DE2016729A1

DE2016729A1 -

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Publication number: DE2016729A1
Application number: DE19702016729
Authority: DE
Priority date: 1969-02-10
Filing date: 1970-04-08
Publication date: 1970-10-15
Also published as: FR2043161A5; DE2005362B2; DE2005362A1; GB1276006A; US3751898A; NL7004923A; GB1276066A

Description

Arthur Guinness Son & Company Ltd. D u b 1 i η/Irland

Enzympräparate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Enzymen bzw. Enzympräparaten, die durch kovalente bindung an polymere Ü-itter unlöslich gemacht sind. Die Erfindung bezieht sich dabei insbesondere auf die .Behandlung von Enzymen, um sie in i'Orm eines Ulms oder einer dünnen Schicht, in i?orm eines Pulvers oder Niederschlages bzw. Präzipitates, oder in verschiedenen formen in Verbindung mit einer Oberflächenbeschichtung einschließlich Partikel oder Pellets unlöslich zu machen.

Enzyme sind in technischer und v/irtschaftlicher Hinsicht vielfältig einsetzbar bzw. anwendbar und werden normalerweise entweder in Lösung oder in einer unlöslichen ü'orm angewendet, wobei sie in dieser zuletzt genannten Porin zu einem späteren Zeitpunkt aus der Reaktionsmischung entfernt v/erden müssen. Im allgemeinen wird das Enzympräparat nur einmal benutzt und kann nicht für die weitere Verwendung wieder-

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gewonnen, v/erden. Die Abtrennung des Enzympräparats ist weiterhin häufig ein schwieriger'und kostspieliger Prozeß.

Der Erfindung liegt die Aufgabe augrunde, ein in technischer und wirtschaftlicher Hinsicht einfaches und zuverlässiges verfahren zur Herstellung eines unlöslichen Enzymkatalysators zu schaffen, der ein Enzym enthält, das kovalent mit einem Poly- (Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer verkettet ist.

Das erfindungsgemäße verfahren zur Herstellung von unlöslichen Enzymen in aktiver bzw. reaktionsfähiger i-'orm ist dadurch gekennzeicnnet, daß das Ilischpolymerisat mit einer Enzyalösung behandelt wird, und daß dann der Enzym-Polymer-üomplex quervernetzt wird und/oder die verbleibenden reaktionsfähigen chemischen Gruppen neutralisiert werden.

Das polymere iiaterial kann in verschiedener Vfeise behandelt werden, um eine geeignete Oberflächenanordnung bzw. -verteilung der reaktionsfähigen Gruppen vor dem Anlagern des Enzyms zu erhalten:

1. Es kann in ü'orm eines i'ilmes oder einer dünngen Schicht mit großer Oberfläche abgelagert bzw. abgesetzt werden;

2. es kann mit Chemikalien behandelt v/erden, um eine teilweise Quervernetzung bzw. Querverbindung der polymeren iiolelaile zu bewirken, woraus ein unlösliches modifiziertes Polymer resultiert, welches mit Enzymen noch reagiert;

3. es kann physikalisch in ein inertes Ilaterial eingelagert bzw. eingeschlossen werden, beispielsweise ^Jachs, so daß die reaktionsfähigen chemischen Gruppen an der Oberfläche , mit Enzymen reagieren.

Die Erfindung betrifft insbesondere drei /erfahren zur Herstellung von unslöslichen Enzymen in aktiver JL¹Or¹Jj und zwar 1. in ü'ilmen, 2. in Niederschlägen bzw. Präsipitaten und 3. gebunden an polymeres Material, welches in Wachs einge-

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schlössen bzw. eingelagert 1st. Bnzym-Polymer-ffilme

Das Verfahren zur Herstellung von filmen "besteht darin, daß Poly-(Metbylvinylather/MaleinsäureanhydridJ-Material in einem lösungsmittel aufzulösen und eine starre Unterlage mit der Lösung des Mipchpolymerisats zu beschichten, den daraus resultierenden Miscbpolymerisatfilm zu trocknen, den Kischpolyaerisatfilm mit einer Lösung eines Enzyms zu behandeln, und den behandelten 3?ilm und die Unterlage nacheinander mit Arnmoniumbicarbonatlösung und Wasser zu waschen.

Der ÄLsebpolymerisatfilm kann, falls erwünscht, vor oder nach der Behandlung mit dem Enzym mit einer Lösung eines Quervernetzangsaittels bebandelt werden.

Das Mischpolymerisat kann in form eines jffilmes auf der erwünschten Oberfläche abgelagert bzw. niedergeschlagen v/erden, indes eine Lösung entweder in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel benutzt wird.

Das Mischpolymerisat kann dann mit einer Lösung des jeweils erwünschten Enzyms bei einem bestimmten pH-Wert und einer bestimmten !Eemperatur bebandelt werden, um die kovalente Bindung zu erbalten bzw. zu gewährleisten. Nach einer geeigneten Behandlungszeit kann überschüssiges Enzym entfernt werden, und der ISnzym-Pplymer-Film kann mit geeigneten Reagenzien bebandelt werden, um eine Querverbindung bzw. Quervernetsung der polymeren netten und/oder den notwendigen ITeutralisierungsgrad der verbleibenden, reaktionsfähigen, chemischen Gruppen zu erbalten bzw. zu bewirken.

Es können verschiedene difunktionale oder polyfunktionale Verbindungen benutzt werden, U3 diese Querverbindung z\i bewirken, z.3. Glykole, Diamine und Verbindungen, welche eine

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BAD

i'hiol- und eine Aminogruppe enthalten, wobei die Wahl des jeweiligen Qucrvernetzungsmittel die chemische Natur des erhaltenen Enzymfilmes beeinflußt. Die Auswahl des jeweils geeigneten Quervernetzungsmittels hängt von den Eigenschaften des Enzyms ab, das behandelt bzw. fixiert werden soll, beispielsweise seinem optimalen pH-Wert, dem Bedarf an 'fhiol-Gruppen, [Temperaturbeständigkeit und die ßberischen Anforderungen, v/obei zu berücksichtigen ist, daß für jedes Enzym diese Faktoren unterschiedlich sind, wenn diese Enzyme an Unterlagen bzw. 'i'rägerstoffe gebunden werden, die aus unterschiedlichen V/er kstof fen oder auf verschiedene Weise hergestellt sind.

Die 1'¹UTIe können auch derart hergestellt werden, daß die Chemikalien in unterschiedlicher Reihenfolge benutzt werden. So kann beispielsweise in bestimmtem Umfang eine Querverbindung bzw. Quervernetzung zugelassen v/erden, bevor das Enzym zugesetzt wird. Ein PiIm kann alternativ auch aus einer Lösung gemacht werden, welche das Polymer enthält, das mit dem Enzym reagiert hat, wobei sich erst dann die Quervernetzung bzw. Querverbindung dieses Pilmes anschließt.

Der Polymer-(Hethylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-',ierkstoff kann eines der Harze GAHi¹IItJZ AN 119, All 1*9, Ali 149 oder AH 169 sein, welches von der General Aniline ji'ilm Co. auf den ,Markt gebracht wird.

Die Ji'ilme können sich aus organischen Lösungsmitteln, wie z.±J. Aceton niederschlagen bzw. absetzen. In einigen .Fällen können dem organischen Lösungsmittel Weichmacher wie z.i3. Glyzerin oder Äthylenglykol zugesetzt v/erden.

Obwohl der Jiilm bei Raumtemperatur getrocknet werden kann, ist es vorteilhaft, den J?ilsn vor oder nach dem Zusatz des Quervernetzungsmittel, jedoch in Abwesenheit des Enzyms, auf etwa

100 ⁰G zu erwärmen.

B^D ORIGINAL

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Der von dem 'irägerstoff getragene jj'ilm kann auch vor der !Behandlung mit dem Enzym durch Erwärmen in siedendem Xylol oder durch unter Vakuum erfolgender Erwärmung auf 130 ⁰G behandelt werden. Durch diese beiden Behandlungsarten werden Anhydridgruppen, die durch Wasser zu zweibasischen Säuregruppen hydrolisiert worden sind, entweder aus der Atmosphäre oder aus den zur Herstellung der l?ilme benutzten Lösungsmittel regeneriert.

Die !''urne können auch aus wässrigen Lösungen abgelagert bzw. niedergeschlagen werden. In unerwärmten Lösungen ist die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Anhydride zu Säuren verhältnismäßig gering, Lösungen in Puffern - beispielsweise 0,2M Kalium-Phosphat mit einem pH-Wert 7,6 - können daher hergestellt werden, welche bei der Bildung eines i'i^mes noch genügend reaktionsfähige G-ruppen enthalten, um das Enzym in einer unlöslichen IJOrm zu binden.

Ein bevorzugtes abgewandeltes Verfahren besteht jedoch darin, das Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in H₂O zu lösen, so daß es vollständig hydrolisiert wird. Die Poly-(Methylvinyläther/i'Ialeinsäureynhydridj-Lösung wird dann dazu benutzt, eine geeignete Fläche zu beschichten bzw. zu überziehen. Die Anhydridgruppen werden regeneriert, indem die beschichtete Oberfläche unter Vakuum bei 130 ⁰O mehrere Stunden lang erwärmt wird. Der resultierende IPiIm wird dann mit dem jeweiligen Enzym und den Quervernetzungsmittein behandelt. Das Verfahren hängt von der Proteinart der Enzyme ab und kann mit verschiedenen Enzymen oder mit Enzymgemischen benutzt v/erden.

Es lassen sich verschiedene Enzyme binden bzw. anlagern, einschließlich Papain, Alcalase, Pancreatin, Bakterien-Proteinase, i'rypsin, Chymotrypsin, Pronase, MDB, Pepsin, Asparaginase, Amyloglukosidase, Oellulase^-Amylase, l'akadiastasej/ö-Ü-lukosidase, Ilexokinase, Pyrophosphatase, Gatalase und Xanthinoxi- · dase. Die Enzyme werden gewöhnlich in einer Konzentration

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von 0,5 - ?-00 mg/ml benutzt, vorzugsweise in einer konzentration von 0,5 - 50 mg/ml, insbesondere 30 mg/ml, in Puffern mit pH-'./erten von 3 - 9, vorzugsweise 0,2M Phosphat mit einem ρίΙ-7/ert von 7, S. Die Enzymlösung wird mit dem .Polymerfilm bei einer i'empcratur von 0 bis 20 ⁰C, vorzugsweise 4 ⁰G, zwisohen 30 Minuten und 16 Stunden in Kontakt gelassen. Die üinzymlösung kann dann entfernt und durch eine lösung eines geeigneten Quervernetzungsmittels ersetzt werden.

Jis ist vorteilhaft, den fixierten .»'ilm mit einer 0,1M Ammonium-Bicarbonatlösung zu waschen, um die freien azidischen ü-ruppen zu neutralisieren, die aus dem Ilaleinsäureanhydrid entstanden sind.

Als Quervernetzungsmittel lassen sich vorzugsweise folgende stoffe verwenden: ilthylenglykol, Propylenglykol, Glyzerin, Polyäthylenglykol, Hexamethylendiamin, Diäthylentriamin, i'riäthylentetramin, l'etraätbylenpentamin, H-(3-amiripropyl,)-diäthanolamin, Hydrazin, Arginin, Cfuanidin, Lirea, Cystein, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und öarboxymethylzellulose.

Die Querverbindung bzw. Quervernetzung kann während Zeiträumen, die zwischen 5 Hinuten und 16 Stunden variieren, bei 4 ⁰O bis 20 ü durchgeführt werden. Überschüssiges Quervernetzungsmittel wird entfernt und der i'ilm wird mit destilliertem ''asser gut gewaschen.

Die Verwendungsmethode des J&izymfilms hängt von der Ji'orm ab, in der er hergestellt ist, etwa gemäß folgenden Beispielen: '

1. ±Jr wird als Auskleidung in einem Behälter benutzt, v/elcher das zu behandelnde tiaterial enthält;

2. er wird als Auskleidung einer Leitung bzw. eines itohres benutzt, durch das das zu behandelnde iiaterial strömt;

3. er wird als Beschickung oder überzug auf iVogen oder jjahnen

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beispielsweise t?ewebebahnen benutzt, die in das zu behandelnde Material getaucht und anschliessend wieder herausgenommen werden;

4. er wird zum !Beschichten bzw. überziehen eines Gitters oder groben Filters benutzt, durch das das au behandelnde haterial geschickt wird.

Die benutzung mehrerer, unterschiedlicher Enzym-Filme in aufeinanderfolgender Reihenfolge gestattet es, das Ausgangsmaterial einer Anzahl aufeinanderfolgender JAir.ymreaktionen :~»u unterwerfen, da ,jeder Film auf verschiedene "Weise hergestellt sein kann, wobei jedes En:;ym unter optimalen Bedingungen ohne Einstellung auf das der behandlung unterworfene iiaterial benutzt werden kann. Alternativ kann jedoch auch eine Mischung von verschiedenen Enzymen an ein und demselben Film gebunden werden, um entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend unterschiedliche Reaktionen :~u bewirken.

Die Enzymfilme können leicht aus dem lieaktionsgeaiisch abgetrennt und wiederholt oder kontinuierlich v/ieder verwendet werden.

Die Verteilung des Enzyms in Form eines sied über eine große Oberfläche erstreckenden dünnen Films ermöglicht einen außerordentlich wirtschaftlichen und wirkungsvollen Einsatz der Enzyme.

Ee folgt nunmehr in beispielhafter Weise eine Beschreibung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, um unlösliche Enaymfilme herzustellen.

Me folgende x'abelle zeigt an, wie verschiedene fixierte Enzymfiltne hergestellt worden sind. Das jeweils genannte Polymer wurde in dem Lösungsmittel gelöst, um die erwünschte konzentration ssu ergeben, welche sich jeweils auf das Gewicht je Volumeneinheit bezieht.

Di· Verwendung von in Klammern gesetzten Ziffern bezieht sich auf alternative Behandlungsmethoden, und es wurden alle rnög-

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lichen Kombinationen der alternativen Bedingungen, welche in irgendeinem Abschnitt der Tabelle beschrieben sind, benutzt.

Der feste Trägerstoff wurde gewöhnliqh durch Eintauchen beschichtet bzw. überzogen, wobei jedoch in einigen Fällen, insbesondere bei Irägerstoffen aus Metall, Glas und Kunststoff der Überzug bzw. die Beschichtung durch Aufstreichen mit einem Glasstab oder einer Bürste hergestellt wurde.

Der Polymerfilm wurde dann entweder bei Raumtemperatur (20 ⁰OJ oder bei der angegebenen Temperatur während des angegebenen Zeitraumes getrocknet. Das Polymer wurde mit Enzym behandelt, indem es für die jeweils geeignete Zeitdauer mit der Enzymlösung bedeckt wurde. Die Enzymlösung wurde gelegentlich geschüttelt, wenn die Behandlung mit Enzym weniger als 16 Stunden betrug.

Nach der Behandlung mit Enzym wurden die Unterlage und der jfilm mit O,1M NH.H00-, und anschliessend mit Wasser gewaschen.

Wenn die Querverbindung bzw. Quervernetzung nach der Enzymbehandlung durchgeführt wurde, wurde der Enzymfilm trocken geschüttelt und unter den angegebenen Bedingungen in das Quervernetzungsmittel eingetaucht. Nach dieser Behandlung wurde das Quervernetzungsmittel mit Wasser weggewaschen und das fixierte Enzym war für die Verwendung oder zur lagerung bzw. Speicherung fertig.

Wenn die Ververbindiing bzw. Quervernetzung vor der Enzymbehandlung erfolgte, waren die Bedingungen so, wie es jeweils angegeben ist.

In allen Pollen, in denen das Lösungsmittel nicht namentlich genannt ist, wurde die Lösung in O,2M Phosphat mit einem pH-Wert von 7,6 hergestellt.

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Ia den. Beispielen verwendete Warenzeichen

Miracloth

Ohicopee Mills Inc., 1450 Broadway, New York, KT 10018.

Agidex (Glucoaaylasepräparat) Glaxo Laboratories Ltd., Greenford, Middlesex.

Alcalase (Proteinase) Globe Products Ltd., Aecrington.

NDB 3 (Enzym -Stabilisierungsmittel für Brauereizwecke,) Murphy & Sons, St. Albans.

Viledon (Luftfiltergewebe) Bondina Industrial Ltd., Greetland, Halifax, Yorkshire.

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Polymer

Bei	AIT l'yp	.Konzen	Lösungs	iräger-	Irocken-
spiel		tration	mittel	stoff	bedi ndungen
1	119	5*	Aceton	Mira- cloth	20⁰C

O (O OO

Enzym-Behandlung

1) 4-7° Agidex

2) Z⁰Jo Alcalase

5) 0,5% K-aminosäure-

oxydase

4,) 2% ^ -Amy la se

3) O,1$ Asparaginase

6) 0,005^ Oatalase

7) %y> Cellulase

8) Ο,55έ ß-Glucosidase S) Q,51'° Wexokinase

10) 2^c/6 Pancreatin ·

11) 2ⁱ/3 i3acterien-

proteinase

12) 2fo Pyropbosphatase

13) 2>ό i'alcadiastaae H) 0,005?i Xaatbin >-

⁰C

oxidase 16 Std bei 4

Quervernetz ungs-"bedingungen

nicht quervernetzt

Polymer

Bei- AKTjDyp Konzen- lösungs- Iräger- Trocken gplel tratiop. mittel atoxf dl

119

Aceton

Miraolotb

Aceton Miraclotb

Aceton Miracloth

2O⁰C

20⁰O

Enzym-Bebandlung

1) 356 Papain Z) yf» SDB

3) 3# Pepsin

4) 1# Pronase

5) 3$ Papain in 20$ Glyzerin

6) 5% Papain in 4Q# Glyzerin

Querver ne t ζ ungs bedingqngen

nicht quervernetzt

Std. bei 4 0

Papain in HgC
Std. bei 4⁰C

1) nicht quervernetzt

Z) tfo Polyäthylenglycol

ϊ Cystein

3) 4;

Diätbylentriamin

1,5 Std b.

2O⁰C

Papain
Std b. 4⁰C

Diätbylentrianiin

Hydrazinhydrat

Mexamettaylendiamin

Z) 3)

4) V/o Polyvinylalkohol-*

5) 1^ Cystein <*j| 2 Std b. 20° C

jjei-	Polymer AK^- Typ Konzen	Lösungs	Träger	Trocken
spiel	tration	mittel	stoff	bedingungen
5	119 .5%	Aceton	Mira- cloth	20⁰C

Enzym-Behandlung

1) 20% Alcalase

2) 2^c/o -Amyläse

3) Λ$> ß-Glucosidase
Std b. 4⁰C

Quervernetzungsbedingungen

1·) nicht quervernetzt 2) V/o Diäthylentriaan 1 Std b. 4⁰C

3)· V/o Diäthylentrianrin 16 Std b. 4⁰C

4) 1$ Hexamethylen

diamin -

1 Std b. 4 0

5) Vß> Hexamethylen

diamin

16 Std. b. 4⁰C

119

Aceton Glasrohre

2O⁰C 3$ Papain
Std.

4⁰C

1) nicht quervernetzt

2) Λ<$> Cystein

16 Std b. 4⁰C

Polymer

Bei- AN ^rJyp koazen- Iiösangs- trägerspiel trat ίο η. mittel stoff bedingungen

119

25b

b.

95

Mira— el otto

119

Aceton

Mraeloth

20⁰G ;nzym-Bebandlαng

3f° Papain, aufgetragen
dareh Eintaachen des
getragenen ifilmes,
getrocknet iinmittel-"bar bei 20⁰C

Papain

Std. Td. 4⁰G

Quervernetζangsbedingungen

1) nicht quervernetzt

2 ^Hexametbylendiamin

3) 1% Arginin

4) 1?6 ü-lyzerin

5)

1) 2)

3) 4-) 5) 6) 7j 8)

9;

16

Polyvinylalkohol Std. b. 4

nicht quervernetzt

Af° Hexamethylendiamin ·

Aio Hydrazinhydrat 1$ Arginin 1°/o Cystein 1$ Glyzerin Aio Guanidin

Aio Polyvinylalkohol 1$ Urea

Bei 80⁰C 45 Minuten"^³ lang Incubation mit ^ dem PolymerfilauDarm illai bei 80 C vor der Enzymbehandlung getrocknet

Polymer

Bei- JLonzen- Lösungs- :iräger-

spiel AU" Typ tration mittel stoff

l'rockenbedi ndungen Enzym-Beb andl ung

119

1%

Aceton Glasrohr

20 >ü Alcalase

O (O OO

10

119

75'Mceton Miracloth 150 ⁰G 3f> Papain
Std. b. 4 ⁰C

11 119 5°/° 75Moeton Miracloth 100 ⁰C

(1) 3¹^ Papain

(2) 3fo Pepsin
Sta. Td. 4⁰C

Qaerver ne tz ungsbedingangen

(-1) nicht qu erver netzt {2) Υ/Ό Hexamethylendiamin 16 Std. "bei 4 ⁰C nach der Snzyrnbehandlung {3) Y'/o Hexamethylendiamin 15 Minuten Incubation bei 4 ⁰C, dann 1-stündige Wärmebehandlung bei 100 ⁰C vor der .ünzymbehandlung

(1.) nicht quervernetzt

(2) Eingetaucht in 5fi Polyvinylpyrrolidon, darin 1 Std. bei 150 vor iiJnsymbehandlung

(1) nicht quervernetzt

(2) Eingetaucht in 5°/° Polyvinylalkohol, dann 1.5 Std. bei 100 ⁰C vor jitosyölbehandlung

Polymer

ϋβΐ- κ,οαζβη- Lösungs- Träger-'

spiel AIT 3?yp trat lon mittel etoff

12

119

75$ Aceton Miraoloth 25% Bioxan

!rockenbe-100 ⁰O

Que r verriet ζ ung sbtdl naangen

13

5f°

C2)149 13)169

75% Aceton iliracloth Dioxan

100 ⁰C

(1) 3# Eapain

(2) 3% Pepsin

1$ Hexamethylendiamin 15 Min. bei 4⁰C nach Enzymbehandlung (3) 3% Chymotrypsin (1) nicht quervernetzt C4) 3% 'JJrypsin
Std. "b. 4 ⁰C

Papaln
Std. b. 4 ⁰C

vor üinzymbehandlung (2) Eingetaucht in 5$ Polyvinylalkohol, dann 1,5 Std. bei ' 100 ⁰C vor Enzymbehandlung

(1) nicht quervernetzt

(2) M Hexamethylendiamin in HgO

(3) 1/i Hexamethylendiamin in Aceton

(4) 5/& Äthylenglycol

(5) 5/0 Polyvinylalkohol

(6) 5λ» Polyvinylpyrrolidon

eingetaucht in Quervernetz ungsmit tel dann 1 Std. bei 15O⁰C vor Enzymbehandlung

.Bei- ' uonzen- Lösung* spiel AN l'yp tration mittel

Aceton

iDrägerstoff	Miracloth	Trockenbe- di ngungen	•	Enzym—Be handlung	Querver netz ungs-	I
	filterpapier				bedindungen
(D	Leinen	(1) 20 ⁰C		(1) Vfo Pronas	nicht quer vernetzt	I
(2)	-platte P-I₀₀ -stab ^Glas -rohr -becher	(2) 85 ⁰O f. 1 Std.	(2) 5% Papain 16 Std. b.4 C
(3)	Polythen
(4)	Polyvinylchlorid			-
(5)	Aluminium
(6)	rostfreier Stahl
(7)	.Kunststoff s ch wamm
(8)	Ylledon
(9)	Siliconkautsch ukro hr
(1OJ	von einer Polyäthylen platte abgezogener freier 3?ilai
(11)
(12)

(13) Holz

Polymer . . . '

iJei- Jionzen- Brocken- Enzym- Quervernetzungä-

spiel AM gyp tration Lösungsmittel Trägerstoff bedingungen Behandlung bedingungen

15 119 5% (1) Pyridin (1) Miracloth 100 ⁰O 5% Papain nicht quervernetzt

	Trägerstoff	Miracloth	2ro cken-	Enzym-
Lösungsmittel	(D	Glas	bedi ngungen	Behandlung
{1) Pyridin	(2;		100 ⁰O	5% Papain
(2) Dimethyl		Polyäthen	1 Std.	17 Std. b.
formamid	(3)	PVC
	(4)	Kautschuk
	(5)	Aluminium
	16)	Stahl
	(7)

Polymer

Bei- JLonzen- Lösnngs-

spiel AIT gyp tration mittel

'i'rägerstoff

Trockenbedingungen

üJnzym-±$e-· handl u.ng

Que rver ne tz ungs tt-edingiingen

16

.17

119

119 "

völlig in Säure hydrolysiert

Zf*

Aceton

Miracloth

(1) im !Rücklauf 296 iDrypsin bebandelt 5 Std. b. mit Xylol

(2) 130 ⁰O unter
Vakuum

Std.

H₂O

(i)Miracloth 130 ⁰O unter

(λλ\ ma β Vakuum

(IiJ .Glas. ₁₆

5'/o Papa in

16 Std. b. 4⁰C

nicht qu erver netzt

nicht quervernetzt

03

Enzym—Polymer-Ifiederschläge bzw« -Präzipitate

Das Verfahren zur Herstellung von unlöslichen Enzymen in aktiver iOrm in Fiederschlägen bzw. Präzipitaten besteht darin, das Poly-CMetbylvinyläther/MaleinsäureanhydridJ-Polymer in einem Lösungsmittel zu lösen oder zu dispergieren, dann gegebenenfalls mit einem geeigneten Quervernetzungsmittel, welches in einer Menge vorliegt, die nicht ausreicht, um eine vollständige Quervernetzungs bzw. Querverbindung zu bewirken, in Reaktion zu bringen, und dann das resultierende, unlösliche Material mit einem isnzym in Reaktion zu bringen. W_enn ausreichend große Mengen des Enzyms benutzt werden, ist es unnötig, ein zusätzliches Quervernetzungsmittel zu benutzen.

Das Polymer wird sich in bestimmten organischen Lösungsmitteln wie etwa Azeton.vollständig lösen und das Quervernetzungsmittel kann in organischen Lösungsmittel zugesetzt werden, um einen niederschlag zu ergeben, der dann vor der Enzymbehandlung frei von organischen Lösungsmitteln ist.

Das Polymer löst sieb nicht leicht in wässriger Lösung, und bei dieser Art der Herstellung wird das Quervernetzungsmittel einer Suspension des Polymers zugesetzt, bevor das Enzym hinzugegeben wird. Wie bei der Herstellung von Enzym-Polymer-S¹Um kann jedes geeignete Poly-(Methylvinylätber/Maleinsäureanhydrid)-Polymer benutzt werden. In wässrigen Dispersionen ist es vorteilhaft, ein Gewichtsprozent des Polymers zu benutzen. Bei organischen Lösungen werden 0,5 - 10^, vorzugsweise 2,5/6 benutzt.

Wie in Verbindung mit den Enzytn-Polytner-Filmen beschrieben kann eine Vielzahl von Quervernetzungsmitteln benutzt werden. Bei wässrigen Lösungen ist es vorteilhaft, auf das Volumen bezogen "IjS-ige Lösungen des Quervernetzungsmittels im Verhältnis 1/20 zu 1/2 des Volumens des dispergierten Polymers zu

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verwenden. Bei organischen Lösungsmitteln werden die Quervernetzungsmittel in Lösungen von 0,5 - 5% aufbereitet, und es wird eine ausreichende Menge dieser Lösung der Polymerlösung zugesetzt, um die Niederschlagsbildung bzw. Präzipitatbiidung zu bewirken. Durch Verdünnung mit einem wässrigen Puffer wird dann ein weiterer Niederschlag hervorgerufen.

Dieses Verfahren ist nicht für jedes Enzym charakteristisch und hängt nur von dessen Proteinart ab, so daß eine Vielzahl von Enzymen benutzt werden kann. Die Behandlung wird bei 0-20 ⁰G, vorzugsweise 4 ⁰C, 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise 16 Stunden, lang durchgeführt, wobei Enzymkonzentrationen · von 1 - 20$, vorzugsweise 5$, in einem Puffer mit einem pH-Wert von 3 - 9 verwendet wird, vorzugsweise 0,2M Phosphat mit einem pH-Wert von 7,6. Der Enzym-Niederschlag wird entweder als eine Suspension in dem Reaktionsgemisch angewendet, wobei der Niederschlag im Anschluß daran durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt wird, oder es wird eine Kolonne bett utzt, durch die das Reakt ions gemisch hindurchgeschickt wird. Infolge der physikalischen Beschaffenheit des Niederschlages ist es in den meisten !«'allen vorteilhaft, den Enzym-Niederschlag mit inertem Material, beispielsweise Cellulose für proteolytische Enzyme, zu mischen, um bessere Strömungsgeschwindigkeiten durch die Kolonne zu erbalten.

Es lassen sich Mischungen von Enzym-Polymer-Niederschlägen benutzen, um mehr als eine enzymische Reaktion zu bewirken, oder das Reaktionsgemisch kann aufeinanderfolgend mit mehr als einem Pulver behandelt werden.

Die folgenden Beispiele zeigen, wie die aktiven Niederschläge bzw. Präzipitate hergestellt werden.

Beispiel 18 Herstellung von aktiven Niederschlägen

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Beispiel aas wässriger lösung:

1. 100 mg Polymer GlFl¹REZ AlT 119 wurden in 10 nil 0,2M • Phosphat mit pH- 7»6 bei 4⁰O dispergiert.

2. 1 ml V/o Hexamethylendiamin in HnO wurde hinzugefügt, und es wurde genau 2 Minuten lang umgerührt.

3. 5 ml 5^c/° Papain in 0,2M Phosphat wurden unmittelbar danach hinzugefügt, und das Umrühren wurde 16 Stunden lang bei 4 0 fortgesetzt.

4. Der Niederschlag wurde entfernt und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn durch das 7/aschen kein weiteres ünzym herausgespült wurde, war das Pulver zur Lagerung fertig.

In anderen fällen wurden folgende Variationen gemacht:

1. Es wurde in Stufe 1 anstelle des Polymer GiUT¹I¹REZ AlT das Polymer GAIT¹I¹RIl¹Z AlT 169 verwendet.

2. in Stufe 2 wurde anstelle von Vß> Hexamethylendiamin benutzt

Ca; H₂O

(b) 1'/S Hydrazinhydrat

(c) 1'/> Polyätbylenglykol

(d) V/> Polyvinylalkohol

(e) V/o Inositol

(f) 1# Cystein

(g) Y/o Arginin Ch) V/o Urea

(i) V/o N-CJ-aminopropylJ-diäthanolamin U) Vf> i'etraäthylenpentamin

3. Anstelle von 57° Papain in Stufe 3 wurde benutzt

(a) 5i° Alkalase

(b) 5% <t-Amylase

(c) 1/)ß -Glukosidase

(d) 5fi l'rypsin

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Beispiel 19 i3eispiel aas organischer

1. 50 mg Polymer G-AlTi'ühiZ AN 119 v/urden. in 2 ml Aceton gelöst.

2. 0,1 oil IT-(3-aminopropyl}-Diäthanola:nin v/urden in 4 nil Aceton dispergiert.

3. Die beiden Lösungen v/urden durch Umrühren miteinander gemischt.

4. Der daraus resultierende niederschlag wade mit 0,2ii Phosphatpuffer mit einem pH= 7,6 frei von Aceton gewaschen.

5. Der Fiederschlag v/urde mit 5 --ü. 5?j-igen Papain in 0,2-Phosphat 16 Stunden lang bei 4 ⁰C zur Reaktion gebracht.

6. Von dem niederschlag v/urde durch Waschen mit Phosphatpuffer lösliches Enzym entfernt, und das unlösliche Enzym war dann fertig für die Weiterbemitzung.

i'etraäthylenpentamin und andere Quervernetzungsmittel können anstelle von li-(3-aminopropyl)-diäthanolamin benutzt werden.

Enzyme, die durch in Wachs eingelagertes Polymermaterial unlöslich gemacht sind ·

Das verfahren zum .Binden bzw. Anschließen von Enzymen an Polymermaterial, welches in Wachs eingelagert ist, besteht darin, das Polymer in geschmolzenem i/achs zu dispergieren, eine geeignete Oberfläche durch Eintauchen mit dem Polymer-V/achs-Gemisch zu bedecken bzw. su überziehen, und die abgekühlte, wachsartige Oberfläche mit der Enzymlösung zu behandeln. Überschüssiges Enzym wird durch Waschen mit wasser oder Phosphatpuffer entfernt, und das unlösliche Enzym kann dann mit Quervernetzungsmitteln behandelt werden, so wie es im Jj'all von Enzym-Polymer-Ji'ilmen der Jj'all ist, oder es kann direkt benutzt werden.

Um eine reaktionsfähige Oberfläche zu. erhalten, kanu

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Wacbs-Polymer-Gemiscb aucb derart hergestellt werden, daß das geschmolzene Gemisch in einen Becher mit kaltem destilliertem Wasser eingetropft wird, so daß Pellets gebildet werden. Die Pellets können in der gleichen Weise wie der i'ilm mit Enzym und Quervernetzungsmittel behandelt werden.

üis können die geeigneten Poly-(Methylvinyläther-MaleinsäureanbydridJ-Polymere benutzt werden in Konzentrationen, die zwischen 1 bis 20 Gew.^ des Wachses variieren. Es läßt sich jedes chemisch inerte wachsähnliohe Material benutzen, daS zur Herstellung von Überzügen durch Heißtaucheη anwendbar ist.

Es läßt eich weiterbin jede mit Wachs überziebbare Unterlage bzw. jeder damit überziehbare i'rägerstoff benutzen.

Das Verfahren kann bei sämtlichen Enzymen angewendet werden. Die Behandlung erfolgt bei O bis 20 ⁰O, vorzugsweise 4 ⁰O, 1 bis 16 Stunden, vorzugsweise 16 Stunden, lang, wobei Enzymkonzentrationen von 1 bis 20#, vorzugsweise 5%, in Puffern mit pH-Werten von 3 bis 9» vorzugsweise 0,2M-Phosphat mit pH = 7f6, benutzt werden. Die Quervernetzungs bzw. Querverbindung kann, falls erforderlich, mit einer Vielzahl von Reaktionsmitteln durchgeführt werden, einschließlich IT— C3— aminopropylj-diäthanolamin, Hydrazinhydrat, Hexamethylendiamin, Cystein, Glycerin und PolyvirjiLpyrrolidon.

Das unlösliche Enzym in Jtorm von Pellets wird entweder in einer JLolonne angewendet, durch die der zu behandelnde Stoff geschickt wird, oder in der Keaktionsmiscbung, aus der es anschließend durch filtrieren entfernt wird. Die .benutzung von Pellets, welche unterschiedliche Enzyme tragen, gestattet es, verschiedene Enzymreaktionen gleichzeitig oder aufeinanderfolgend durchzuführen.

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Das Verfahren zur Anwendung von unlöslichem Enzym, das an wachsartige Jfilme angelagert ist, hängt von der Herstellungsform ab. In diesem Zusammenhang seien folgende Beispiele genannt:

1. Es wird als Auskleidung in einem Behälter angewendet, welcher das zu behandelnde Material enthält,

2. Es wird als Überzug bzw. Beschichtung auf Platten oder Bahnen, beispielsweise Gewebebahnen, angewendet, welche in das zu behandelnde Material eingetaucht und anschließend wieder herausgezogen werden.

5. Es v/ird dazu benutzt, ein Gitter oder einen groben Filter zu beschichten bzw. zu überziehen, durch das bzw. durch den das zu behandelnde Material geschickt wird.

Die .Reihenbenutzung einer Anzahl unterschiedlicher Enzyme, die an Polymerstoffe in Wachs angelagert sind, gestattet es, daß Ausgangs- bzw. Rohmaterial einer Anzahl aufeinanderfolgender jinzymreaktionen zu unterwerfen, v/obei jedes Enzym unter optimalen Bedingungen ohne irgendeine Einstellung auf das der Behandlung unterworfene Material angewandt werden kann. Alternativ kann ein Gemisch verschiedener Enzyme gleichzeitig an Polymerstoffe in Wachs angelagert und in dieser 3?orm benutzt werden, um gleichzeitig oder aufeinanderfolgend die einzelnen Reaktionen zu bewirken.

Die Enzyme lassen sich leicht von der Reaktionsmischung trennen und können wiederholt oder kontinuierlich weiter- bzw. wiederbenutzt werden. Die Verteilung der Enzyme über eine große fläche gestattet es, die Enzyme in außerordentlich wirtschaftlicher und technisch günstiger Weise auszunutzen.

fixierung an Wachsflächen Beispiel 20 - Anwendung in filmen.

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2(316729

1. 20 gr. Paraffin-Wachs wurden in einem Kessel im Heißwasserbad geschmolzen.

2. 4 gr. Polymer GA]JiDREZ AN 119 wurden darin dispergiert bzw. verteilt.

3. Polyäthylenscheiben, Glasstäbe und Miracloth-Teile wurden durch Eintauchen in das heiße Gemisch beschichtet bzw. mit einem Überzug versehen.

4. Mach Abkühlung wurden die überzogenen bzw. beschichteten Träger stoffe mit 5'A>-igen Papain in 0,2M Phosphat mit einem pH-Wert von 7,6 bei 4 ⁰C 16 Stunden lang zur Reaktion gebracht.

Das lösliche Enzym wurde durch wiederholtes Waschen mit destilliertem Wasser oder mit 0,2M Phosphatpuffer mit pH = 7,6 entfernt, und der unlösliche Enzymfilm war für die weitere Benutzung fertig.

Dieses Verfahren wurde in folgender Weise abgewandelt:

1. Anstelle von Paraffin-Wachs wurde in Stufe 1 ITuboid-Wachs benutzt.

2. In Stufe 2 wurde AH 119 hinzugefügt, um Konzentrationen von 1$, 5°/ο und 10$ anstelle von 20$ zu ergeben.

3. In Stufe 4 wurde anstelle von Papain Alcase, c(-Amylase, FDB und Pronase benutzt.

.Beispiel 21 - Anwendung in Pelletform

1. 1 gr. Paraffin-Wachs wurde in einem Behälter in einem Heißwasserbad geschmolzen.

2. 50 mg. AF 119 wurden darin dispergiert bzw. verteilt.

3. Die geschmolzene Mischung wurde in einen Becher mit kaltem destillierten Wasser eingetropft um Pellets zu bilden.

4. Die getrockneten Pellets wurden mit einer 5$-igen

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Alcalaselösung bei 4 ⁰O 1β Stunden lang behandelt bzw. zur Reaktion gebracht.

Lösliches Enzym wurde durch V/aschen mit destilliertem Wasser oder mit 0,2M Phosphatpuffer mit einem pH-V.^rert von 7»6 entfernt, und die Pellets mit den daran angelagerten Enzymen waren für die Veiterbenutzung fertig.

Das Verfahren wurde in folgender Weise abgewandelt:

1. Es wurden zwei Arten von Par äff in-Wachs, von denen das eine mikrokristallin war, benutzt.

2. Die Konzentration von AN 119 wurde von 5;£ auf 10$, 15λ> und 20;» in Stufe 2 erhöht.

3. Anstelle von Alcalase wurde in Stufe 3 Papain benutzt.

Die Eigenschaften der an das Poly-(Methylvinyläther/lialeinsäureanhydrid^-Polymer angelagerten Enzyme werden in verschiedener Weise abgewandelt. Die Unterschiede zu den Eigenschaften des löslichen Enzyms hängen von dem Verfahren zur Herstellung des tfilms und auch von dem einzelnen, speziellen Enzym ab. jüs kann keine allgemeine Aussage hinsichtlich der Veränderung der Eigenschaften durch das Unlöslichmachen eines Enzyms gemacht werden; die folgenden Beispiele sollen jedoch einige dieser Unterschiede aufzeigen.

In sämtlichen .Fällen wurde eine 2$-ige Lösung von GAlTi¹REZ AN 119 in Aceton benutzt, um einen PiIm auf Hiracloth abzulagern

ρ bzw. sich bilden zu lassen, so daß je cm des Poly-(iiethylvinyläther/MaleinsäureanhydridJ-Materials ein mg vorhanden / war. Es wurde 18 Stunden lang bei 90 G getrocknet, und das Material bzw. der Film wurden dann bis zur Verwendung in einem l'rockenapparat gelagert.

Der Anhydrid-l'ilm auf Miracloth wurde dann 5 Stunden lang bei 4 ⁰O mit einer Lösung behandelt, die 30 mg '.Trypsin je ml in

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/■«■'■·' ■■

- 27 -

O,1M Kalium-Pbosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 enthielt. Der tfilm wurde dann mit 0,1M HH.HCO₅ und dann mit Wasser gewaschen. Der unlösliche gemachte Enzymfilm enthielt dann

2
1 mg Protein je cm . Die Präparate wurden entweder in einem Srockenapparat "bei Raumtemperatur oder in Wasser "bei 4 ⁰O gelagert.

Die Aktivitäten tfew. Reaktionsfähigkeit in den Beispielen beziehen sich auf die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten.

Beispiel 22 - Aktivität zum Hydrolisleren von .lienzoyl-argininätbylester

Der Enzymfilm wurde dazu benutzt, 4,9 mM Eenzoyl-argininäthylester in Wasser, welches 0,2H JKalziumchlorid bei verschiedenen pH-Werten enthielt, zu hydrolisieren. Die Aktivität je mg des Enzyms ist als $-Satz der Aktivität der löslichen Enzyme bei jeweils den gleichen pH-Werten dargestellt.

si·	Aktivität	relativ zum löslichen Enzym	ί
7,5		22 5	i
8,5		53 5	, iieaktionsfähfekeit beim
9,5		71 5	Dimethyl-Gelatine
Beispiel 23	- Aktivität	bzw.
	-Zersetzen	von

Der Knzymfilm wurde dazu benutzt, 0,2^-ige Dimethyl-Gelatine in O,1M dreiwertigem Puffer zu zersetzen, welches 0,2h iCalziumchlorid bei verschiedenen pH-Werten enthielt. Die Aktivität je mg des Enzyms ist als ϊί-Teil der Aktivität bzw. .rteaktiQnsfähigkeit des löslichen Enzyms bei den gleichen pH-Vierten wiedergegeben.

pH Aktivität relativ zum löslichen Enzym

7,5 8 5t

3,5 21 Ji

- 28 9,5 25 55

Beispiel 24 - Stabilität des Enzymfilmes frei

Der trocken bei Raumtemperatur gelagerte Jilnzymfilm hatte nach einer 24-tätigen Lagerung noch 94,3^ seiner Anfangsaktivität bzw. -reaktionsfähigkeit.

Bei Lagerung in einem Puffer bei einem pH-rfert von 7,5 zeigte der ünzymfilm nach 4 Tagen kein Nachlassen seiner Aktivität bzw. Reaktionsfähigkeit, während das freie Jiinzym nach 1 Tag zu 60/j inaktiv geworden war, während es nach 3 Tagen nahezu völlig inaktiv war.

Beispiel 25 - Thermische Stabilität der unlöslich gemachten Enzyme.

Wenn der üi'nzymfilm bei verschiedenen pH-Werten von 3 bis 9 15 Minuten lang auf einer Temperatur von 60 ⁰O gehalten wurde, verlor er etwa 70^> seiner Aktivität bzw. Reaktionsfähigkeit zur Hydrolyse von uenzoyl-arginin-äthylester bei einem pH-.fert von 8. Dieses Nachlassen der Reaktionsfähigkeit bzw. Aktivität wurde jedoch nicht im wesentlichen Umfang durch den benutzten pH-V/ert beeinflußt.

im Gegensatz dazu zeigte sich beim löslichen Enzym bei pH-Werten von 3 bis 4 kein Nachlassen der Aktivität bzw. Reaktionsfähigkeit, während bei höheren pH-Werten das Nachlassen der Aktivität außerordentlich hoch war. Diese Wirkungen sind in der folgenden Tabelleidargestellt.

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Tabelle

co co cn

	Endaktivität als Prozentteil der	: erwärmten Enzyms
	.Aktivität des nie hi	unlösliches Enzym
pH-Wert während dss Erwärmens des Enzyms	lösliches Enzym	32
3.0	99	28
4.0	99	-
4.5	88	-
■ 4.75	61	-
5.0	10	38
5.5	0	—
6.0	7.5	—
6.2	5.0	33
7.0	0	-
7.5	0	38
3.0	0	42
9.0	ο ■

- zeigt an, daß keine Messung durchgeführt wurde

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung unlöslicher Enzyme in aktiver bzw. reaktionsfähiger Form, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mischpolymerisat mit einer Enzymlösung behandelt wird, und eine Quervernetzung des Enzym-Polymer-Komplexes und/ oder eine Neutralisation der restlichen reaktionsfähigen chemischen Gruppen durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive bzw. reaktionsfähige unlösliche Enzym in Form eines Filmes hergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive bzw. reaktionsfähige unlösliche Enzym in form eines Niederschlages bzw. Präzipitats hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive bzw. reaktionsfähige unlösliche Enzym an ein Polymermaterial angelagert wird, welches in Wachs eingelagert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly-(Methaivinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in einem Lösungsmittel gelöst wird, daß eine feste Unterlage mit der Lösung des Mischpolymerisats beschichtet bzw. überzogen wird, daß dann der resultierende Mischpolymerisatfilm getrocknet wird und anschließend der Mischpolymerisatfilm mit einer Lösung eines Enzyms behandelt und der so behandelte film mit der unterlage aufeinanderfolgend mit einer Ammonium-Sicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischpolymerisatf ilm vor oder nach der Behandlung mit dem Enzym mit einer Lösung eines Quervemetzungsmittel bzw. Querverbindungsmittel behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mischpolymerisat in einem Film auf der benutzten Unterlage abgelagert wird, wobei eine Lösung entweder in einem wässrigen oder einem organischen Lösungsmittel benutzt wird.

8· Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das an den PiIm gebundene bzw. angelagerte Enzym eines der folgenden Enzyme oder eine Mischung der folgenden Enzyme ist: Papain, Alcalase, Pancreatin, Bacterienproteinase, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, NSB, Pepsin, Asparaginase, Amyloglucosidase, Cellulase, ex -Amylase, Takadiastase,ß -Glucosidase, Hexokinase, Pyrophosphatase, Catalase, Xanthinoxidase.

9* Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in einer Konzentration von 0,5 bis 200 mg/ml in einem Puffer mit einem pH-Wert von 3 bis 9 angewendet wird.

10. Verfahren'nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg/ml benutzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in einer Konzentration von 30 mg/ml in einem Puffer von 0,2M Phosphat bei einem pH-Wert von 7»6 benutzt wird.

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12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Enyzmlösung 30 Minuten bis 16 Stunden lang bei einer Temperatur von O bis 20 ⁰O mit dem Polymerfilm in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit dem Polymerfilm bei einer !Temperatur von 4 ⁰C in Kontakt gebracht wird.

14· Verfahren naoh Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der fixierte film mit einer 0,1M Ammonium-Bicarbonatlösung gewaschen wird, um freie azidische Gruppen zu neutralisieren, die aus dem Maleinsäureanhydrid entstanden sind.

15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Quervernetzungsmittel einer der folgenden Stoffe benutzt wird: Äthylenglykol, Propylenglykol, Glyzerin, Polyäthylenglykol, Hexamethylendiamin, Diäthylentriamin, Triäthylentetramin, Tetraäthylenpentamin, N-(3-aminopropyl)-diäthanolamin, Hydrazin, Arginin, Guanidin, Urea, Cystein, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Carboxymethylcellulose.

16. Verfahren nach.Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Quervernetzung bei 4 bis 20 ⁰C während einer Zeit durchgeführt wird, die zwischen 5 Minuten und 16 Stunden variiert.

17. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Film aus einer Lösung in Aceton abgelagert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Film vor oder nach dem Zusatz des Quervernetzungsmittels, jedoch bei Abwesenheit des Enzyms, auf etwa

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100 ⁰C erwärmt wird.

19· Verfahren nach Anspruch 17t dadurch gekennzeichnet, daß der PiIm vor der Behandlung mit dem Enzym unter Vakuum in siedendem Xylol oder auf 130 ⁰O erwärmt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein PiIm aus 0,2M Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 7,6 abgelagert bzw. gebildet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in H₂O gelöst wird, so daß es vollständig hydrolisiert ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäure)-Lösung zur Beschichtung bzw. zum Überziehen einer Oberfläche benutzt wird, daß die Anhydridgruppen durch mehrstündiges Erhitzen der belichteten bzw. überzogenen Oberfläche auf 130 ⁰C unter Vakuum regeneriert werden, und daß der resultierende PiIm dann mit dem jeweiligen Enzym und den Quervernetzungsmittein behandelt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in geschmolzenem Wachs dispergiert bzw. verteilt wird, daß eine geeignete Oberfläche durch Eintauchen mit dem Polymer-Wachs-Gemisch beschichtet bzw. überzogen wird, daß die abgekühlte wachsartige Pläche mit der Enzymlösung behandelt wird, und daß überschüssiges Enzym durch Waschen entfernt wird.

£4. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das unlösliche Enzym mit Quervernetzungsmittein behandelt wird.

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25. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in geschmolzenem Wachs diepergiert, bzw. verteilt wird, daß das geschmolzene Gemisch zur Bildung von Pellets in einen Becher mit kaltem destillierten Wasser eingetropft wird, und daß die Pellets mit Enzym und Quervernetzungsmitteln behandelt werden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in einer Konzentration zwischen 1 und 20 Gew.$ des Wachses benutzt wird.

27· Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung 1 bis 16 Stunden lang bei einer Temperatur von O bis 20 C durchgeführt wird, und daß Enzymkonzentrationen von 1 bis 20 i» in einem Puffer mit einem pH-Wert von 3 bis 9 benutzt werden.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung 16 Stunden lang bei 4 ⁰C durchgeführt wird, wobei eine Enzymkonzentration von 0,5 % in 0,2M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,6 benutzt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß als Quervernetzungsmittel N-(3-aminopropyl)-diäthanolamin, Hydrazinhydrat, Hexamethylendiamin, Cystein, Glyzerin oder Polyvinylpyrrolidon benutzt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in einem Lösungsmittel gelöst oder dispergiert wird, das gegebenenfalls mit einem Quervernetzungsmittel, das in einer Menge vorliegt, die licht ausreicht, um eine vollständige Querreraetzung zu bewirken, eine Reaktion durchgeführt wird, und daß dann das resultierende unlösliche

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Material mit einem ünzym zur keaktion gebracht bzw. behandelt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß in wässriger Dispersion 1 Gew. ^ Polymer benutzt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß in organischen Lösungen 0,5 bis 10 Gew.7° Polymer benutzt werden.

33. Verfahren nach Anspruch 31» dadurch gele ennz eich net, daß bei wässriger Dispersion eine 1$=>-ige Lösung des Quervernetzungsmittels in Volumönanteilen von 1/20 bis 1/2 des Volumens des dispergierten Polymers benutzt wird.

34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerlösung in organischem Lösungsmittel eine Lösung in organischem Lösungsmittel mit einem Gewichtsantil von 0,5 bis 5rt eines Quervernetzungsmittels augesetzt wird, um einen Niederschlag bzw. ein Präzipitat zu ergeben, der bzw. das von der j&izy ölbehandlung von den organischen Lösungsmitteln freigewaschen wird.

35. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung 1 bis 24 Stunden lang bei 0 bis 20 ⁰C durchgeführt wird, wobei Enzymkonsentrationen von 1 bis 2O;t> in einem Paffer bei einem pH-V/ert von 3 bis 2 benutzt werden.

36. Verfahren nach Anspruch T5, dadurch gekennzeichnet, daß die behandlung 16 Stunden lang bei 4 ⁰O durchgeführt wird, Wobei Enzymkonzentrationen von 5^r,O in 0,2H-Phosphatpuff er bei einem pH-Wert von 7,6 benutzt werden.

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— l\ —

37. Unlöslicher Enzymkatalysator, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Enzym enthält, welches !covalent an Poly-(Methylvinyläther/Maleinsäureanhydridj-Polymer gebunden ist.

38. Unlöslicher Enzymkatalysator, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Enzym enthält, der kovalent. an einen auf einer Oberfläche bzw. Erägerfläche angebrachten i'ilm aus Poly- (Methyl vinyläther/Maleinsäureanhydridj-Polymer gebunden ist.

39. Unlöslicher Enzymkatalyeator, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Enzym enthält, welches kovalent in einem Niederschlag bzw, Präzipitat mit Poly-(Methylvinyläther/MaleinsäureandydridJ-Polymer gebunden ist.

40. Unlöslicher Enzynikatalysator, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Enzym enthält, welches kovalent an Poly-(Metbylvinyläther/I-üaleinsäureandydridj-Polymer gebunden ist, welches in Wachs eingelagert ist.

41. Papain, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an PoIy-(tfethylvinyläther/Maleinsäureanhydrid)-Polymer gebunden ist, welches in Paraffinwachs oder Nuboid-Wacbs angelagert ist.

42. Alcalase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an Poly-U'Iethylvinyläther/Maleinsäureanhydrid ^-Polymer gebiMen ist, welches in Paraffinwachs oder Nuboid-Wachs eingelagert ist.

43. <t -Amyläse, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an Poly-(I■.iethylvinyläther/l·laleinsäureanhydr·id_<)-Polymer gebunden ist, welches in Paraffinwachs oder ÜTuboid-Wachs eingelagert ist.

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44. HDB (Enzymstabilisator für Brauereizwecke) dadurch gelee riazeicb net, daß es !covalent an Poly-(Methyl vinyläther/ Ilaleinsäur eanhydrid )-Polymer gebunden ist, welches in
Paraffinwachs oder Huboid-Wacbs eingelagert ist.

45. Pronase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an
Poly-(Metbylvi nyläther/Malei nsäureanhydridJ-Polymer
gebunden ist, welches in Paraffinwachs oder Muboid-^T.Vaohs eingelagert ist.

46. Papain, dadurch gele ennze ich net, daß es !covalent an PoIy-(Methylvinylätber/Maleinsäureanbydrid)-Polymer in ausgemalter Ροπή gebunden ist.

47. Papain, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an einen Ji'ilm aus iithylenmaleinsäureanhydrid-Misch polymerisat gebunden ist.

48. Pancreatin, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an
einen i'ilni aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mis chpolyaierisat gebunden ist.

49. Proteinase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an einen i'llrn aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

50. i'rypsin, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an
einen x'llm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

51. Ghytnotrypsin, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an einen l'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

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52. Pro nase, dadurch gekennzeichnet, daß sie !covalent an einen Film aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

53. HDB (Enzym-Stabilisator für Brauereizwecke), dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an einen i'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

54. Pepsin, dadurch gekennzeichnet, daß es. kovalent an einen J¹Um aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

55. Asparaginase, dadurch gele ennze ich net, daß sie kovalent an einen i'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Hischpolymerisat gebunden ist.

56. Cellulase, dadurch gekennzeichnet, daß sie !covalent an einen ü'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-i-iischpolymerisat gebunden ist.

57. Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an einen Jj'ilm aus Äthylenoialeinsäur'eanbydrid-Iiischpolymerisat gebunden ist.

58. Bakadiastase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an einen PiIm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat gebunden ist.

59. fcrlucosidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an einen i'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-nischpolymeriaat gebunden ist.

60. Hexokinase, dadurch .-;ekennzelohnet, daß sie kovalent an einen .e'ilm aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-kischpolymerisat gebunden ist.

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61. Pyropbospbatase, dadurch gekennzeichnet, daß sie !covalent an einen ^iIm aus lithylentnaleinsäureanbydrid-Mischpolyrnerisat gebunden ist.

62. Gatalase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an einen Film aus Äthylenmaleinsäureanbydrid-Hiscbpolymerisat gebunden ist.

ozldase

63. Xanthine dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an

einen Jj¹Um aus Äthylenmaleinsäureanhydrid-Miscbpolymerisat gebunden ist.

64· Alealase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an Poly-(Methylvinyläther/iteleinsäureanhydrid )-Polymer in ausgefällter Form gebunden ist.

65· Amy läse, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an Poly-Gfethylvinylätber/Maleinsäureanhydrid)-Polymer in ausgefällter Form gebunden ist.

66. GluGosidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie kovalent an Poly-(Methylvinyläther/HaleinsäureanhydridJ-Polymer in ausgefällter Form gebunden ist.

67. Trypsin, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent an PoIy-C 'lethylvinylätber/Maleinsäur eanhy drid)-Polymer in ausgefällter Fora gebunden ist.

68. Enzym naoh Anspruch 38, dadurch ^ekennzei ebnet, daß der Film auf einer Unterlage aus Papier, Gewebe, Holz, kunststoff, metall, Glas oder Kautschuk abgelagert ist, oder da3 eine sonstige Oberfläche benutzt wird, oder daß die Innenseite eines Behälters oder die Innenseite eines Rohres benutzt ist.

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