DE2167035B2 - Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolaseInfo
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Description
Ausscheidung aus der Patentanmeldung P 21 22 298.0-41.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Creatin-amidinohydrolase aus Mikroorganismen.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung
der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählt auch Creatin.
Roche, Lacombe und Girard (BBA 6, 210,
1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als
spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter
wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologie, 15, Seiten 122,158,173,1951) in Erdbakterien ein als
Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung zwischen Creatinin und Creatin
bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinine vermutet:
Creatinin ^=i Creatin-* Harnstoff und
Sarcosin-* Glycin-► NH3
Sarcosin-* Glycin-► NH3
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaues zu bestätigen und erstmals zwei
Enzyme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche an diesem Abbauweg
entscheidend beteiligt sind.
Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung und Reinigung eines dieser Enzyme.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase aus Mikroorganismen
besteht darin, daß ein in einem Creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen,
aus der wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten
biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Tests, bei dem aus
zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, ein die Creatinin-amidohydrolase
und die Creatin-amidinohydrolase nebeneinander enthaltendes Produkt gewonnen und anschließend
gegebenenfalls die Creatin-amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase durch Austauscherchromatographie
abgetrennt wird.
Durch das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wird folgende Reaktion katalysiert:
Creatin-amidinohydrolase Creatin + H2O ► Sarcosin + Harnstoff.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Enzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in
denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter
Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikoorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen. Als
Aufschlußmethoden eigenen sich die üblichen Methoden je nach der Festigkeit oder Widerstandsfähigkeit
der Zellhaut des verwendeten Mikroorganismus. Besonders geeignet erwiesen sich die Hochdruckdispersion
sowie der Ultraschallaufschluß. Weitere Beispiele für geeignete Aufschlußmethoden sind Desintegrationsmühlen, z. B. nach Ba 1 u t i ηi und Schloßmann und
auf ähnlicher Basis arbeitende Aufschlußmethoden. Auch chemische oder enzymatische Aufschlußmethoden
sind anwendbar.
Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatin-amidinohydrolase anreichern, indem
man die Eigenschaft des Begleitenzyms Creatinin-amidohydrolase, Creatinin in Creatin zu überführen,
ausnützt. Gebildetes Creatin läßt sich nach bekannten Methoden bestimmen, beispielsweise durch Zusatz von
ATP und Messung von so gebildetem ADP in üblicher
Weise. Es ist jedoch erforderlich, bei pH-Werten über 7 zu arbeiten und die jeweils angewendeten Reinigungsmethoden nach ihrer Anwendbarkeit bei diesen
pH-Werten auszuwählen.
Eine weitere Methode, den Fortschritt des Anreicherungsverfahrens zu verfolgen, besteht darin, mit
Creatin-amidinohydrolase das gebildete Creatin zu spalten unter Bildung von Sarcosin und Harnstoff und
dann den Harnstoff in üblicher Weise, beispielsweise mittels der bekannten Reaktion unter Verwendung von
Urease zu bestimmen.
Das Ausmaß der durchgeführten Reinigung hängt von dem beabsichtigten Verwendungszweck des Enzyms
ab. Falls sin zur enzymatischen Creatin-Bestimmung
geeignetes Präparat gewünscht ist, genügt bereits ein einziger Reinigungsschritt Geeignete Reinigungsschritte sind beispielsweise Polyanionenbehandlung,
Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie. Unter Anwendung der oben erwähnten
Bestimmungsmethoden ist es hierbei auf einfache Weise möglich, jeweils den Verbleib der gewünschten
Enzyme festzustellen und diese in einem einzigen Schritt in erheblichem Maße anzureichern.
Da bei einer längeren Lagerung der geernteten und eingefrorenen Mikroorganismen eine Aktivitätsabnahme
gewünschten Enzyms zu befürchten ist, werden die Zellen nach der Ernte möglichst rasch weiter aufgearbeitet.
Zwei für das Verfahren der Erfindung geeignete Mikroorganismen sind Alcaligenes spec. WS 51400 aus
der Familie Achromobatericeae und Penicillum WS 90001 (Weihenstephan).
Da Creati n-amidinohydrolase bei pH-Werten von 6
und darunter schnell an Aktivität verliert, bei pH-Werten
um 8,0 die größte Stabilität aufweist, soll der Aufschluß mit alkalischem Puffer erfolgen. Geeignet ist 0,1 M
Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0. Die Wahl des Puffers und der Pufferkonzentration sollte zweckmäßig je nach
dem vorgesehenen weiteren Anreicherungsschritt so erfolgen, daß in dem für den Aufschluß verwendeten
Puffer auch die weitere Anreicherung durchgeführt werden kann. Bei Aufschluß in der Hochdruckdispersion,
üblicherweise bei etwa 700 bis 800 atü, kann die weitere Reinigung bei Anwendung einer Polyanionenbehandlung
ohne vorherige Abtrennung der Zellrückstände durchgeführt werden. Geeignete Polyanionen
sind beispielsweise Protaminsulfat oder wasserlösliches Polyäthylenimin. Bevorzugt wird ein Zusatz von
wasserlöslichem Polyäthylenimin, beispielsweise in Form einer 10%igen Lösung von pH 8. Bei einer Lösung
dieser Konzentration sind etwa 5% Zusatz, bezogen auf Aufschlußvolumen, erforderlich, bis kein weiterer
Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird durch physikalische Mittel, beispielsweise Filtrieren
oder Zentrifugieren, abgetrennt. Die beiden Enzyme verbleiben im Überstand.
Anstelle einer Poiyanionenfällung erwies sich auch eine Fällung mit organischem Lösungsmittel als
vorteilhaft. Vorzugsweise wird hierbei Isopropanol verwendet. In diesem Fall werden die Zellrückstände
nach dem Aufschluß zuerst entfernt und dann wird bei Zimmertemperatur das organische Lösungsmittel zugesetzt.
Die Isopropanol-Fraktionierung kann so durchgeführt werden, daß bei 25° C pro Liter Aufschlußlösung
800 ml 90%iges Isopropanol zugesetzt und der Niederschlag abgetrennt wird. Der erhaltene Niederschlag
wird erneut mit 500 ml Isopropanol je Liter versetzt und der Niederschlag, der das gewünschte Enzym enthält,
abgetrennt.
Besonders geeignet ist eine kombinierte Anwendung der beiden oben erwähnten Methoden, nämlich
Poiyanionenfällung und anschließend Fraktionierung mit organischem Lösungsmittel.
Sowohl die mit einem einzigen Anreicherungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten
erhaltenen Produkte sind bereits zur Verwendung in einer spezifischen Creatin-Bestimmung geeignet. Die
Enzyme Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an.
Die so erhaltene Mischung wird anschließend durch Austauscherchromatographie getrennt. Als besonders
geeigneter Austauscher erwies sich dabei ein schwach basischer Ionenaustauscher wie ein Diäthylaminoäthanol-Gruppen
enthaltendes vernetztes Dextran oder DEAE-Cellulose.
Bei Verwendung dieses Dextran-Derivats werden die Enzyme bei geringer Ionenkonzentration, vorzugsweise
etwa 0,01 bis 0,05 M, auf dem Austauscher adsorbiert.
Anschließend wird der Austauscher mit einer Ionenkonzentration von etwa 0,1 M gewaschen, wobei nichtaktive
Begleitproteine entfernt werden. Creatinin-amidohydrolase läßt sich mit 0,2 M Pufferlösung eluieren. Die
Creatin-amidinohydrolase verbleibt hierbei noch am Austauscher.
Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Kombination
einer Isopropanol-Fraktionierung und einer Austauscherchromatographie
führt zu einer etwa lOOfachen
μ Anreicherung des Enzyms Creatin-amidinohydrolase,
wobei ein Präparat mit einer Aktivität von 3 U/mg erhalten wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine sehr einfache
r> Feinreinigung erfolgen, indem im Batch-Verfallen so
viel Austauscher zugesetzt wird, bis das Enzym adsorbiert ist. Der Austauscher wird dann abgetrennt
und, wie oben beschrieben, gewaschen und anschließend eluiert.
Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung und Anreicherung
besteht in der Salzfällung bzw. Salzfraktionierung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat.
Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat fällt die Creatin-amidinohydrolase bei einer Konzentration
von 2,7 M.
Die Salzfällung eignet sich auch zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen, wie sie beispielsweise bei
der Elution des Austauschers erhalten werden. Durch Dialyse bei 4° C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer,
beispielsweise 0,02 M Diäthanolamin-Puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen
Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert
werden.
Das erfindungsgemäß erhältliche neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen
Bestimmung des Creatinins und Creatins verwendet werden.
bo Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
weiter.
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten
b5 Kulturansatz Alcaligenes spec. WS 51400 werden die
Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, auf 20 1 aufgenommen
und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca.
800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird bei 5 Vol.· %
einer 10%igen Polyöthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt. Nach Zugabe von
KCl (0,01 M Endmolarität) und NH4Cl (0,1 M Endmolarität)
werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90%iges wäßriges Isopropanol
zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der reichliche Niederschlag wird abgetrennt. Dem Oberstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen
9O°/oiges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag welcher Creatininamidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält,
wird abgetrennt und in 400 ml 0,02 M Kaliumphosphatpuffer,
pH 8,0, aufgenommen. Ein ungelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf eine mit dem
gleichen Puffer äquilibrierte Säule mit Diäthylaminoäthanol-Gruppen
enthaltendem vernetztem Dextran (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die
Säule mit 1 Vol. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer,
pH 8,0, eluiert.
Dann wird die Creatin-amidinohydrolase mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, enthaltend 0,3 M NaCl,
eluiert. Die Einzelheiten zeigt die nachstehende Tabelle.
Trennung von Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase
an dem Anionenaustauscher
| Schritt | Protein | Creatinin-amido | U/mg | Creatin- | U/mg |
| in mg | hydrolase | 4,9 | amidino | 0,25 | |
| - | hydrolase | - | |||
| U | 27 | U | - | ||
| Nach Isopropanolschritt | 175 | 860 | 0,13 | 44 | 3,0 |
| Austauscher-Waschwasser | 90 | 1 | 0 | ||
| 0,20 M pH 8,0 (Eluate) | 29 | 787 | 0 | ||
| 0,50 M pH 8,0 (Eluate) | 13,7 | 1,8 | 41 | ||
| Beispiel 2 | |||||
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird die Säulen-Chromatographie durch ein
Batch-Verfahren ersetzt.
Ausgehend von 100 g Alcaligenes spec. WS 51400 werden 100 ml des in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH
8,0, gelösten zweiten Isopropanol-Niederschlages mit so viel Diäthylaminoäthanol-Gruppen enthaltendem vernetztem
Dextran versetzt, bis im Überstand je 5% der Enzyme verbleiben (etwa 20 g feucht abgepreßter
Austauscher). Der Austauscher wird abfiltriert, mit ca. 100 ml 0,08 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen
und mit 100 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, enthaltend 0,3 M KCl, 15 Minuten bei +40C gerührt
und anschließend filtriert. Im Eluat findet sich das gesuchte Enzym. Durch Fällung mit Ammoniumsulfat
kann ein Präparat mit 31,5 U/mg Creatinin-amidohydrolase und 1,1 U/mg Creatin-amidinohydrolase isoliert
werden. Näheres zeigt die nachstehende Tabelle.
Isolierung eines angereicherten Enzymgemisches von Creatinin-amidohydrolase und
Creatin-amidinohydrolase aus 100g (Trockengewicht) Alcaligenes spec. WS 51400
Schritt
Protein in g Creatinin-amidohydrolase
Creatin-amidinohydrolase
U/mg U
U/mg
Aufschluß 26,1
2. Isopropanolzusatz (Niederschlag) 1,43
Austauscher-Eluat 0,5 M pH 8,0 0,370
2,4XlO4 0,92 6X10
l,98X104 13,9
1,16XlO4 31,5
1,16XlO4 31,5
0,023
3,8XlO2 0,265
4,1XlO2 1,1
4,1XlO2 1,1
Die Creatin-amidinohydrolase-Bestimmung wurde unter Messung des aus Creatinin gebildeten Harnstoffs
durchgeführt, wobei letzterer nach dem Urease-Verfahren unter Spaltung gemessen wurde.
Die Michaelis-Konstante für Creatin wurde wie folgt bestimmt: KM = 5 χ 10-2 M(25°C;pH 7,6).
Claims (6)
1. Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase, dadurch gekennzeichnet,
daß ein in einem Creatinin-haltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus
der wasserlöslichen Aufschlußreaktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten
biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Tests, bei dem
aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, ein die
Creatinin-amidohydrolase und die Creatin-amidinohydrolase
nebeneinander enthaltendes Produkt gewonnen und anschließend gegebenenfalls die Creatin-amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase
durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß ein mechanischer Aufschluß durchgeführt wird, insbesondere unter Anwendung von
Hochdruckdispersion, Ultraschall- oder Desintegrationsmühle.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ι gekennzeichnet, daß eine Polyanionenfraktionierung
durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyäthylenimin-Fällung bei einer
Pufferkonzentration von etwa 0,1 M durchgeführt
in wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine
zweistufige Fällung mit Isopropanol durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme
an einen schwach basischen Ionenaustauscher als das Austauscherchromatographie-Material bei einer
Ionenkonzentration unter 0,1 M adsorbiert, der Austauscher mit etwa 0,1 M Puffer gewaschen und
die Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase mit einer Ionenkonzentration von 0,2 M
bzw. 0,5 M eluiert werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712167035 DE2167035C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19712167035 DE2167035C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2167035A1 DE2167035A1 (de) | 1977-10-06 |
| DE2167035B2 true DE2167035B2 (de) | 1978-09-21 |
| DE2167035C3 DE2167035C3 (de) | 1979-05-10 |
Family
ID=5830298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19712167035 Expired DE2167035C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2167035C3 (de) |
-
1971
- 1971-05-05 DE DE19712167035 patent/DE2167035C3/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2167035C3 (de) | 1979-05-10 |
| DE2167035A1 (de) | 1977-10-06 |
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