DE2167035A1

DE2167035A1 - Verfahren zur gewinnung von creatin- amidinohydrolase

Info

Publication number: DE2167035A1
Application number: DE19712167035
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Rer Nat Beaucamp; Hans Ulrich Dr Rer N Bergmeyer; Hans Moellering; Michael D Nelboeck-Hochstetter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1971-05-05
Filing date: 1971-05-05
Publication date: 1977-10-06
Also published as: DE2167035B2; DE2167035C3

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K.Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

int. Nr. 1749-1

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH

Sandhofer Straße 112-132 - 6800 Mannheim -

Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase

Ausscheidung aus Patent (Patentanmeldung P 21 22 298.0).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung des Enzyms Creatin-amidinohydrolase aus Mikroorganismen.

In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählt auch Creatin.

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Ή.

Roche, Lacombe und Girard (BBA 6_, 210, 1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, J_5_, Seiten 122, 158, 173, 1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:

P Creatinin =^ Creatin ^ Harnstoff und

Sarcosin ^ Glycin ^NH->

Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaues zu bestätigen und erstmals zwei Enzyme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt sind.

Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung und Reinigung eines dieser Enzyme.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidino- ψ hydrolase aus Mikroorganismen besteht darin, daß ein in einem creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Tests, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, ein Gemisch aus Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase gereinigt und anschließend die Creatin-amidinohydrolase von der Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.

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Durch das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wird folgende Reaktion katalysiert:

Creatin + H₃O _{Sarcosin +} Harnstoff

Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Enzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.

Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen. Als Aufschlußmethoden eignen sich die üblichen Methoden je nach der Festigkeit oder Widerstandsfähigkeit der Zellhaut des verwendeten Mikroorganismus. Besonders geeignet erwiesen sich die Hochdruckdispersion sowie der Ultraschallaufschluß. Weitere Beispiele für geeignete Aufschlußmethoden sind Desintegrationsmühlen, z. B. nach Balutini und Schloßmann, und auf ähnlicher Basis arbeitende Aufschlußmethoden. Auch chemische oder enzymatische Aufschlußmethoden sind anwendbar.

Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatin-amidinohydrolase anreichern, indem man die Eigenschaft des Begleitenzyms Creatinin-amidohydrolase, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt. Gebildetes Creatin läßt sich nach bekannten Methoden bestimmen, beispielsweise durch Zusatz von ATP und Messung von so gebildetem ADP in üblicher Weise. Es ist jedoch erforderlich, bei pH-Werten über 7 zu arbeiten und die jeweils angewendeten Reinigungsmethoden nach ihrer Anwendbarkeit bei diesen pH-Werten auszuwählen.

Eine weitere Methode, den Fortschritt des Anreicherungsverfahrens zu verfolgen, besteht darin, mit Creatin-amidinohydrolase das gebildete Creatin zu spalten unter Bildung von Sarcosin und Harnstoff und dann den Harnstoff in üblicher Weise, beispielsweise mittels der bekannten Reaktion unter Verwendung von Urease zu bestimmen.

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.6.

Das Ausmaß der durchgeführten Reinigung hängt von dem beabsichtigten Verwendungszweck des Enzyms ab. Falls ein zur enzymatischen Creatin-Bestimmung geeignetes Präparat gewünscht ist, genügt bereits ein einziger Reinigungsschritt. Geeignete Reinigungsschritte sind beispielsweise Polyanionenbehandlung, Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie. •Unter Anwendung der oben erwähnten Bestimmungsmethoden ist es hierbei auf einfache Weise möglich, jeweils den Verbleib der gewünschten Enzyme festzustellen und diese in einem einzigen Schritt in erheblichem Maße anzureichern.

Da bei einer längeren Lagerung der geernteten und eingefrorenen Mikroorganismen eine Aktivitatsabnähme des gewünschten Enzyms zu befürchten ist, werden vorzugsweise die Zellen nach der Ernte möglichst rasch weiter aufgearbeitet. Zwei für das Verfahren der Erfindung bevorzugte Mikroorganismen sind in der gleichzeitig unter der internen Nummer 1767 eingereichten Anmeldung

P beschrieben / es handelt sich um Alcaligenes

spec. WS 51400 aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90001 (Weihenstephan).

Da Creatin-amidinohydrolase bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität verliert, bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität aufweist, erfolgt der Aufschluß vorzugsweise mit alkalischem Puffer. Vorzugsweise wird 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, verwendet. Die Wahl des Puffers und der Pufferkonzentration sollte zweckmäßig je nach dem vorgesehenen weiteren Anreicherungsschritt so erfolgen, daß in dem für den Aufschluß verwendeten Puffer auch die weitere Anreicherung durchgeführt wurden kann. Bei Aufschluß in der Hochdruckdispersion, üblicherweise bei etwa 700 bis 800 atü, kann die weitere Reinigung bei Anwendung einer Polyanionenbehandlung ohne vorherige Abtrennung der Zellrückstände durchgeführt werden. Geeignete Polyanionen sind beispielsweise Protaminsulfat oder wasserlösliches PoIyäthylenimin. Bevorzugt wird ein Zusatz von wasserlöslichem Polyäthylenimin, beispielsweise in Form einer 10 %-igen Lösung von pH 8. Bei einer Lösung dieser Konzentration sind etwa 5 %

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Zusatz, bezogen auf Aufschlußvolumen, erforderlich, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird durch physikalische Mittel, beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Die gewünschten Enzyme verbleiben im Überstand.

Anstelle einer Polyanxonenfallung erwies sich auch eine Fällung mit organischem Lösungsmittel als vorteilhaft. Vorzugsweise wird hierbei Isopropanol verwendet. In diesem Fall werden die Zellrückstände nach dem Aufschluß zuerst entfernt und dann wird bei Zimmertemperatur das organische Lösungsmittel zugesetzt. Die Isopropanol-Fraktionierung wird vorzugsweise so durchgeführt, daß bei 25°C pro Liter Aufschlußlösung 800 ml 90 %-iges Isopropanol zugesetzt und der Niederschlag abgetrennt wird. Der erhaltene Niederschlag wird erneut mit 500 ml Isopropanol je Liter versetzt und der Niederschlag, der das gewünschte Enzym enthält, abgetrennt.

Besonders bevorzugt ist eine kombinierte Anwendung der beiden oben erwähnten Methoden, nämlich Polyanionenfällung und anschließend Fraktionierung mit organischem Lösungsmittel.

Sowohl die mit einem einzigen Anreichunungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten erhaltenen Produkte sind ber-eits zur Verwendung in einer spezifischen Creatinin-Bestimmung geeignet. Die Enzyme Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolse fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an. Die so erhaltene Mischung wird anschließend durch Austauscherchromatographie getrennt. Als besonders geeigneter Austauscher erwies sich dabei ein schwach basischer Ionenaustauscher wie DEAE-Sephadex oder DEAE-Cellulose.

Bei Verwendung von DEAE-Sephadex werden die Enzyme bei geringer Ionenkonzentration, vorzugsweise etwa 0,01 bis 0,05 M, auf dem Austauscher adsorbiert. Anschließend wird der Austauscher

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mit einer Ionenkonzentration von etwa 0,1 M gewaschen, wobei nichtaktive Begleitproteine entfernt werden. Creatinin-amidohydrolase läßt sich mit 0,2 M Pufferlösung eluieren. Die Creatin-amidinohydrolase verbleibt hierbei noch am Austauscher.

Die oben beschriebene bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Kombination einer Isopropanol-Fraktionierung und einer AustauscherChromatographie führt zu einer etwa 100-fachen Anreicherung des Enzyms Creatin-amidinohydrolase, wobei ein Präparat mit einer Aktivität von 3 U/mg erhalten wird.

Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine sehr einfache Feinreinigung erfolgen, indem im Batch-Verfahren so viel Austauscher zugesetzt wird, bis das Enzym adsorbiert ist. Der Austauscher wird dann abgetrennt und, wie oben beschrieben, gewaschen und anschließend eluiert.

Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung und Anreicherung besteht in der Salzfällung bzw. Salzfraktionierung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat fällt die Creatin-amidinohydrolase bei einer Konzentration von 2 ,7 M.

\ Die Salz fällung eignet sich auch zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen, wie sie beispielsweise bei der Elution des Austauschers erhalten werden. Durch Dialyse bei 4 C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer, beispielsweise 0,02 M Diäthanolamin-Puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.

Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.

Falls die Creatinin-amidohydrolase allein gewünscht wird, besteht eine weitere Reinigungs- und Anreicherungsmethode auch in einem Hitzeschritt bei 60°C. Eine derartige Erhitzung während

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5 Minuten führt zu keiner merklichen Verringerung der Creatininamidohydrolase-Aktivität. Im Gegensatz dabei verliert die Creatin-amidinohydrolase unter diesen Bedingungen ihre Aktivität.

Das erfindungsgemäß erhältliche neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen Bestimmung des Creatinins und Creatins verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1

Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alcaligenes spec. WS 51400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, auf 20 l aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird bei 5 Vol.-% einer 10 %-igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt. Nach Zugabe von KCl (0,01 M
Endmolarität) und NH₄Cl (0,1 M Endmolarität) werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90 %-iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.

Der reichliche Niederschlag wird abgetrennt. Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 90 %-iges Isopropanol zugegeben.

Der so gebildete Niederschlag, welcher Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in
400 ml 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, aufgenommen. Ein
ungelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf
eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex-Säule (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Vol. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, eluiert.

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Dann wird die Creatin-amidinohydrolase mit 0,2 M Kaliumphos phatpuffer, pH 8,0, enthaltend 0,3 M NaCl, eluiert. Die Ein zelheiten zeigt die nachstehende Tabelle.

Trennung von Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase an DEAE-Sephad.ex-Anionenaustauscher.

Schritt	Protein in mg	Creatinin-amido hydrolase U .U/mg. . . .	Creatin- amidino hydrolase U U/mg
nach Isopropanol- schritt	175	860 4,9	44 0,25
DEAE-Sephadex-Wasch- wasser 0,20 M pH 8,0 (Eluate) 0,50 M pH 8,0 (Eluate)	90 29 13,7
1 787 27 1,8 0,13	0 0 41 3,0

Bei s ρ i e 1 2

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird die DEAE-Sephadex-Chromatographie durch ein DEAE-Batch-Verfahren ersetzt.

Ausgehend von 100 g Alcaligenes spec. WS 51400 werden 100 ml des in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gelösten zweiten Isopropanol-Niederschlages mit so viel DEAE-Sephadex versetzt, bis im Überstand etwa je 5 % der Enzyme verbleiben (etwa 20 g feucht abgepreßter Austauscher). Der Austauscher wird abfiltriert, mit ca. 100 ml 0,08 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und mit 100 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, enthaltend 0,3 M KCl, 15 Minuten bei + 4°C gerührt und anschließend filtriert. Im Eluat findet sich das gesuchte Enzym. Durch Fällung mit Ammoniumsulfat kann ein Präparat mit 31,5 U/mg Creatinin-amidohydrolase und 1,1 U/mg Creatin-amidinohydrolase isoliert werden. Näheres zeigt die nachs i_ehende Tabelle.

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Isolierung eines angereicherten Enzymgemisches von Creatininamidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase aus 100 g (Trockengewicht) Alcaligenes spec. WS 51400

Schritt	Protein in g	Creatinin-amido- hydrolase U U/mg .	0,92	Creatin-amidino hydrolase U. U/mg	0,023
Aufschluß	26,1	2,4x1O⁴	13,9 31,5	6x1O²	0,265 1,1
2.Isopropanolzusatz (Niederschlag) DEAE-Sephadex-Eluat 0,5 M pH 8,0	1,43 0,370	1,98x1O⁴ 1,16x1O⁴	3,8x1O² 4,1x1O²

Die Creatin-amidinohydrolase-Bestimmung wurde unter Messung des aus Creatinin gebildeten Harnstoffs durchgeführt, wobei letzterer nach dem Urease-Verfahren unter Spaltung gemessen wurde.

Die Michaelis-Konstante für Creatin wurde wie folgt bestimmt: M

K_M = 5 χ 10"² _M (25°C; pH 7,6).

«■ . ι

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase,
dadurch gekennzeichnet, daß' ein in einem Creatinin-haltigen
Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der
wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemischen Reinigungsbzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Tests, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, die Creatinin-amidohydrolase gereinigt und anschließend gegebenenfalls die Creatin-amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein mechanischer Aufschluß durchgeführt wird, insbesondere unter Anwendung von Hochdruckdispersion, Ultraschall- oder Desintegrationsmühle .

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyanionenfraktionierung durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyäthylenimin-Fällung bei einer Pufferkonzentration von etwa 0,1 M durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine zweistufige Fällung mit Isopropa.nol durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme an einen schwach basischen Ionenaustauscher bei einer Ionenkonzentration unter 0,1 M ad-

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sorbiert, der Austauscher mit etwa 0,1 M Puffer gewaschen und die Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase mit einer Ionenkonzentration von 0,2 M bzw. 0,5 M eluiert werden.

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