DE2113119A1

DE2113119A1 - Verfahren zur Reinigung von Enzymen

Info

Publication number: DE2113119A1
Application number: DE19712113119
Authority: DE
Inventors: Pierre Barthelemy; Denise Hasbiss; Lucien Penasse
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1970-03-23
Filing date: 1971-03-18
Publication date: 1971-10-14
Also published as: US3741872A; SE371445B; SU455546A3; CA940071A; GB1339350A; NL7103453A; FR2081581B1; FR2081581A1

Description

PATENTANWÄLTE

POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHAUSER

8 MÜNCHEN 2,

1388/D
95/Si

EOUSSEL UCLAF, Paris 7e / Prankreich

Verfahren zur Reinigung von Enzymen

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Enzymen.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Reinigung von Enzymen der Art Asparaginase und insbesondere der Art L-Asparaginase.

Man weiß, daß die L-Asparaginase, die aus Serratia marcesans und Escherichia CoIi isoliert wurde, eine starke antineoplasische Wirkung besitzt.

Man weiß auch, daß es notwendig ist, daß die L-Asparaginase, die die gewünschte enzymatisch^ Aktivität besitzt, von großer Reinheit sein muß, um eine wirksame Behandlung ohne Nebenwirkungen, wie eine Sensibilisierung oder eine Allergie, zu ermöglichen.

So kann man durch Saulenchromatograpie oder durch fraktionierte Ausfällung mit einem Mineralsalz, wie Ammoniumsulfat, eine derartige Reinigung bewirken, jedoch besitzen diese Verfahren keine industrielle Verwertbarkeit und hinzu kommt, daß im Fall der Verwendung eines Mineralsalzes, man sich mit dem Problem der Ab-

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trennung von Mineralspuren aus dem gereinigten Produkt belastet, was eine zusätzliche Dialysestufe erforderlich, macht.

Han kann die Reinigung der L-Asparaginase auch durch Erhitzen einer enzymatisehen Lösung während 10 Minuten auf eine Temperatur von 55°C erzielen und dieses Verfahren,das in der französischen Patentschrift Nr. 1 585 246 beschrieben ist, ermöglicht die Denaturierung eines großen Teiles der anfänglich vorhandenen Proteine und aufgrund dieser Tatsache die Ausfällung der letzteren, die man auf diese V/eise leicht entfernen kann.

Obwohl dieses Verfahren aufgrund der technischen Einfachheit interessant ist, gestattet es nicht eine L-Asparaginase mit einer genügenden Reinheit zu. erhalten aufgrund der Tatsache, daß es schwierig ist, eine homogene Temperatur des Milieus aufrechtzuerhalten.

Es wurde nun ein Verfahren zur Reinigung von Enzymen des Typs Asparaginase und insbesondere der L-Asparaginase gefunden, durch das diese Nachteile beseitigt werden können.

Dieses Verfahren besteht im wesentlichen darin, daß man das Enzym, das einer vorherigen Reinigung durch bekannte Verfahrensweisen unterzogen wurde, durch Zusatz einer Mischung von Glycerin und Äthylalkohol in einer wässrigen Enzymlösung ausfällt.

Ein derartiges Verfahren gestattet die langsame und progressive Ausfällung, die insbesondere die Reinigung des Enzymes und die Bildung von Kristallen unterstützt.

Die Reinigung nach diesem Verfahren kann bei einer Temperatur zwischen O⁰C und 25°C durchgeführt werden.

Weiterhin kann sich das verwendete Verhältnis von Glycerin zu Äthylalkohol zwischen 1 und 3 Teilen Glycerin pro 5 Teile Äthylalkohol erstrecken.

In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man vorzugsweise

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1,5 "bis 2 Teile Glycerin pro 5 Teile Äthylalkohol und rc an gibt die organischen Lösungsmittel in zwei »Schritten zu, d. h. in einem ersten Schritt Glycerin und darm in einen zweiten Schritt Äthylalkohol.

Die wäßrige Ausgangs-L-Asparaginaselösung kann durch Jedes der bekannten Verfahren hergestellt .werden» Es versteht sich, dass einerseits die Reinigung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl auf L-Asparaginase-Lösung mit hoher enzymatischer Aktivität als auch auf Lösungen sehr geringen Aktivität angewandt werden kann und andererseits ist es im Fall der Verwendung einer enzymarmen Lösung möglich, das erfindungsgemäße Verfahren mehrfach anzuwenden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

Man gibt bei einer Temperatur zwischen O⁰C und 5°C unter Rühren zu 5 ecm einer wäßrigen rohen L-Asparaginase-Lösung mit einem pH-Wert von 5>5 die 1785 U.I. £internationale Einheiten) L-Asparaginase und 19 mg Proteine enthält (d.h. eine spezifische Aktivität von °Λ U.I./mg aufweist) 1,5 ecm Glycerin und dann 5 ecm Äthylalkohol.

Man rührt noch während 2 Stunden und 30 Minuten bei der gleichen Temperatur und isoliert dann den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren. Die Analyse des erhaltenen Niederschlages wird nach der Auflösung des Niederschlages in Wasser durchgeführt.

Man erhält so eine Mischung, die 1400 U.I.-L-Asparaginase und 11 mg Proteine enthält (d.h. eine spezifische Aktivität von 127 U.I./mg aufweist). Ausbeute: 78,5 %·

Beispiel 2 Zu 5 ecm einer wäßrigen Lösung von roher L-Asparaginase mit ei-

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nem pH-Wert von 5?5> die 5255 U.I.-Asparaginase und 40,8 mg Proteine enthält (d,h. eine spezifische Aktivität von 128,5 U.I./mg aufweist), die in einem Eiswasser gekühlt wird, gibt man nacheinander unter Eühren 2 ecm Glycerin und dann 5 ecm Äthanol. Man hält dann noch während 5 Minuten unter Eühren und lässt dann über Haeht bei einer Temperatur zwischen 0⁰C und 5°C stehen».Dann isoliert man den gebildeten niederschlag, durch Zentrifugieren und löst ihn zur Analyse in Wasser. Man erhält so eine Lösung-, die 5100 U.I. L-Asparaginase und 23»2 mg Proteine enthält (d.h. eine spezifische Aktivität von 220 ΐΓ.Ι./mg aufweist). Ausbeuten 97»2 %.

Beispiel 5

Ausgehend von dem gleichen Ausgangsmaterial, das in Beispiel 2 verwendet wurde» und indem man unter den gleichen Bedingungen bei 20°C arbeitet, erhält man ein in Form von feinen Kädeichen kristallisiertes Produkt, das 5130 U.I. L-Asparaginase und 24,8 mg Proteine enthält (d.h. eine spezifische Aktivität von 207 U.I./mg aufweist). Ausbeute: 97,7 %.

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Claims

Patentansprüche

Λ. Verfahren zur Reinigung von Enzymen der Asparaginaseart, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym, das einer vorherigen Reinigung unterworfen wurde, durch Zugabe von Glycerin und Äthylalkohol aus einer wäßrigen Enzymlösung ausfällt.
2. Verfahren gemäß Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die L-Asparaginase, die einer vorhergehenden Reinigung unterzogen wurde, durch Zugabe von Glycerin und Äthylalkohol aus einer wäßrigen L-Asparaginase-Lösung in der Nähe des iso-· elektrischen Punktes ausfällt.
3- Verfahren gemäß den Ansprüchen Λ oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zugabe des Glycerins und des Äthylalkohols bei einer Temperatur zwischen O⁰C und 25°C bewirkt.
4-, Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Glycerin zu Äthylalkohol zwischen 1 und 3 Teilen Glycerin pro 5 Teile Äthylalkohol sich erstreckt.
5« Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man nacheinander in die wäßrige L-Asparaginase-Lösung Glycerin und dann Äthylakohol zugibt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung bei einem pH-Wert in der Nähe von 5 erfolgt.

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