c) 340 g K aliumrhodanid und

15 g Ei;;en(III)-ammoniumsulfat
in 1 1 Wasser.

Beispiel 4

Ein Indikatorstäbchen wird wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Beim Eintauchen der Reaktionszone dieser Indikatorstäbchen in eine Reihe von Seren und Vollblut steigender Harnstoffkonzentration (24 bis 57 mg Harnstoff/100 ml) ergeben sich bei verschiedenen Reaktionszeiten die in Tabelle III angegebenen Steighöhen in der Indikatorzone.

Bei der Untersuchung von Vollblut zeigt die einzige Probe (Nr 14), die die Obergrenze des normalen Harnstoffwertes gerade überschreitet, nach 5 Minuten eine leichte Verfärbung des unteren Randes der Indikatorzone, während die Proben mit normalen Harnstoffgehalten keinen Umschlag zeigen. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten lassen sich bereits 24mg-% Harnstoff deutlich nachweisen; die Länge des umgeschlagenen Indikatorsystems in der Indikatorzone (Steighöhe) korreliert sehr gut mit den photometrisch ermittelten Harnstoffgehalten. Die Gegenüberstellung der Untersuchungsergebnisse an Vollblut und Serum zeigt auch, daß die Anatysenwerte, die mit Vollblut nach 30 Minuten erhalten werden, bei Serum bereits nach 15 bis 20 Minuten vorliegen.

Die Aus Wertung erfolgt wie im Beispiel 1 angegeben.

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Tabelle III

Steighöhe bzw. Länge (mm) der umgeschlagenen Indikatorzorie in Abhängigkeit vom Harnstoffgehalt in der

Probe bei verschiedenen Reaktionszeiten

Probe	Photometrisch	Be i s ρ	Serum	20 Min.	15 Min.	erzielt.,	10 Min.	5 Min.	Vollblut
Nr.	ermittelter		Rand
	Hamstoffgehalt		1	Rand		—	—
	(mg/100 ml)	30 Min.	1	Rand		—		30 Min. 5 Min.
1	24	1	1	Rand			Rand —
2	25	1,5	1	Rand	—		0,5 bis 1,0 —
3	26	1,5	1,5	1			0,5 bis 1,0 —
4	27	2	1	1		.	1 —
5	28	1,5	2	1,5	Rand		Rand —
6	29	2	2	1	Rand		1,5 —
7	33	2	2	1,5	Rand		1 —
S	36	3	2,5	2	1		■^
9	37	2,5 bis 3,0	3	2	1,5	Rand	1,5 —
10	40	2,5 bis 3,0	3	2,5	2	0,5	2 —
11	43	3,5 bis 4,0	4	3	2	1,0	2,5 —
12	44	4 bis 4,5		die durch	Imprägnieren	2
13	53	5			3 —
14	57	5,5			4 Rand
	iel 5			mit folgenden Tränk

Analog Beispiel 1 wird ein Indikatorstäbchen hergestellt. Die Rixtktionszone besteht aus einem saugfähigen Träger, der durch Imprägnieren eines Filterpapiers (14!OCV der Firma Schleicher und Schüll) in einer wäßrigen Lösung hergestellt wird, die pro Liter folgend Bestandteile enthält:

100,0 g Urease,
16,3 g Cäsiumcarhoijat,
2,2 g Phthalsäure und
0,4 g 1,4-Dithioerythrit.

Ähnliche Ergebnisse werden mit Reaktionszonen

lösungen hergestellt wurden:

a) 10,0 g Urease,

11,6 g Rubidiumcarbonat, 6,4 g Phthalsäure, 0,4 g 1,4-Dithioerythrit;

b) 10,0 g Urease,

1,63 g Cäsiumcarbonat, 0,1 g Glutathion;

c) 40,0 g Urease,

116.Og Rubidiumcarbonat, 75,0 g Phthalsäure, 0,4g Thioglykolsäure;

d) 40',Og Urease,

1,63 g Cäsiumcarbonat, 0,4 g Cystein.

Claims

Patentansprüche:

1. Indikator zum Nachweis und zur Bestimmung von Harnstoff in Flüssigkeiten, bestehend aus einem Träger mit einer Urease enthaltenden Reaktionszone und einer davon getrennten Indikatorzone, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone Alkalicarbonat und/oder -hydroxid ίο enthält und einen pH-Bereich von höher als 8 bis zu etwa 10 aufweist.

2. Indikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalicarbonat und/oder -hydroxid Cäsium- und/oder Rubidiumcarbonat bzw. -hydroxid ist.

3. Indikator nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone zusätzlich eine oder mehrere organische Säuren enthält.

4. Indikator nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Säuren substituierte Benzoesäuren sind.

5. Indikator nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die organischen Säuren Phthalsäure, lso-Phthalsäure, Salicylsäure, 5-Sulfosalicylsäure, 5-Nitrosalicylsäure und/oder Mellithsäure sind.