DE2225039C3 - Verfahren zur Umwandlung von Digitoxigeninglycosiden zu Digoxin bzw. Gitoxin in Digitalis durch gezielte Fermentation - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung von Digitoxigeninglycosiden in Digoxin bzw. Gitoxin durch gezielte Fermentation unter Ausnutzung des nativen oder extrahierten Fermentsystems der Droge.

Bei der Herstellung von Herzglycosiden aus Digitalis spezies werden wegen der therapeutischen Bedeutung bevorzugt Lanatosid C sowie das daraus resultierende Secundärglycosid Digoxin isoliert. Daneben treten in den Digitalis lanata-Pflanzen noch Glycoside der A- und B-Reihe auf, welche gleichfalls in der Digitalis purpurea vorkommen, für die jedoch nach wie vor nur begrenzte Verwendungsmöglichkeiten bestehen. Es ist deshalb das Ziel mehrerer Arbeitenden Anfall an Digoxigeninglycosiden zu erhöhen. Da?u wurden in der Literatur bisher drei verschiedene Wege beschrieben.

Den Gehalt an Digoxigeninglycosiden kann man z. B. durch gezielte Züchtung erhöhen, wobei meistens der Anteil der A-Glycoside zurückgedrängt wird.

N ο ζ a k i u. Mitarb. (Nozaki, Z., M. Mayama, K. A k a k i e. a., Agric. biol. Chem. Tokyo, 29, 783 (1965) ist es gelungen, nachdem eine Anzahl 'von Arbeiten erschienen waren, in denen lediglich die Umwandlung von Digitoxin in Digoxigenin beschrieben und gelungen war, Digitoxin mit einer Ausbeute von 29% in Digoxin durch Einwirkung eines besonderen Streptomyces-Stammes, umzuwandeln.

Eine dritte Möglichkeit zur Erhöhung des Gehaltes an Digoxigeninglycosiden besteht in der Behandlung der geernteten Pflanzen auf bestimmte Art und Weise. So haben z. B. P i t r a u. Mitarb, durch Anwelken der geernteten Frischpflanzen eine Erhöhung des Lanatosid C-Gehalt'es im getrockneten Material gefunden (CSSR-Patent Nr. 123570; Pitra, L, M. Kucera u. F. Stary, Tschech. Patent Nr. 1 23 570, vom 8.8.1963 (15.7.1967)).

P i t r a u. Mitarb. (Pitra L₁1. Sterba, P. Horak u. V. Prochazka, Pharmazie, 26, 779 (1971) beschrieben einen weiteren Weg zur Steigerung des Gehaltes an Lanatosid C durch Lagerung von isolierten, frischen Digitalis lanata-Blättern über einen Zeirraum von 7 Tagen bei 25° und 100% relativer Luftfeuchte in einem »gut belüfteten Raum«, woran sie eine Konservierung dieses Materials bei 4O⁰C anschließen. Bei Temperaturen von 15°C soll der Glycosidgehalt nur sehr langsam zunehmen, während 30° ungeeignet sein sollen. Durch Fermentation des bei 40° getrockneten Materials über eine Zeit von 2 Tagen bei 38° wird das Lanatosid C zu Digoxin abgebaut.

Während in einem belüfteten Raum unter den angegebenen Bedingungen ein Aufbau von Lanatosid C stattfinden soll, wurde in einem »engen unbelüfteten Raum« ein rascher Abbau von Lanatosid C zu Digoxin, ohne nähere Angaben, ermittelt. Als mögliche Ursache dafür wird O₂-Mangel diskutiert. Für den Aufbau von Lanatosid C machen die genannten Autoren das Vorhandensein der grundlegenden Lebensbedingungen der Pflanzenzelle, wie Wassergehalt und Atmung zur Voraussetzung.

Die Nachteile, speziell des zuletzt genannten Verfahrens, liegen darin, daß der Aufbau von Lanatosid C nur mit isolierten Blättern und nicht mit der ganzen Pflanze durchgeführt werden kann und zur Herstellung einer digoxinhaltigen Droge 9 Tage benötigt werden. Außerdem sind die äußeren Bedingungen nicht ganz einfach technisch zu realisieren. Eine technisch-ökonomische Nutzung des Verfahrens dürfte deshalb auf Schwierigkeiten stoßen. Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zu finden, welches das bei der Isolierung von Lanatosid C oder Digoxin anfallende Lanatosid A bzw. Digitoxin, welches nur teilweise einer therapeutischen Verwendung zugeführt werden kann, in Glycoside mit größerer therapeutischer Anwendungsbreite umzuwandeln bzw. diesen Umwandlungsprozeß durch erzielte Fermentation der Frischpflanze zu erreichen.

Entgegen den Ergebnissen von Pitra u. Mitarb, wurde nun überraschenderweise gefunden, daß in luftdicht verschlossenen Behältern, die man günstigerweise noch mit N2 oder CO2 füllt, in frischen, zerkleinerten Digitalispflanzen bei 20—45°C innerhalb mindestens von 60 Stunden neben einem vollständigen Abbau des nativ vorhandenen Lanatosid C noch ein großer Teil der Digitoxigeninglycoside durch enzymatische Hydroxylierung in Digoxin und z. T. auch in Gitoxin urngcwandeii werden. Damit wird gleichzeitig bewiesen, daß für eine Synthese von Digoxigeninglycosiden nicht, wie Pitra u. Mitarb, fordern, die grundlegenden Lebensbedingungen der Pflanzenzelle notwendig sind, sondern sogar bis zu einem gewissen Grade gestört sein können.

Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht darin, daß in einem Arbeitsgang in wesentlich kürzerer Zeit und unter unkomplizierten Bedingungen eine postmortale Biosynthese von Digoxin und auch Gitoxin aus Digitoxigeninglycosiden mit einem Abbau des nativen Lanatosid C zu Digoxin bzw. des Lanatosid B zu Gitoxin gekoppelt wird, was bei Digoxin zu einem gegenüber der Frischpflanze erhöhten Gehalt an

Digoxigeninäquivalenten in Abhängigkeit vom Gehalt an Digitoxigeninglycosiden, in dem so fermentierten Pflanzenmaterial gegenüber dem nichtfermentiertcn Ausgangsmaterial führt In Verbindung mit einer anschließenden Hochtemperaturkonservierung (DDR-Patent Nr. 50 730) wird eine wesentlich ökonomischere Herstellung von Digoxin ermöglicht

Es wurde des weiteren gefunden, daß sich Digitoxingeninglycoside mittels über Sephadex (WZ) gereinigter Pflanzenextrakte aus Frischpflanzen, lyophilisierttm (Fischer, F. H. Bärisch, H.-J. Schmidt, Pharmazie 26, 769 — 770) oder bei 35° getrockneten Pflanzen in Digoxin und Gitoxm umwandeln lassen.

Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher beschrieben ohne sie jedoch einzu- is schränken.

Beispiel 1

51 frisch geerntete Digitalisblätter (Gehalt der getrockneten Blätter: 0,30% Digitoxigeninglycoside und 0,30% Digoxigeninglycoside berechnet als Digoxin) werden in etwa 1 cm große Teile zerrissen und in ein luftdicht verschließbares Silo etwa 1 —2 m hoch eingestampft. Danach begast man mit CO₂ oder N₂ und beläßt das Material etwa 4 Tage im Silo. Die Temperatur der zerrissenen Blätter soll in dieser Zeit etwa 20—30°C betragen. Anschließend wird das Material hochtemperaturgetrocknet (Gehalt des getrockneten Materials: 0,51% Digoxin und Acetyldigoxin sowie 0,09% Digitoxin und Acetyldigitoxin, berechnet ,als Digoxin). Das Digoxin wird aus der hochtemperaturgetrockneten Droge nach bekanntem Verfahren isoliert. Die Ausbeute beträgt 2,5 kg Digoxin.

B e i s ρ i e 1 2

20 g frische Pflanzen oder Blätter werden mit 15 g Seesand und 12 ml Pufferlösung vom pH 7,0 bei 10" C sehr fein zerkleinert und anschließend die entstehende Suspension bei der gleichen Temperatur zentrifugiert Der dabei anfallende Extrakt wird nach KJärung über eine mit Sephadex G 25 (WZ) gefüllte Säule bei 10⁰C filtriert. Die erste dabei anfallende gelbgefärbte Fraktion, welche keine Glycoside und keine Aminosäuren enthält, wird mit einem Digitoxigeninglycosid, vorzugsweise Desacetyllanatosid A zur Reaktion gebracht Hierzu werden 10 mg Desacetyllanatosid A mit 2 ml der beschriebenen Fraktion im geschlossenen Gefäß 24 Stunden bei 30—35° C intensiv gerührt Danach erfolgt die Isolierung des entstandenen Glycosidgemisches durch dreimalige Extraktion der Reaktionslösung mit je 2,0 ml Chloroform-Methanolgemisch = 3:2 Volumenteile. Die organische Phase wird anschließend z. B. mittels präparativer Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel G-Schichten im Fließmittel Methylenchlorid : Methanol: Wasser = 90 :10 :1 (Volumenteile) getrennt und die entstandenen Glycoside : Digitoxin, Digoxin und Gitoxin isoliert Es fallen hierbei bis zu 2 mg Digitoxin, bis zu ! mg Digoxin sowie 0,5 mg Gitoxin an.

Beispiel 3

Frisch geerntete Digitalis-Blätter werden unter Zusatz von aqua dest. bzw. Pufferlösung zu einem dicken Brei verarbeitet 10 kg Frischpflanzenbrei (das entspricht etwa 1 kg Trockenmasse) setzt man wahlweise 5 g Lanatosid A, Desacetyllanatosid A, Digitoxin oder Acetyldigitoxin zu und inkubiert 4 Tage bei 20—30⁰C unter ständigem Rühren und N₂- oder CO₂-Begasung in einem geschlossenen Gefäß. Nach dieser Zeit sind 70—80% der zugesetzten Digitoxigeninglycoside zu Digoxin und Acetyldigoxin transformiert worden. ·

Unter gleichen Bedingungen ist es möglich, die bei der Lanatosid C-Produktion anfallenden Lanatosid Α-Konzentrate zu Digoxigeninglycosiden zu transformieren.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Umwandlung von Digitoxigeninglycosiden zu Digoxin und Gitoxin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Digitoxigeninglycoside enthaltendes Ausguigsmaterial bei Temperaturen von +20⁰C bis +45° C über einen Zeitraum von mindestens 60 Stunden unter Luftabschluß und/oder bei Fremdbegasung mit N2 oder CO₂ der Wirkung des digitaiisdrogeneigenen Fermentsystems ausgesetzt wird und das umgewandelte Material mittels an sich bekannter Verfahren zu Reinglycosiden aufgearbeitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial frisch geerntete, zerkleinerte Digitalispflanzen Verwendung finden, die bei einer Temperatur von +20 bis +45⁰C über einen Zeitraum von mindestens 60 Stunden unter Luftabschluß und/oder bei Fremdbegasung mit N2 oder CO2 fermentiert werden und daß anschließend gegebenenfalls durch eine Hochtemperaturtrocknung nach DDR-WP Nr. 50 730 eine Konservierung erfolgt worauf die Isolierung der Reinglycoside auf an sich bekannte Weise durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Pflanzenextrake aus frischen, lyophilisierten oder bei 35° C getrockneten Digitalispflanzen über ein vernetztes Dextrangel gereinigt und anschließend bei einer Temperatur von +30 bis + 35° C 24 Stunden mit einem die Digitoxigeninglycoside enthaltenden Ausgangsmaterials unter Luftabschluß und/oder bei Fremdbegasung mit N2 oder CO2 unter Rühren zur Reaktion gebracht und danach das Gitoxin bzw. Digoxin nach bekannten Verfahren isoliert wird.