DE2157622B2

DE2157622B2 - Verfahren zur Herstellung einer antUipämischen Substanz aus Säugetierorganen

Info

Publication number: DE2157622B2
Application number: DE2157622A
Authority: DE
Inventors: Toshihiro Hamakawa; Motoyoshi Kajihara; Fumiaki Ogawa; Takashi Suzue
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1971-11-20
Filing date: 1971-11-20
Publication date: 1980-08-28
Also published as: DE2157622C3; DE2157622A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer antilipämischen Substanz aus Säugetierorganen.

Verschiedene Substanzen wurden bereits aus tierischen Organen gewonnen, die auf den menschlichen Körper wirksam sind, und zwar einerseits Hormone und Vitamine, als auch solche, die medikamentös wirksam 2> sind. Zum Beispiel sind eine epiphylaktische Substanz aus dem Mark eines Tieres (japanische Patentveröffentlichung 21 794/1965) und aus einem Organ eine Substanz zum Steuern der Funktion des Organes (japanische Patentveröffentlichung 5 749/1957) beschrieben.

Es sind auch bereits antilipämische Stoffe bekannt, welche mittels biochemischer Verfahren aus Säugetierorganen gewonnen werden, die eine Aktivität zur Erhöhung der Lipoproteinlipase-Aktivität zeigen. Die y, bekanntesten davon sind Heparin, das zwar eine hohe derartige Aktivität besitzt, jedoch eine sehr hohe Antikoagulationsaktivität aufweist, so daß es im klinischen Sektor nicht verwendet werdeü kann. Dextransulfat soll diese Nachteile des Heparins beseitigen, ist jedoch für diesen Zweck nicht ausreichend. Wenn auch der carcogene Charakter von Clofibrat noch nicht widerlegt ist und dessen Anwendung in der Bundesrepublik deshalb zur Zeit verboten ist, so ist Clofibrat zur Zeit das am besten wirksame antilipämische Mittel. Die im vorliegenden Fall gewonnenen Stoffe sind jedoch, wie in den nachfolgenden Beispielen belegt, den bekannten antilipämisch wirkenden Mitteln eindeutig überlegen und ohne Nebenwirkungen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht demnach darin, ein Verfahren zur Herstellung einer antilipämischen Substanz auszuarbeiten, die aus tierischen Organen unter industriellen Bedingungen gewonnen werden kann und einen hohen Grad von antilipämischer Aktivität ohne die oben angegebenen Nachteile aufweist

Die Erfinder gingen bei ihren Versuchen über die Verwendung tierischer Organe von der Unterstellung aus, daß die Organe normaler Tiere eine Substanz zum t>o Steuern von abnormalem Metabolismus enthalten, der Hyperlipämie verursacht.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer antilipämischen Substanz aus Säugetierorganen, das dadurch gekennzeichnet ist daß man Lunge, Leber, Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Dünndarm, Magen, Gehirn, Muskel oder Blut siert, dann 18 bis 24 Stunden bei 20 bis 40° C autolysiert, im Autolysat einen pH-Wert von 4 bis 11, einstellt, mit Wasser extrahiert, die wäßrige Lösung dialysiert, die zurückbleibende Lösung enteiweißt, erneut dialysiert die zurückbleibende Lösung nach Konzentrieren mit einem organischen Lösungsmittel versetzt und den entstandenen Niederschlag abtrennt

Vorzugsweise wird die autolysierte Substanz bei einem pH-Wert von 8 bis 9,5 mit Wasser extrahiert

Es ist überraschend, daß sich diese antilipämische Substanz praktisch in allen Säugetierorganen findet und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden kann.

Für Einzelheiten des Verfahrens wird auf die nachfolgenden Ausführungen verwiesen.

Gemäß einer Art des Verfahrens dieser Erfindung wird das Organ durch ein Homogenisiergerät oder eine andere geeignete Vorrichtung unter dem Zusatz von destilliertem Wasser geschliffen. Es ist zweckmäßig, das destillierte Wasser in einer Menge von 0,5 bis 1 χ dem Gewicht des Organs zu verwenden. Das geschliffene Organ wird dann der Autolyse in dem Wasser ausgesetzt. Die Autolyse kann bei Zimmertemperatur oder bei leicht erhöhter Temperatur im allgemeinen bei 20 bis 40⁰C ausgeführt werden. Der Vorgang der Autolyse ist sehr kritisch für diese Erfindung, und nur durch die Autolyse kann eine stark antilipämische Substanz erhalten werden. Tatsächlich ist es unmöglich, eine solche Substanz herzustellen, ohne die Autolyse auszuführen.

Die bei der Autolyse erhaltene wirksame Substanz wird in das Wasser übertragen. Die Übertragung der wirksamen Substanz auf das Wasser findet bei einem pH-Bereich von 4 bis 11 statt und wird besonders bei einem pH-Wert von 8 bis 9,5 unterstützt. Der pH-Wert der autolysierten Flüssigkeit variiert mit der Art des Ausgangsorganes, ist jedoch gewöhnlich innerhalb des obigen Bereiches leicht sauer, wodurch der wirksame Bestandteil während der Autolyse in das Wasser übertragen wird. Um die Übertragung zu beschleunigen, wird die autolysierte Flüssigkeit, wenn gewünscht, gerührt. Vor dem Rühren wird der Flüssigkeit ein Alkali zuzusetzen, wie beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid etc., um deren pH-Bereich auf 8 bis 9,5 zu bringen, wodurch die Übertragung der autolysierten Substanz merklich beschleunigt wird.

Unlösliches wird von der autolysierten Flüssigkeit entfernt, und die erhaltene Flüssigkeit wird dann der

eines Säugetieres unter Zusatz von Wasser homogen:- Dialyse unterworfen, urn in der Flüssigkeit gelöste

Substanzen von niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Verschiedene bekannte Dialysiermembrane können verwendet werden, aber Celluloserohre sind für den Zweck günstig. Ein entproteinisierendes Mittel wird anschließend dem erhaltenen nichtdialysierten Teil 5 zugesetzt, um das darin enthaltene Protein zu entfernen. Das entproteinisierende Mittel umfaßt Natriumchlorid, Ammoniumsulfat Natriumsulfat, Trichloressigsäure, Perchlorsäure und dergleichen. Die Menge des zu verwendenden entproteinisierenden Mittels variiert gemäß dessen Arten. Wenn z.B. Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat verwendet werden, wird empfohlen, solches Salz an die nichtdialysierte Flüssigkeit zuzusetzen, um eine gesättigte Lösung des zugesetzten Salzes zu bilden. Wenn Trichloressigsäure is verwendet wird, wird empfohlen, dies^ Säure an die nichtdialysierte Flüssigkeit zuzusetzen, um eine Lösung zu bilden, die die Säure in einer Konzentration von 5 bis 10 Gew.-% enthält, und wenn Perchlorsäure verwendet wird, wird sie vorzugsweise an die Flüssigkeit zugesetzt um eine Lösung zu bilden, die die Säure in einer Konzentration von 10 bis 20 Gew.-% enthält

Nach der Entproteinisierung wird erneut eine Dialyse ausgeführt um das entproteinisierende Mittel von der erhaltenen Flüssigkeit zu entfernen. Für diesen Zweck wird eine Dialysiermembrane aus demselben Material verwendet wie sie in dem vorhergehenden Arbeitsgang verwendet wird, zweckmäßig Celluloserohre. Die somit erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wird dann unter vermindertem Druck konzentriert Ein organisches jo Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol und dergleichen, niederer Alkohol, Azeton, Benzol, Äthyläther etc. wird der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt, um die wirksame Substanz auszufällen. Das gewünschte Produkt wird dann durch Filtrieren in der j^r> Form eines weißen oder hellgelben Pulvers zurückgewonnen.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Substanz weist die folgenden Eigenschaften auf. Sie ist ein weißes oder hellgelbes Pulver und ist leicht in Wasser löslich, aber unlöslich in Methanol, Äthanol, Azeton, Benzol und Äthyläther. Was ihre chemischen Eigenschaften betrifft erweist sich die Substanz als positiv, wenn sie geprüft wird durch das Ninhydrin-Verfahren, das Folin-Lowry-Verfahren, das EIson-Morgan- Verfahren und das M. Dubois-Phenol-Schwefelsäureverfahren und als negativ durch das Fiske-Subbarow-Verfahren, das Diphenylaminverfahren und durch Orzinverfahren. Die Farbintensität der durch Ninhydrinreaktion hergestellten Substanz vermindert sich, wenn sie der Säurehydrolyse und Alkalihydrolyse unterworfen wird, während die Farbe verstärkt wird, wenn sie der Hydrolyse mit Protease unterzogen wird. Die Substanz der vorliegenden Erfindung ist wärmebeständig, selbst wenn eine wäßrige Lösung von 10 Gewichts-% davon 30 Minuten lang auf 100°C erhitzt wird, werden ihre im folgenden zu beschreibenden pharmakologischen Aktivitäter, überhaupt nicht beeinträchtigt Jedoch die Hydrolyse mit Säure, Alkali und Protease entzieht der Substanz alle pharmakologischen <>o Aktivitäten. Ferner verursacht ein entproteinisierendes Mittel, wie beispielsweise Natriumchlorid, Ammoniumsulfat, Trichloressigsäure, Perchlorsäure od. dgl. nicht das Ausfällen der Substanz der vorliegenden Erfindung.

Die Substanz dieser Erfindung weist die folgenden b5 pharmakologischen Aktivitäten auf. Sie vermindert den Gehalt an Lipoid (Gesamtlipoid., Gesamtchlolesterin und freie aüphatische Säure) in dem Blut, und gibt die Lipoproteid-Lipase-Aktivitäten in dem Blut frei, um somit hervorragende antilipämische Aktivitäten zu erzeugen.

Beispiele dieser Erfindung werden im folgenden angegeben, aber die Erfindung ist nicht darauf begrenzt

Beispiel 1

70 g der Lunge eines Kaninchens wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 35 ml destilliertem Wasser geschliffen und die Mischung wurde in einem Thermostat 24 Stunden lang bei 25° C stehengelassen, um die Autolyse zu bewirkea Die autolysierte Mischung wurde dann auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht und zwar durch den Zusatz einer Lösung von Natriumhydroxyd, und eine Stunde lang stehengelassen. Die Flüssigkeit wurde dann mit 5000UpM zur Trennung zentrifugiert um 45 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben stehende Flüssigkeit wurde der Dialyse unter Verwendung eines Zelluloserohres 15 Stunden lang ausgesetzt wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, um 46 ml einer nichtdialysierten Flüssigkeit zu erhalten. Der Flüssigkeit wurde 35 g Ammoniumsulfat zugesetzt und die erhaltene Mischung wurde etwa 4 Stunden lang gerührt Darauf folgte das Zentrifugieren bei 3000 UpM, um 37 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut für 15 Stunden der Dialyse ausgesetzt wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene, nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 40⁰C unter vermindertem Druck auf einen ml konzentriert 20 ml Azeton wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt um der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 42 mg der Kristalle zu erhalten.

Das somit erhaltene Produkt ließ eine Grundviskosität (η) von 0,1213 auf, welche bei 25°C unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel gemessen wurde.

Die Infrarot-Spektralanalyse des Produktes ergab die folgende Absorption:

3300^-',2950Cm-¹,1715 cm-', 1650 cm-¹,1215 cm-¹ und 1025 cm-'.

Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen Substanz ausgeführt. In diesen Versuchen wurde die quantitative Bestimmung des Lipoids in dem Blut und die der Lipoproteid-Lipase in dem Blut gemäß dem Verfahren ausgeführt, das in J. Lipid Res. 6, (1965) bzw. »The Method of Experiment on Lipids« beschrieben in »Proteins, Nucleic Acids and Enzymes«, Seite 213 Kyorithsushuppan Kabushiki Kaisha, Japan, 1968 beschrieben worden ist. Männliche Ratten von 9 Wochen mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden für die Versuche verwendet, zehn Ratten in jeder Gruppe. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben, worin gezeigt ist, daß bezüglich der von Hyperlipämie befallenen Ratten, erhalten durch intravenöse Verabreichung von 20 mg/100 g von »Triton WR 1339« (Schaumerzeuger, verwendet zur Herstellung von mit Hyperlipämie befallenen Tieren für das Experiment), jene denen 0,6 mg/100 g der vorliegenden Substanz intraperitoneal verabreicht wurden, einen hervorragenden antilipämischen Effekt mit Lipoproteid-Lipaseaktivität zeigten, im Kontrast zu jenen Kontrollen, denen eine physiologische Salzlösung verabreicht wurde.

Tabelle 1 zeigt den Lipoidgehalt in dem Blut und die Lipoproteid-Lipase-Aktivität ir. dem Blut.

m_M, ■ ■ · ^¹^- 21 57 5	Gesamtlipoid mg/dl	622 6 ,	auf und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot- Spektralanalyse, wie jene des Produktes von Beispiel 1. Die erhaltenen Substanzen wurden den Tieren verabreicht, um den Lipoidgehalt in dem Blut und die Lipoproteid-Lipase-Aktivität in dem Blut zu bestimmen. Die Versuche wurden auf dieselbe Weise ausgeführt wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.	führt wie in Beispiel 1. Der Lipoidgehalt in dem Blut und die Lipoprotein-Li- pase-Aktivität in dem Blut wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, wobei die somit erhaltenen Substanzen verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 1 Lipoid im Blut	Normale Ratten 37 v. Hyperlipämie befallene Ratten 186 (Kontrolle) v. Hyperlipämie befallene Ratten, an die 50 die vorl. SubsL verabreicht wurde
*) Angegeben in C. A.-Einheii (Clearing Factor Activity).	Gesamt- Freie Lipoproteid- *Cholesterin aliphatische Säure Lipase-Aktivität) mg/dl μΓη/ml**	Gesamt- Freie Lipo-Proteid- Cholesterin aliphatische Säure Lipase-Aktivität*) mg/dl umol/ml
5 0,090 0,82 51 0,120 0,10 10 0,095 0,77	4 0,084 0,66 26 0,115 0,04 7 0,086 0,38 24 0,110 0,06

Beispiel 2	hinaus aus einem Vergleich mit der Kontrolle hervorgeht, zeigt die letztere überhaupt keine solchen Aktivitäten.
Um die Notwendigkeit für die Autolyse in dem Verfahren dieser Erfindung zu zeigen, wurden eine autolysierte Lunge und eine nicht autolysierte Lunge der Dialyse nach der Gewinnung bei einem pH-Wert von 9,0 gemäß Beispiel 1 ausgesetzt, worauf das 25 anschließende Vorgehen wie in Beispiel 1 folgte. Das von der autolysierten Lunge erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25^CC)	Beispiel 3
Tabelle 2 Lipoid im Blut	Die Lunge eines Kaninchens wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 geschliffen und autolysiert. Der autolysierten Flüssigkeit mit einem pH-Wert von 6,6 bis 6,8 wurde Salzsäure oder Natriumhydroxyd zugesetzt, b5 um den pH-Wert auf die in der folgenden Tabelle 3 angegebenen Werte zu bringen. Dann wurden die anschließenden Vorgänge auf dieselbe Weise ausge-
Tiere Gesamtlipoid mg/dl
Normale Tiere 32 ν. Hyperlipämie befallene Tiere 151 (Kontrolle) v. Hyperlipämie bef. Tiere, denen die v. 35 autolysiertem Organ erh. Substanz verabr. wurde v. Hyperlipämie bef. Tiere, denen die 146 ohne Autolyse erh. Subst. verabreicht wurde
*) Angegeben in C. A.-Einheit (Clearing factor Activity).
Die von einem autolysierten Organ hergestellte Substanz zeigte viel höhere antilipämische Aktivitäten 55 als die ohne Autolyse erhaltene Substanz. Wie darüber

Tabelle 3	Gesamtlipoid	Gesamt-	Freie	Lipoprotein-
Lipoid im Blut		cholesterin	aliphatische Säure	Lipase-Aktivität
	mg/dl	mg/dl	;i.mol/ml
	32	4	0,080	0,66
	151	26	0,115	0,04
Normale Ratten
Von Hyperlipämie befallene Ratten
(Kontrolle)
v. Hyperlipämie befallene Ratten, denen
die gewonnene Substanz verabreicht	91	13	0,096	0,20
wurde	80	10	0,094	0,24
bei pH 4,0	76	9	0,094	0,28
bei pH 5,0	62	7	0,090	0,32
bei pH 6,0	38	5	0,088	0,32
bei pH 7,0	35	7	0,086	0,38
bei pH 8,0	36	6	0,084	0,30
bei pH 9,0	59	14	0,091	0,23
bei pH 10,0
bei pH 11,0

Aus Tabelle 3 geht hervor, daß wenn der pH-Wert der von der Autolyse des Organs hergestellten Flüssigkeit in dem Bereich von 4,0 bis 11,0 liegt, sich der wirksame Bestandteil zufriedenstellend in die Flüssigkeit überträgt

Eine Flüssigkeit eines pH-Wertes in diesem Bereich kann eine stark antilipämische Substanz ergeben, wenn sie der Dialyse unterworfen wird. Es ist zu ersehen, daß der pH-Wert in dem Bereich von 8 bis 9,5 die obige Übertragung unterstützen wird.

Beispiel 4

70 g der Leber einer Kuh wurde unter Zusatz von 70 ml destilliertem Wasser durch ein Homogenisiergerät geschliffen und die Mischung wurde 20 Stunden lang in einem Thermostat bei 30⁰C stehengelassen, um die Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung aus Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht und eine Stunde lang stehengelassen. Die Mischung wurde zur Abscheidung mit 500 UpM zentrifugiert, und 80 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde 18 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 81 ml einer nichtdialysierten Flüssigkeit erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurde 10 ml 20%ige Trichlore$sigsäure zugesetzt und die erhaltene Mischung wurde etwa 4 Stunden lang gerührt. Darauf folgte das Zentrifugieren bei 300C UpM, um 67 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut 24 Stunden der Dialyse ausgesetzt unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nicht dialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 60° C unter vermindertem Druck auf 2,0 ml konzentriert 45 ml von 99 Gewichts-%igem Äthanol wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt, und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 48 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25° C) auf und zeigte dieselbe Absorption der Infrarot-Spektralanalyse, wie das Produkt von Beispiel 1.

Die Lipoproteid-Lipase-Aktivität des somit erhaltenen Produktes wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestimmt mit den in der folgenden Tabelle 4 angegebenen Ergebnissen.

Beispiel 5

100 g des Harzens eines Rindes wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 140 ml destilliertem Wasser geschliffen, und die Mischung wurde mit einem Thermostat 24 Stunden lang bei 2O⁰C stehengelassen, um die Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht, und eine Stunde lang stehengelassen. Die Mischung wurde zur Trennung mit 6000UpM zentrifugiert, um 160 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde 24 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt, durch Verwenden

so desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 170 ml einer nichtdialysierten Flüssigkeit erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurde 70 g Natriumsulfat zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde etwa 4 Stunden lang gerührt Darauf folgte das Zentrifugieren mit 300UpM, um 120 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut 48 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt, bei Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 80° C unter vermindertem Druck auf 4,0 ml konzentriert 100 ml Äthanol von 99 Gewichts-% wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 61 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25°C)

auf und zeigte in der Infrarot-Spektroanalyse dieselbe Absorption wie das Produkt von Beispiel 1.

Die durch dasselbe Experiment wie in Beispiel 1 bestimmte Lipoprotein-Lipase-Aktivität des Produktes ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Beispiel 6

600 g der Lunge eines Schweines wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 600 ml destilliertem Wasser geschliffen und die Mischung ι ο wurde 20 Stunden lang in einem Thermostat bei 37° C stehengelassen, um die Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung von Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 gebracht und eine Stunde lang stehengelassen. Die Mischung wurde zur Trennung mit 5000 UpM zentrifugiert, um 700 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde 30 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt, durch Verwenden desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 850 ml einer nichtdialysierten Flüssigkeit erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurden 35 ml 60%ige Perchlorsäure zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde etwa 6 Stunden lang gerührt Darauf erfolgte das Zentrifugieren mit 3000 UpM, um 570 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut 48 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes jo Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 50⁰C unter vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert. 300 ml von 99%igem Äthanol wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt, und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 350 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25° C) auf und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot-Spektroanalyse, wie das Produkt von Beispiel 1.

Die auf dieselbe Weise wie in Beispie! 1 bestimmte Lipoproteid-Lipase-Aktivität des Produktes ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Beispiel 7

70 g der Lunge eines Kaninchens wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 70 ml destilliertem Wasser geschliffen, und die Mischung wurde in einem Thermostat bei 40⁰C 20 Stunden lang stehengelassen, um Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 11 gebracht und eine Stunde lang stehengelassen. Die Mischung wurde zur Trennung mit 5000 UpM zentrifugiert, um 80 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde der Dialyse 24 Stunden lang ausgesetzt bei Verwenden desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 81 ml einer nicht dialysierten Flüssigkeit erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurden 50 ml 60%ige Perchlorsäure zugesetzt und die erhaltene Mischung wurde etwa 10 Stunden lang gerührt Darauf folgte das Zentrifugieren mit 3500UpM, um 71yml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut 24 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt, unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes

45

50

55

60

65 Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 70° C unter vermindertem Druck auf 2,0 ml konzentriert. 25 ml Azeton wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 45 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25° C) auf und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot-Spektroanalyse, wie das Produkt von Beispiel 1.

Die Lipoproteid-Lipase-Aktivität des Produktes wurde auf dieselbe Weise bestimmt wie in Beispiel 1 und ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Beispiel 8

100 g des Gehirns eines Schweines wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 100 ml destilliertem Wasser geschliffen und die Mischung wurde in einem Thermostat 20 Stunden lang bei 20⁰C stehengelassen, um Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 9 gebracht und eine Stunde lang stehengelassen.

Die Mischung wurde zur Trennung mit 5000 UpM zentrifugiert, um 120 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde 24 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 150 ml einer nichtdialysierten Flüssigkeit erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurde 114 g Ammoniumsulfat zugesetzt und die erhaltene Mischung wurde etwa 4 Stunden lang gerührt. Darauf folgte das Zentrifugieren mit 3000UpM, um 140 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut 48 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt, unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 5O⁰C unter vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert 300 ml von 99%igem Äthanol wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt, und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 55 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25°C) und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot-Spektroanalyse wie das Produkt von Beispiel 1.

Die Lipoproteid-Lipase-Aktivität des Produktes wurde auf dieselbe Weise bestimmt wie in Beispiel 1.

Beispiel 9

200 g der Leber eines Kaninchens wurde durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 200 ml destilliertem Wasser geschliffen und die Mischung wurde in einem Thermostat 18 Stunden lang bei 25° C stehengelassen, um Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann mit einer Lösung von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 gebracht und eine Stunde lang stehengelassen. Die Mischung wurde zur Trennung mit 5000UpM zentrifugiert, um 250 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde 24 Stunden lang der Dialyse ausgesetzt unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf der Außenseite des Rohres floß, wodurch 300 ml einer nicht dialysierten Flüssigkeit

erhalten wurde. Der Flüssigkeit wurde 100 ml Trichloressigsäure von 20 Gewichts-% zugesetzt, und die erhaltene Mischung wurde etwa 4 Stunden lang gerührt. Darauf folgte das Zentrifugieren mit 3000 UpM, um 380 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu ergeben. Die somit hergestellte oben schwimmende Flüssigkeit wurde erneut für 72 Stunden der Dialyse ausgesetzt, unter Verwendung desselben Zelluloserohres wie in Beispiel 1, wobei destilliertes Wasser auf die Außenseite des Rohres floß. Die erhaltene nichtdialysierte Flüssigkeit wurde danach bei 5O⁰C unter vermindertem Druck auf 10 ml konzentriert. 300 ml Äthanol von 99 Gewichts-% wurde der konzentrierten Flüssigkeit zugesetzt und der dadurch erzeugte Niederschlag wurde abgefiltert, um 120 mg Kristalle zu erhalten. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grund Viskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25° C) auf und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot-Spektralanalyse wie das Produkt von Beispiel 1. Die in demselben Experiment wie in Beispiel 1 bestimmte Lipoproteid-Li- 2« pase-Aktivität des Produktes ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Beispiel 10

Zu einem Liter des Blutes eines Rindes wurde ein Liter destillierten Wasser zugesetzt, um Hämolyse zu verursachen und die Mischung wurde in einem Thermostat bei 37⁰C 18 Stunden lang stehengelassen, um Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann zur Trennung bei 5000 UpM zentrifugiert, jo um 2 Ltr. einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde dann auf dieselbe Weise behandelt wie in Beispiel 8, wodurch 13 mg Kristalle erhalten wurden. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 j-, (in Wasser bei 25⁰C) auf und zeigte dieselbe Absorption bei der Infrarot-Spektralanalyse, wie das Produkt von Beispiel 1.

Die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestimmte Lipoproteid-Lipase-Aktivität des Produktes ist in der folgenden Tabelle 4 angegeben.

Beispiel 11

1 kg des Dünndarmes eines Rindes wurde gründlich mit Wasser gewaschen und durch ein Homogenisiergerät mit dem Zusatz von 1 Ltr. destilliertem Wasser geschliffen und die Mischung wurde in einem Thermostat bei 30° C 20 Stunden lang stehengelassen, um Autolyse zu bewirken. Die autolysierte Mischung wurde dann zur Trennung mit 5000 UpM zentrifugiert, um 1200 ml einer oben schwimmenden Flüssigkeit zu erhalten. Die oben schwimmende Flüssigkeit wurde dann auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 behandelt, wodurch 220 mg Kristalle erhalten wurden. Das somit erhaltene Produkt wies eine Grundviskosität von 0,1213 (in Wasser bei 25⁰C) auf, und zeigte dieselbe Absorption bei derMnfrarotspektralanalyse wie das Produkt von Beispiel 1.

Die auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bestimmte Lipoprotein-Lipase-Aktivität des Produktes ist in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4	Lipoprotein-
	Lipase-Aktivität
	0,71
Normale Ratten	0,05
Von Hyperlipämie befallene Ratten
(Kontrolle)
Von Hyperlipämie befallene Ratten,
denen das Produkt folgender
Beispiele verabreicht wurde	0,60
Beispiel 4	0,64
Beispiel 5	0,40
Beispiel 6	0,50
Beispiel 7	0,62
Beispiel 8	0,42
Beispiel 9	0,42
Beispiel 10	0,52
Beispiel 11

Zum Vergleich der Überlegenheit der erfindungsgemäßen Substanzen gegenüber solchen nach dem Stand der Technik wurden Vergleichsversuche durchgeführt, bei denen die Substanz gemäß Beispiel 1 vorliegender Erfindung mit den bekannten Substanzen Dextransulfat und Clofibrat verglichen wurde.

Die antilipämische Wirksamkeit wurde in der gleichen Weise bestimmt wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß die von Hyperlipämie befallenen Ratten durch intravenöse Verabreichung von 40 mg/100 g Triton WR 1339 erhalten wurden und daß die antilipämischen Substanzen den Versuchsratten oral verabreicht wurden. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 wiedergegeben.

Tabelle 5

Normale Ratten

Von Hyperlipämie befallene Ratten Ratten, denen folgende Substanzen verabreicht wurden

Substanz gemäß Dextransulfat Clofibrat

Beispiel 1

(50 mg/kg) (250 mg/kg) (50 mg/kg)

Gesamtlipoide
jff-Lipoprotein
Triglycerid
Freies Cholesterin
G esam tchol esteri η

52,8 ± 8,5 68,8 ± 9,7 41,2 ± 10,3 13,1 ± 1,3 41,0+5,1

544.3 ± 27,9 467,7 ± 64,2

988.4 ± 172,0 102,7 ± 13,2

221.5 + 33,6

319,4 ±37,8

250.0 ± 47,7

195.1 + 79,4
32,8 ± 9,4
95,0 + 17,2

406,5 +90,5
417,3 ±36,7
641,8 ± 193,1
66,6 ±18,6
183,1 ±22,1

358,6 ± 72,9

434.8 ± 59,7
781,5 ±273,2 72,0 ± 16,2

209.9 ± 17,4

Fußnote: (Einheit: mg/dl Plasma)

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die eingesetzte erfindungsgemäße Substanz sowohl gegenüber dem bekannten Dextransulfat als auch dem als sehr wirksam bekannten Clofibrat überlegene antilipämische Wirksamkeit zeigt.

Beispiel 12

Die folgenden Versuche dienen dazu, die Überlegenheit der aus Rinderherz, Schweinelunge und Kaninchenleber gewonnenen identischen Substanzen gegenüber den bekanntesten antilipämisch wirkenden Vergleichssubstanzen aufzuzeigen.

1. Antilipämischer Aktivitätstest

Die antilipämische Aktivität wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, wobei jedoch die mit Hyperlipämie versetzten Ratten durch intravenöse Verabreichung von 40 mg/100 g Triton WR 1339 erzeugt wurden und die antilipämischen Substanzen oral an die zu untersuchenden Ratten verabfolgt wurden. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 6 wiedergegeben.

Tabelle 6

Total Ii ρ id	Total-
	cholcsteriii
(mg/dl)	(mg/dl)

Normal ratten

mit Hyperlipämie
versetzte Ratten

61,4 ±10,8 35,4 ± 8,9 508,1 ±28,9 192,4 ± 14,1

Ratten behandelt mit:

Substanz aus Beisp. 5 240,1 ± 36,9 102,6 ± 21,8 (Rinderherz),
(50 mg/kg)

Substanz aus Beisp. 6 232,6 ±21,1 95,4+10,2 (Schweinelunge),

(50 mg/kg)

Substanz aus Beisp. 9 248,0 ± 45,5 120,0 ± 24,3 (Kaninchenleber),

(50 mg/kg)
Dextransulfat
(250 mg/kg)
2-, Clofibrat
(50 mg/kg)

342,8 ± 46,1 164,3 ± 22,1 308,4 ±36,5 179,0 ±17,4

2. Recalcinierungstest

Eine Menge von 0,5 ml an 0,1 m-Natriumcitrat wurde zu 4,5 ml Blut einer Ratte zugesetzt und das Plasma erhalten. Zu Anteilen von 2,0 ml des Plasmas wurden die Substanz von Beispiel 6 (Präparat aus Schweinelunge), Heparin und Dextransulfat jeweils in den in Tabelle 7 aufgeführten Mengen zugegeben. Anschließend wurden 0,1 ml einer 0,025 m-CaCb-Salzlösung zur Koagulierung der Blutprobe zugegeben. Die zur Koagulierung notwendige Zeit ist als Ergebnis in der Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7	O	Koagulierzeit	(Sekunden)	Dextran
Menge	0,3	Substanz	Heparin	sulfat
(ug)	0,5	nach Bei
	1	spiel 6		58
	10	58	58	62
	57	145	61
100	61	168	117
	61	285	172
1000	62	keine Koa
5 000		gulierung	keine Koa
10 000	60	desgl.	gulierung
			desgl.
83	desgl.	desgl.
119	desgl.	desgl.
164	desgl.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer antilipämischen Substanz aus Säugetierorganen, dadurch gekennzeichnet, daß man Lunge, Leber, Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Dickdarm, Dünndarm, Magen, Gehirn, Muskel oder Blut eines Säugetieres unter Zusatz von Wasser homogenisiert, dann 18 bis 24 Stunden bei 20 bis 40⁰C autolysiert, im Autolysat einen pH-Wert von 4 bis 11, einstellt mit Wasser

10 extrahiert, die wäßrige Lösung dialysiert, die zurückbleibende Lösung enteiweißt, erneut dialysiert, die zurückbleibende Lösung nach Konzentrieren mit einem organischen Lösungsmittel versetzt und den entstandenen Niederschlag abtrennt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die autolysierte Substanz bei einem pH-Wert von 8 bis 9,5 mit Wasser extrahiert