DE2046576C3 - Verfahren zur Abtrennung von Zitronensäure aus einem Gemisch mit (+)-Isozitronensäure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Zitronensäure als Tricalciumzitrat von (+)-lsozitronensäure.

Für Zitroner.säure besteht ein großer Bedarf als Säuerungsmin«^ Diese Säure wird durch Kultiviening bestimmter Pilzgattungen gebildet und aus der Kulturbrühe durch Ausfällung als Calciummonohydrogenzitrat oder Tricalciumzitrat isoliert.

Die belgische Patentschrift 7 25 417 beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Großherstellung von Zitronensäure und (+)-Isozitronensäure mit einer bestimmten Hefe. Bei diesem Verfahren wird jedoch gleichzeitig eine erhebliche Menge (+)-Isozitronensäure angehäuft, die durch eine Reihe von umständlichen VerfahrensschriMen einschließlich Säulenchromatographie, die sehr zeitraubend sind und das Verfahren komplizieren, von der ZiUonensfeare abgetrennt werden muß.

In dem Bemühen, den Nachteil dieses Verfahrens auszuschalten, gelangte die Anmelderin zu folgenden Feststellungen:

1) Eine gewisse Hefe häuft Zitronensäure und (+)-Isozitronensäure in Form ihrer wasserlöslichen Salze an, wenn sie in einem Medium, das mit einem geeigneten pH-Regler bei pH 3 bis 8 gehalten wird, bebrütet wird.

2) Als pH-Regler eignen sich für diesen Zweck Ammoniak und Ammoniumhydroxid.

3) Wenn eine bestimmte Menge einer anorganischen Calciumverbindung (z. B. Calciumhydroxid) der hierbei erhaltenen Kulturbrühe nach der Entfernung der Hefezellen zugesetzt wird, wird nur Zitronensäure als Tricalciumzitrat ausgefällt, während ( + )-Isozitronensäure in der zellenfreien Flüssigkeit gelöst bleibt.

Diese Feststellungen sind aus den nachstehend erläuterten Gründen sehr überraschend. Die Erfindung, der diese Feststellungen zugrunde liegen, ist besonders vorteilhaft für die Großherstellung.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Abtrennung von Zitronensäure aus einem Gemisch mit (-l-)-Isozitronensäure durch Ausfällung als Tricalciumzitrat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf eine wäßrige Lösung von Salzen der Zitronensäure und {+)-Isezitremensäure 0,4 bis 0,8 Äquivalent einer anorganischen Calciumverbindung, bezogen auf die Zitronensäure, einwirken läßt.

Die wäßrige Lösung, die wasserlösliche Salze von Zitronensäure und (-f)-Isozitronensäure enthält, wird nach dem in der belgischen Patentschrift 7 25 417 beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines geeigneten pH-Reglers erhalten, der die Kulturbrühe bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 8 hält und gleichzeitig wasserlösliche Salze mit Zitronensäure und (+)-Isozitronensäure büdet

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine

anorganische Calciumverbindung diesem wäßrigen Medium in einer Menge von etwa 0,4 bis 0,8 Äquivalent, bezogen auf Zitronensäure, zugesetzt, wodurch die Zitronensäure in Form von Tricalciumzitrat ausgefällt wird.

Tricalciumzitrat ist nur sehr schwer löslich und kann

ίο in 100 g Wasser bei 25°C nur bis zu einer Konzentration von 0,096 g gelöst werden. Andererseits ist nach einem von der Anmelderin durchgeführten Versuch Tricalcium-(-l-)-isozitrat ebenfalls bis zu einer Menge von 0,73 g in 100 g Wasser löslich. Zunächst wurde es daher von der Anmelderin als sehr schwierig angesehen, die Tricalciumsalze von Zitronensäure und (+)-Isozitronensäure, die bei Zusatz einer anorganischen Calciumverbindung ausgefällt werden, zu trennen. Bei Zusatz einer anorganischen Calciumverbindung in einer Menge, die dem gebildeten Air.rr.oniumzitrat äquivalent ist, werden Tricalciumzitrat und Tricalcium(+)-isozitrat gleichzeitig ausgefällt, so daß sie nicht voneinander trennbar sind.

Wenn jedoch die Menge der anorganischen Calciumverbindung im Bereich von etwa 0,4 bis 0,8 Äquivalent des Ammoniumzitrat liegt, wird Tricalciumzitrat ohne Rücksicht auf das Verhältnis der im wäßrigen Medium gelösten Salze von Zitronensäure und (-t-)-lsozitronensäure in äußerst reiner Form ausgefällt, während es durch Tricalcium( + )-isozitrat praktisch nicht verunreinigt ist Es wurde ferner gefunden, daß kein Ammonium-Calcium-Doppelsalz von Zitronensäure und (+)-lsozitronensäure ausgefällt wird. Angesichts des Mengenverhältnisses der anorganischen Calciumverbindung zum Ammoniumzitrat im wäßrigen Medium ist dies eine völlig überraschende Feststellung, und es wird angenommen, daß eine völlig einzigartige Reaktion stattfindet. Dagegen wird das Ammopium-CrlcUim-Doppelsalz von Zitronensäure zusätzlich zum Tricalciumzitrat ausgefällt, wenn der Anteil der anorganischen Calciumverbindung geringer ist als etwa 0,4 Äquivalent Ammoniumzitrat Diese Beziehungen sind in der Abbildung dargestellt, in der die Linien die folgenden Bedeutungen haben:

Im wäßrigen Medium (ml) gelöste
Zitronensäure/(+)-Isozitronensäure

Verunreinigung des ausgefällten Tricalciumzitrats durch Ammoniak und (-t-)-Isozitronensäure

Ammoniak (+)-Iso-

zitronensäure

70 mg/ 30 mg · · O O

70 mg/ 70 mg ■ ■ D D

70 mg/165 mg ▲ ▲ Δ Δ

Ammoniumcalciumzitrat bildet Ammoniumsulfat, wenn Schwefelsäure in einer anschließenden Reinigungsstufe zur Umwandlung des Zitrats in die entsprechende freie Säure zugesetzt wird. Das hierbei gebildete Ammoniumsalz ist für das Verfahren nachteilig, da es ebenso leicht löslich ist wie Zitronensäure und von der letzteren nicht abgetrennt werden kann.

Dagegen bildet Tricalciumzitrat bei Zusatz von Schwefelsäure wasserunlösliches Calciumsulfat mit dem Ergebnis, daß sich die Zitronensäure leicht in freier Form abtrennen läßt. Es ist daher technisch sehr wichtig, die Zitronensäure in Form des reinen Tricalciumsalzes zu gewinnen. Wie die Abbildung deutlich zeigt, kann im

wesentlichen reines Tricalciumzitrat nur erhalten werden, wenn etwa 0,4 bis 0,8 Äquivalent einer anorganischen Calciumverbindung dem zellenfreien Medium, bezogen auf die im Medium vorhandene Zitronensäure, zugesetzt werden.

Die Bildung von Tricalciumzitrat kann beschleunigt werden, indem auf eine Temperatur erhitzt wird, die zweckmäßig wenigstens 6O⁰C beträgt Durch Wiederholung des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist es möglich, im wesentlichen das gesamte Ammoniumzitrat aus der Kulturbrühe in Form von Tricalciumiltrat zu isolieren.

Als anorganisches Calciumsalz eignen sich beispielsweise Calciumhydroxid, gebrannter Kalk, Calciumcarbonat und Calciumchlorid.

Das Tricalciumzitrat kann zur Umwandlung in freie Zitronensäure mit Schwefelsäure behandelt werden.

Andererseits läßt sich die (+)-Isozitronensäure nach der Gewinnung des Tricalciumzitrats durch die folgenden Maßnahmen leicht von der Mutterlauge isolieren:

und getrocknet Auf die oben beschriebene Weise wird 1,0 Gew.-Teil Monokalium(+)-isozitrat erhalten.

Die Mutterlauge wird mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt, wobei das Monokaliumzitrat in der Fiüssigkeit in Ammoniumzitrat umgewandelt wird, das bei Zusatz einer anorganischen Calciumverbindung als Calciumsalz von Zitronensäure ausgefällt wird.

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5; Ausfällung s!s Tncaiv;iurri(-i-)-i5öziiiai durch Zugabe eines anorganischen Calciumsalzes .m Oberschuß.

2) Entfernung des Calciums durch Zusatz von Schwefelsäure und gegebenenfalls

3) erneute Ausfällung als Kalium(-i-)-isozitrat durch Zusatz einer anorganischen Kaliumverbindung.

In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteiie zu Raumteiien wie Gramm zu Kubikzentimeter.

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Beispiel 2

Zu 100 Raumteiien der gemäß Beispiel 1 erhaltenen zellenfreien Flüssigkeit, die 83 mg Zitronensäure und 18 mg (+)-Isozitronensäure pro ml enthält, werden 4,4 Gew.-Teile Calciumcarbonat (0,68 Äquivalente, bezogen auf Zitronensäure) gegeben. Die Reaktion läßt man 2 Stunden bei 85 bis 90⁰C unter leicht vermindertem Druck (500 mm Hg) stattfinden. Das gebildete Calciumsalz wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei 7,2 Gew.-Teile. eines weißen Pulvers erhalten wurden. Die Analyse des Pulvers ergibt die Anwesenheit von 21 % Calcium, 67% Citronensäure und 11% Wasser. Außer diesen Bestandteile η enthält das Pulver nicht mehr als je 0,5% Ammoniak und (+)-Isozitronensäure.

Auf die in Beispiel 1 beschriebenen Weise wird die (+)-Iso?itronensäure aus der Mutterlauge isoliert

Beispiel 3

Candida lipolytica (IFO 1437) wird in einem Medium, das 4% n-Hexadecan, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ und 0,?% Hefeextrakt enthält, 72 Stunden bei 28° C bebrütet, wobei das Medium mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt wird.

Zu 200 Raumteilen Filtrat, das nach Entfernung der Hefezellen aus der Kulturbrühe erhalten wird und

Raumteiien eines Filtrats, das durch Entfernung der Hefezellen von der Kulturbrühe erhalten wird und 83 mg Zitronensäure und 18 mg (+)-Isozitronensäure

Man läßt die Reaktion 2 Stunden bei 85 bis 90° C vonstatten gehen. Nach dieser Zeit wird das ausgefällte Calciumsalz abfiltriert, mit Wasser gewaschen und

Beispiel Candida sp. (I FO 1464) wird in einem Medium, das 8%

n-Hexadecan, 03% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05%

MgSO₄ und 50 yl\ Vitamin B_f enthält, 72 Stunden bei

28°C bebrütet, wobei das Medium von Zeit zu Zeit mit 35 34 mg Zitronensäure und 23 mg (-f-)-Isozitronensäure

Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt wird Zu 100 _pro m! enthält, werden 2ß Gew.-Teile Calciumhydroxid

(0,71 Äquivalent der Zitronensäure) gegeben. Die Reaktion läßt man 2 Stunden bei 85 bis 90⁰C stattfiiiden. _ .. . . Nach dieser Zeit wird das ausgefällte Calciumsalz

pro ml enthk.t, werden 33 Gew.-Teile Calciumhydroxid 40 abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet

(0,67 Äquivalent, bezogen auf Zitronensäure) gegeben. Hierbei werden 6,1 Gew.-Teile eines weißen Pulvers

erhalten, dessen Analyse die Anwesenheit von 21% Calcium, 67% Zitronensäure und 11% Wassst ergibt Das Pulver enthäii weniger als je 0,2% Ammoniak und

getrocknet Hierbei werden 73 Gew.-Teile eines weißen 45 (+)-Isozitronensäure.

Pulvers erhalten. Die Analyse dieses Pulvers ergibt die Zur Isolierung der (+)-Isozitronensäure wird die Anwesenheit von 213% Calcium, 67,1% Zitronensäure

und 11 % Wasser. Außer diesen Bestandteilen enthält das Pulver je 0,5% Ammoniak und (+)-Isozitronensäu-

re. Genau das gleiche Ergebnis wird erhalten, wenn eine äquivalente Menge gebrannter Kalk an Stelle von

Calciumhydroxid zugesetzt wird. Zur Isolierung der ( + )-Isozitronensäure von der in

der beschriebenen Weise erhaltenen Mutterlauge 55 mit Ammoniak bei piv 6,5 gehalten.

werden 2,0 Gew.-Teile Calciumhydroxid zugesetzt, Zu 100 Raumteilen Filtrat, das durch Entfernung der

Hefezellen von der Kulturbrühe erhalten wird und 36 mg Zitroneneäfire und 33 mg (-f-)-Isozitronensäure pro ml enthält, werden 1,6 Gew.-Teile Calciumhydroxid (0,76 Äquivalent der Zitronensäure) gegeben. Die Reaktion läßt man 2 Stunden bei 85 bis 90° C stattfinden, worauf das ausgefällte Calciumsalz abfiitriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Hierbei werden 3JB Gew.-Tei'? eines weißen Pulvers erhalten.

auf pH 3,5 eingeswMt und bei niedriger Temperatur es Die Analyse dieses Pulvers ergibt die Anwesenheit von

eingeengt, wobei sich Monokalium(+)-isozitrat ab- 21% Calcium, 67% Zitronensäure und 11% Wasser.

scheidet, während Monokaliumzitrat gelöst bleibt Nach Außer diesen Bestandteilen enthält das Pulver 0,12%

Abkühlung wird das Monokalium( + )-isozitrat isoliert Ammoniak und 0,20% (+)-Jsozitronensäure. Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

50 Mutterlauge der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlung unterworfen.

Beispiel 4

Candida sp. (IFO 1455) wird in einem Medium, das 14% Glucose, 0,1% NH₄Cl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MfSC, · 7 H₂O und 03% Maisquellwasser enthält, 72 Stunden bei 28° C bebrütet. Das Medium wird hierbei

worauf man die Reaktion 2 Stunden bei 85 bis 90⁰C . stattfinden läßt Hierbei bildet sich das Calciumsalz der ( + )-lsozitronensäurekomponente und der restlichen Zitronensäure.

Die Fällung wird heiß abfiltriert, mit heißem Wasser gewaschen und mit Schwefelsäure behandelt, wobei eine Lösung von (+ )-Isozitronensäure und Zitronensäure erhalten wird. Die Lösung wird mit Kaliumhydroxid

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Abtrennung von Zitronensäure aus einem Gemisch mit (-t-)-Isozitronensäure durch Ausfällung als Tricalciumzitrat, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine wäßrige Lösung von Salzen der Zitronensäure und (+)-lsozitronensäure 0,4 bis 0.8 Äquivalent einer anorganischen Calciumverbindung, bezogen auf die Zitronensäure, einwirken läßt