DE19801780A1

DE19801780A1 - Transgener nicht-menschlicher Säuger sowie Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE19801780A1
Application number: DE1998101780
Authority: DE
Inventors: Monica Hollstein; Qin Yang; Zhao-Qi Wang
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1998-01-19
Filing date: 1998-01-19
Publication date: 1999-07-22
Also published as: EP1049771A2; WO1999036528A2; WO1999036528A3; JP2002508960A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen p53-Säugers sowie dessen Verwendung zum Austesten von Chemika lien, Medikamenten und Therapieansätzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Erzeugung einer p53 Human Knock-in Maus.

Die Erfindung betrifft ferner einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, bei dem die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.

Erworbene somatische Mutationen in dem Tumor-Suppressorgen p53 korrelieren sehr häufig mit dem spontanen Auftreten von Krebs bei Mensch und Tier, z. B. Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs sowie Lymphomen, Osteosarkomen, Neurofibrosarkomen. So weisen zwischen 30 und 70% aller malignen Tumore fast jedes Organ- oder Gewebstyps eine Punktmutation in einer der zwei p53-Genkopien und/oder den Verlust des anderen Allels auf. Das von diesem Gen codierte "normale" p53-Protein (Wildtyp) besitzt eine krebs hemmende Funktion, indem es den Zellzyklus stoppen und Apoptose (program mierter Zelltod) induzieren kann. Mit Hilfe p53-abhängiger Mechanismen wird die geschädigte Zelle entweder wieder repariert oder komplett vernichtet, wodurch in beiden Fällen der neoplastische Prozeß unterbrochen wird. Das p53-Protein wirkt dabei als negativer Regulator des Zellwachstums, in dem es nach DNA-Schädigung induziert wird. Zu einem Funktionsverlust von p53 kann es durch Punktmutation, Allelverlust, intragenische Umordnung und intragenische Deletion kommen. p53-Mutationen in der Keimbahn stehen im Zusammenhang mit Krebs in frühen Lebensjahren. In zahlreichen Studien wurde das onkogene Potential verschiedener Mutationen im p53-Gen untersucht (vgl. Harris et al., New Engl.

Journ. of Med., 329, 1318-1327 (1993)). Bestimmte Mutationen, sogenannte Hot-Spot-Mutationen, kommen bei manchen Tumorarten häufiger vor. Häufige Mutationsstellen in der codierenden Sequenz von p53 sind beispielsweise die Codons 273, 248, 175, 249 oder 245.

Mutierte p53-Proteine sind sehr häufig mit einer schlechten Prognose für die jeweilige Krebserkrankung verbunden und können sogar Wild-Typ p53 dominant-negativ hemmen und noch weitere Zusatzfunktionen ausüben, wie z. B. die Stimulierung des Zellzyklus, also einen neoplastischen Prozeß begünstigen. Ein Überblick über die funktionelle und klinische Bedeutung von Mutationen im p53-Gen findet sich in Sidransky et al., Annu. Rev. Med. 47: 285-301, 1996.

Alle bisher erforschten Mutationen und ihre Korrelation mit den jeweiligen Krebserkrankungen sind in einer Datenbank zusammengestellt, die von der International Agency for Research on Cancer (IARC) in Lyon, Frankreich, betreut wird und auf CD-ROM erhältlich ist (vgl. Hollstein et al., Nucleic Acids Res., 24,1, 141-146, 1996).

Zur Identifizierung von möglichen menschlichen Karzinogenen wurden bisher Mäuse (auch transgene) und andere Nager gegenüber den jeweiligen Stoffen exponiert und die Gene aus den entstandenen Tumoren analysiert (vgl. Goodrow et al., Molecular Carcinogenesis, 5, 9-15, 1992). Ferner wurden auch mensch liche Zellinien in vitro exponiert und die Mutationen in bestimmten Genen unter sucht. Solche Zellen wurden dann auch in Nacktmäuse injiziert und die gebilde ten Tumoren wurden auf Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen untersucht. In jüngerer Zeit werden verstärkt transgene Mäuse zum Studium der Karzinogenese verwendet. Transgene Tiere eignen sich gut als Modell zum gezielten Test auf die Auswirkungen einer Mutation in einem Tumorsuppressor gen wie dem p53-Gen. Dazu wurde beispielsweise eine p53-Defektmaus mit einem p53-Nullallel mit einer transgenen Maus, die mehrere Kopien eines mutier ten Maus p53-Gens (Val 135) außerhalb des normalen Chhromatin-Kontextes in sich trug, verpaart. Tiere, die bzgl. des endogenen Wild-Typ p53-Gens mit dem mutierten Transgen hemizygot waren, entwickelten rascher einen Tumor und zeigten ein verändertes Tumorspektrum gegenüber der nicht-transgenen Kon trollgruppe (Kemp et al., Nature Genetics, 9, 305-311 1995).

Jedoch erlauben derartige Karzinogenesemodelle bei Tieren nur wenige Rück schlüsse auf Mutationsmuster beim Menschen. Zum einen entsprechen die Expositionen meist nicht den beim Menschen üblichen komplexen Expositionen wie z. B. Tabakrauch, Umweltfaktoren, Lebensstil, Ernährungsgewohnheiten etc. . Wegen der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet sich nach heuti ger Kenntnis außerdem ein Mutationsspektrum des Tieres immer von dem des Menschen (vgl. Duflot et al., Carcinogenesis, 15, 7, 1353-1357, 1994 und Dumaz et al., Carcinogenesis 18, 897-904, 1997). Obwohl beispielsweise die Aminosäuresequenz der stark konservierten DNA-Bindungsregion des p53-Protein bei Mensch, Maus und Ratte fast identisch ist, unterscheiden sich die DNA-Sequenzen in vielen Nukleotiden. Es konnte gezeigt werden, daß die Induktion einer Mutation in hohem Maße von der genauen DNA-Sequenz ab hängt, die bei der Maus anders als beim Menschen ist.

Ferner lag bei den bisher beschriebenen transgenen Tieren das p53-Gen nicht in seiner natürlichen Form vor: in einem Fall war das Maus-Transgen mutiert (nicht funktionell) und nicht an seiner natürlichen chromosomalen Stelle; im anderen Fall war die Gensequenz nicht als Muster von Intron- und Exonsequenzen, sondern als cDNA integriert und überdies nicht unter der Kontrolle der natürli cherweise vorhandenen Regulatorelemente und wurde nicht in allen Geweben exprimiert. Diese Modelle entsprechen also nicht den natürlichen Verhältnissen und erlauben keine bzw. nur eine beschränkte Aussage über eine mögliche Mutagenese bzw. Karzinogenese beim Menschen. In einem dritten Modell sind die p53 Allele (Maus) durch "Knock-out" ausgeschaltet worden, stehen also für die Mutationsanalyse nicht mehr zur Verfügung. Es besteht daher ein Bedarf nach Modellen, an denen im Hinblick auf die Entwicklung von Krebsmedika menten aussagefähige Erkenntnisse über die Entstehung und Progression von Krebs, insbesondere beim Menschen, gewonnen werden können.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Modell bereit zustellen, an dem Karzinogenitätstests mit Aussagekraft für Säuger, insbesonde re den Menschen, durchgeführt werden können. Diese Karzinogenitätstests sollen sich auf das onkogene Potential von Veränderungen im p53-Gen beziehen. Die Erfindung soll ferner ein Modell bereitstellen, an dem Mutationsspektren im menschlichen p53-Transgen, die für bestimmte Klassen von menschlichen Karzinogenen bzw. Karzinogenexposition typisch sind, dargestellt werden können. Durch den Einsatz von kanzerogenen Stoffen sollen Mutations-Hot-Spots im p53-Gen identifiziert werden können, die auch in der natürlichen Umgebung von humanem p53, d. h. im Menschen, Bedeutung haben. Dadurch sollen sich z. B. berufsbedingte, ernährungsbedingte, durch spezielle Lebens gewohnheiten bedingte Expositionsmuster herausfinden lassen. Es soll ein Modell geschaffen werden, an dem chemische und pharmazeutische Produkte im Hinblick auf ihr mutagenes und karzinogenes Potential im menschlichen p53-Gen in verschiedenen Organen getestet werden können. Ferner soll ein Modell bereitgestellt werden, mit dem pharmazeutische Produkte einer neuen Genera tion auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore getestet werden können. Das Modell soll die Entwicklung von Mitteln erlauben, die sich für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen bei verschiedenen Tumoren, die ein mutier tes p53-Gen tragen, eignen und insbesondere zur Erzeugung eines für den Menschen typischen Mutationsmusters im p53-Gen. Auch das Zusammenwirken verschiedener Mutationen bei der Tumorentstehung soll untersucht werden können.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, wobei eine embryonale Stammzellinie eines nicht-menschlichen Säugers mit einem geeigneten Rekombinationsvektor transfiziert wird, stabil transfizierte Zellclone isoliert werden und in geeignet vorbereitete weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugers implantiert wer den und deren Nachkommen auf das Vorhandensein des Genaustausches selektioniert werden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß bei dem Rekombinationsereignis die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt wird, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.

Ferner betrifft die Erfindung einen transgenen nicht-menschlichen Säuger, bei dem ein Teil oder die Gesamtheit des p53-Gens des Säugers durch ein homolo ges p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt. Dabei liegt das jeweilige p53-Gen in seiner natürlichen geneti schen Umgebung vor und kodiert bevorzugt für ein exprimiertes, nicht mutiertes Protein.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren in Form eines Säugermodells zum Test von neuen Arzneistoffen auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den vorstehend genannten transgenen nicht-menschlichen Säuger mit dem neuen Arzneistoff behandelt und die Tumor regression bzw. -remission nach an sich bekannten Verfahren bestimmt. Außer dem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Test von Chemikalien auf ihr mutations- und krebsinduzierendes Potential, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den vorstehend genannten transgenen nicht-menschlichen Säuger mit der Chemikalie behandelt und die Mutationsspektren bzw. Tumorinduktion nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.

Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, daß sich das p53-Gen eines Säugers in Form von genomischen Sequenzen in das Genom eines anderen Säugers anstelle des dort vorliegenden p53-Gens integrieren läßt und dann unter der Steuerung der natürlicherweise in diesem Genom vorhandenen Regula torelemente steht.

Die einzuschleusende p53-Sequenz stammt aus dem Genom eines anderen Säugers als der zu erzeugende transgene Säuger (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Kuh, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund, Katze). Bevorzugt stammt die einzuschleusende Sequenz aus dem menschlichen Genom. Sie kann aber auch aus dem Genom eines anderen Säugers, wie z. B. eines Haustieres (z. B. Hund, Katze etc.) oder eines Nutztieres (z. B. Pferd, Rind, Schwein etc.) stammen. Die p53-Sequenz kann als Ganzes oder in Teilen eingeschleust werden. Sie kann als Wildtypsequenz oder als mutierte Sequenz vorliegen, je nachdem ob ein Modell zum Test auf Karzinogene oder Arzneimittel erhalten werden soll. Sie kann auch ein oder mehrere Mutation(en), die für eine spezielle Krebsart typisch ist/sind, enthalten. Bevorzugt ist die Mutation für eine Krebsart, beispielsweise für Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymphomen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typisch.

Zur Erzeugung von Modellen für Karzinogenitätstests werden bevorzugt die Exons/Introns des p53-Gens eines anderen Säugers eingeschleust, die in Tumo ren üblicherweise die größte Anzahl an Mutationen aufweisen. Bevorzugt sind dies die menschlichen Exons 5-9. Bei Modellen zum Test auf neue Arzneimittel werden bevorzugt diejenigen Genteile eingeschleust, die eine oder mehrere für eine bestimmte Krebserkrankung typische Mutationen aufweisen, um z. B. Onkogenese und Therapiemöglichkeiten der speziellen Tumorerkrankung gezielt untersuchen zu können.

Zusätzliche Gentransfer-Kontrukte zum "Gene Targeting" wurden hergestellt, in welchen z. B. durch homologe Rekombination (z. B. mit den nachfolgend erwähn ten Konstrukten 14-1-3 und 29-38) zusätzliche Maus-p53-Exons durch mensch liche p53-Exons (z. B. Exon 4, Exon 10) ersetzt wurden. Schließlich wurden Konstrukte hergestellt, in denen nicht-kodierende Maus-Sequenzen, die die p53-Gentranskription steuern, durch menschliche Kontrollsequenzen ersetzt wurden. Diese Kontrollelemente beinhalten z. B. die 3'-UTR (UTR = Untranslated Region) Sequenzen, die 5'-Promotorsequenzen und Intron 4, welches gewebespezifische Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthält.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung der p53 Human Knock-in Maus (Phuki-Maus). Diese genetisch veränderte Säugetierart trägt die Exons und Introns des menschlichen p53-Gens als Transgen. Dabei wird der für die Tumor entstehung wichtigste Teil des menschlichen p53-Gens (bevorzugt Wildtyp-p53 oder Teile davon) anstelle der entsprechenden Sequenz des Mausgens durch homologe Rekombination eingebracht. Dabei wurde eine für das humane p53-Gen natürliche Situation geschaffen, die darin liegt, daß das p53-Gen in Form genomischer Sequenzen, d. h. als Intron- und Exon-Sequenzen, nicht aber als cDNA in multiplen Kopien in unbekannten Orten im Genom vorliegt. Ferner liegt das p53-Gen unter der Kontrolle von natürlicherweise in der Maus vorhandenen Regulatorelementen vor. Dadurch werden Kopienzahl, Ort des Gens und sein Kontext nicht verändert, so daß für den Wirtsorganismus die säugerzelltypische Regulation unverändert beibehalten wird. Mit weiteren Plasmiden können Regula tionselemente eingeführt werden, die eine für den Menschen typische Genregu lation bewirken sollen. Eine solche Situation wurde bisher bei den bekannten transgenen p53-Tieren nicht beschrieben. Dadurch ermöglicht die vorliegende Erfindung, durch Einsatz von kanzerogenen Stoffen, Mutations-Hot-Spots im p53-Gen bzw. p53-Protein zu identifizieren, die auch in der natürlichen Umge bung von humanem p53, d. h. im Menschen, Bedeutung haben. Dadurch lassen sich gezielt Mittel entwickeln, die sich für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen bei mutiertem p53 in Präkanzerosen und verschiedenen Krebs erkrankungen eignen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gensubstitutionsvektor bzw. Rekombinationsvektor erzeugt, bei dem das p53-Gen eines Säugers ganz oder in Teilen durch das entsprechende Gegenstück eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist.

Diese Konstruktion wird bevorzugt über den Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R.M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) in embryonale Stammzellen (z. B. Maus 129/SV) transfiziert. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Metho de können bei Verwendung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.

Mäuse mit den Phuki-Konstrukten können natürlich mit üblichen Mäusestämmen gekreuzt werden, die für Karzinogenese-Tests verwendet werden und deshalb für die mutagene/karzinogene Aktivität verschiedener Substanzen verantwortlich sind: z. B. SENCAR-Mäuse (insbesondere verwendet für Haut-Tumorgenese-Studien), B6C3F1 (verwendet für verschiedene Krebstests). Andere Mäusestäm me, die zur Kreuzung mit der Phuki-Maus interessant sind, sind z. B. Stämme mit genetischen Defekten der DNA-Reparatur (z. B. mit einem Fehlen der Enzym aktivität von 06-Alkylguanintransferase). Diese Mäusestämme sind alle käuflich erhältlich und dem Fachmann hinreichend bekannt.

Ferner lassen sich durch Kreuzung des erfindungsgemäßen transgenen Säugers mit bereits etablierten transgenen Säugern (z. B. Modelle für generelle oder organspezifische Entzündung) doppelt-transgene Säugetiermodelle herstellen, die eine realistischere Nachbildung der menschlichen Karzinogenese als bisher erlauben. Für die Kreuzung können dabei beispielsweise die Hepatitis B-Ober flächen-Antigen (HBsAg)-transgene Maus; die TGF-beta 1 transgene Maus, welche als Transgen "transforming growth factor" cDNA unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen aus dem Mausalbumingen hat; oder die hu-HLA-B27 (ein menschliches MHC Klasse I Allel assoziiert mit menschlichen Entzündungs erkrankungen) transgene Maus, welche spontane Entzündungsreaktionen auf grund eines geänderten Immunsystems-Repertoire entwickelt, verwendet wer den.

Zur Erzeugung einer bevorzugten erfindungsgemäßen Maus werden die ge wünschten Exons, z. B. die Exons 5-9, des endogenen Mausgens p53 durch die entsprechenden Exons des Menschen unter Einschluß der Intron-Sequenzen durch homologe Rekombination ersetzt. Dazu wird ein in geeigneter Weise hergestellter Gensubstitutionsvektor (z. B. das nachstehend beschriebene Plasmid 14-1-3) und eine embryonale Stammzellinie (z. B. ES 129/SV) verwendet. Die erhaltenen rekombinanten Klone der embryonalen Stammzellen der Maus werden dabei in geeignet vorbereitete weibliche Tiere zur Erzeugung von Chimären implantiert. "Geeignet vorbereitete weibliche Tiere" heißt dabei, daß die Tiere durch verschiedene Maßnahmen, z. B. durch eine Hormonbehandlung, auf ihre "austragende" Aufgabe vorbereitet worden sind. In diesem Zusammenhang sei auch auf "R.M. Torres, R. Kühn, s. o." verwiesen. Da es oftmals gewünscht ist, reinerbige Tiere vorliegen zu haben, können die so erhaltenen heterozygoten Stämme (p53+^phuki/+) dann mit einem anderen Tier des gleichen Stamms oder einem anderen (heterozygoten) Mausstamm verpaart werden. Beispielsweise kann dies eine p53-Knock-out-Maus sein (p53+/-) [Donehower et al., Nature 356, 215-221, 1992], bei dem eines der funktionellen endogenen p53-Allele durch Unterbrechen der codierenden Sequenzen durch eine Fremd-DNA funk tionslos gemacht worden war. Die Nachkommen dieser Verpaarung (p53+^phuki/-) beherbergen ein funktionsloses Maus-p53-Allel und ein funktionelles hybrides Maus/Mensch p53-Allel, das sich von dem normalen funktionellen Mausallel nur bezüglich der DNA-Sequenz in den entsprechenden Exons (5-9) und den Zwi schensequenzen unterscheidet. Diese sind mit der Sequenz des normalen mensc hlichen p53-Gens identisch. So wird das rekombinante Gen immer noch von dem normalen p53-Promotor der Maus kontrolliert. Ebenso sind die Chromatin struktur, die biologischen Parameter und die Genumgebung unverändert.

Die zur Gensubstitution verwendbaren Plasmide 14-1-3 und 29-38 wurden am 16. Dezember 1997 bei der DSMZ Braunsschweig (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig) unter den Hinterlegungs nummern DSM 11904 (14-1-3) und DSM 11905 (29-38) hinterlegt.

Um verschiedene Krebsrisikofaktoren mittels des erfindungsgemäßen transgenen Säugers auszutesten, wird von in diesem Gebiet bekannten Arbeitsweisen Gebrauch gemacht. Diese sind beispielsweise beschrieben in:

- Hussain et al., Carcinogenesis 18, 121-125 (1997)
- Macé et al., Carcinogenesis 18, S. 1291-1297 (1997)
- Dumaz et al., Carcinogenesis 18, S. 897-904 (1997) [Behandlung mit UV-Licht]
- Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, S. 1013-1017 (1993) [Behand lung mit Benzopyrenen]
- Sell et al., Cancer Res. 51, S. 1278-1285 (1991) [Behandlung mit Aflato xin B1].

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, die zeigen:

Fig. 1 Konstruktion eines p53-Maus-Mensch-Hybridgens.

Fig. 2 Schritte zur Konstruktion eines Gentransfer-Vektors ("Gene Target ing")
einfache Linien: p53-Intron-Sequenzen
schwarze Rechtecke: p53-Exon-Sequenzen
: LoxP-Stellen zur Exzision mittels CRE-Rekombinase
Fragment A:
Maus-p53 genomisches DNA-Fragment enthält die Exons 2, 3 und 4 mit den dazwi schen liegenden Intronsequenzen kloniert aus dem Maus 129/SV-Genom
Fragment B:
Arzneimittelresistenz-Selektionskassette enthält die kodierende genetische Information für Neomycin-Resistenz und Gangcylovir-Sensi tivität. Die Kassette hat ihre eigenen Promoto ren.
Fragment C:
menschliches p53 genomisches DNA-Fragment enthält die Exons 5, 6, 7, 8, 9 mit den dazwi schen liegenden Intronsequenzen
Fragment D:
Maus-p53 genomisches Fragment enthält Exon 10 mit flankierenden Intronse quenzen

Fig. 3 Rekombinationsschema.

Das erfindungsgemäße Modell kann zu Mutagenitäts- bzw. Karzinogenitäts studien verwendet werden, um Chemikalien aller Art auf ihr krebserzeugendes Potential zu testen. Alle Produkte oder deren Metaboliten, die unmittelbar (z. B. durch direkte DNA-Adduktbildung in diesem Gen) oder mittelbar (z. B. durch Begünstigung von endogenen mutagenen Addukten in diesem Gen) zu Muta tionen in p53 beitragen, sind als potentiell krebserzeugend für den Menschen einzustufen, besonders wenn sie Mutationen hervorrufen, die bereits in der p53-Datenbank gespeichert sind. Für die Untersuchung von DNA-Mutationsspektren in der neuen PHUKI-Maus stehen bekannte Methoden zur Verfügung, die bereits wenige Mutationen in Tumoren (Lehman et al., Cancer Res. 51, S. 4090-4096, 1991) oder Addukte bzw. wenige Mutationen in p53-mutierten Zellen von nicht maligen Geweben erkennen können (vgl. Science, 274, S. 430-432, 1996 und Science 264, S. 1317-1319, 1994). Das Modell kann auch dazu dienen, Diagno stika zur Früherkennung von Mutationsmustern beim Menschen zu testen. Mit einem derartigen Modell können sowohl die Kosten als auch der Zeitbedarf für Tierversuche erheblich gesenkt werden, da die Zeit bis zur Erzeugung eines Mutationsspektrums in p53 in nicht-maligen Geweben wesentlich kürzer ist als die zur Erzeugung von Mutationsspektren in Tumoren (mit p53-Mutationen) notwendige Zeitspanne.

Um neue Arzneistoffe auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore zu testen, werden in dem transgenen Tier mit chemischen oder anderen Karzinoge nen Tumore mit humantypischen Mutationen im p53-Gen erzeugt. Diese werden dann mit den jeweiligen Testpharmaka behandelt. Ein Wirkstoff, der mutierte, konformationsveränderte p53-Proteine in Tumoren zur Wildtyp-Funktion über führt, macht die Tumorzellen apoptosesensibel und löst damit das Selbstmord programm im Tumor aus. Dadurch sollte es zu einer Remission bzw. Regression des Tumors kommen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1 Konstruktion eines Rekombinationsvektors

Zur Konstruktion eines Gensubstitutionsvektors wurde eine Genbank aus DNA des Mausstamms 129/SV im Lambda Fix II-Phagen (Fa. Stratagene Inc. La Jolla, CA) mit einer cDNA-Probe gescreent, die dem Maus p53 Gentranskript ent spricht. Es wurde ein Phage mit einem 14 kb Insert des funktionellen p53-Gens der Maus isoliert (genannt Strat #1). Ein 3,8 kb KpnI/XbaI-Fragment und ein 2,3 kb BamHI/XbaI-Fragment wurden aus Strat #1 mittels Restriktionsverdau her ausgeschnitten und getrennt jeweils in Plasmid pGEM 3Z/A (käuflich erhältlich von Fa. Promega) einkloniert, was die Klone 2QG und 4A ergibt. Aus Klon 2QG wurde ein KpnI/XbaI-Fragment (Fragment A, s. Fig. 2) wieder herausgeschnit ten und dann in den pBluescript II KS Vektor (käuflich erhältlich von Fa. Strata gene) kloniert. Die Neomycin-Resistenz/Thymidin-Kinase-Gene, die im Plasmid pHR1 (erhalten von Dr. Kästner, DKFZ Heidelberg) flankiert von IoxP-Erken nungsstellen (für die anschließende cre-Rekombinase-gesteuerte Exzision) enthalten sind, wurden als XbaI/HindIII-Fragment (Fragment B; s. Fig. 2) an Fragment A im Bluescript II KS-Vektor kloniert. Es wurde Klon 25-34 erhalten. Das menschliche Fragment C (s. Fig. 2) wurde durch PCR-Amplifikation von menschlicher genomischer DNA unter Verwendung der Primer (M09: 5'-TGCAG- GTACCCGGCATTTTGAGTGTTAGAC-3' und MO5A: 5'-CGATAC- TAGTGTTTCTTTGCTGCCGTGTTC-3') erhalten. Fragment C enthält das men schliche p53-Gen von Exon 5 bis 9 (und dazwischenliegende Introns). Fragment C sowie ein Kpn/NotI-Fragment (Fragment D, s. Fig. 2) aus Klon 4A wurden in pBluescript KS II einkloniert, was Klon 21-6 ergibt. Die erhaltenen Klone wurden unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Didesoxynukleotide mit einem ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) zur Überprüfung sequenziert. Eine SpeI/NotI-Fragment aus Klon 21-6 (enthält die Fragmente C + D) wurde nun in Plasmid 25-35 kloniert. Das fertige Konstrukt trägt nun A + B + C + D. Dieses Konstrukt entspricht dem oben erwähnten hinterlegten Plas mid 29-38 (Phuki-Test-Konstrukt). Der weitere hinterlegte Klon 14-1-3 ist mit 29-38 identisch, außer daß Klon 29-38 in Fragment C eine Missense-Mutation enthält, die an Codon 192 in Exon 6 eine Aminosäurensubstitution auslöst, während Fragment C in 14-1-3 dem Wildtyp entspricht und somit den "Proto typ" darstellt. Konstrukt 29-38 kann dagegen als Test-Mutante in den Experi menten dienen, was besonders interessant ist, da 4% der Punktmutationen in menschlichen Tumoren in dem veränderten Codon stattfinden.

Beispiel 2 Erzeugung der PHUKI-Maus

Die in Beispiel 1 erhaltenen Plasmide 14-1-3 und 29-38 wurden nach Linearisie rung durch Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym "NotI" jeweils mittels Elektroporation mit einem einzigen Puls von 260 V/500 µF in pluripotente em bryonale Stammzellinien der Maus 129/Sv (20 µg/10⁷ Zellen; E14.1 bzw. MB-1 erhalten von Dr. Wang, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, Frankreich) insertiert. Geeignete neomycinresistente, das homologe Rekombinationsereignis tragende Klone wurden selektioniert. Die genomische DNA aus diesen Klonen wurde mittels Southern-Blot getestet, um die Integration des Plasmids durch homologe Rekombination zu bestätigen. Das Rekombina tionsschema ist in Fig. 3 gezeigt.

Zellklone, die nach PCR-Analyse die korrekt einrekombinierte Sequenz enthielten, wurden isoliert und durch Southern-Analyse weiter analysiert.

Stabil transfizierte Zellklone wurden isoliert und die Selektionskassette (Frag ment B) mit CRE-Rekombinase herausgeschnitten. Dies hat den Vorteil, daß die Maus p53 Intron 4-Sequenzen nicht länger von den 3 Kb des eingefügten Arzneimittelresistenz-Gens unterbrochen werden, was die korrekte p53-Gen transkription oder mRNA-Reifung stören könnte, falls man Fragment B nicht entfernen würde. Die nun erhaltenen Klone werden dann in Blastocyten injektiert und in geeignet vorbereitete weibliche Mäuse (pseudo-schwanger) implantiert. Die Nachkommen dieser Maus enthalten dann das ausgetauschte Genteil. Sie werden nach Rückkreuzungsverpaarung als PHUKI-Mäuse (p53 Human Knock-in Maus) bezeichnet und können für die gewünschten Experimente eingesetzt werden oder event. nochmals mit anderen Mäusestämmen verpaart werden.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Säugers, wobei eine embryonale Stammzellinie eines nicht-menschlichen Säugers mit einem geeigneten Rekombinationsvektor transfiziert wird, stabil trans fizierte Zellclone isoliert werden, in geeignet vorbereitete weibliche Tiere eines nicht-menschlichen Säugers implantiert werden und die erhaltenen Nachkommen auf das Vorhandensein des Genaustausches selektioniert werden, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Rekombinationsereignis die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktio nell ersetzt wird, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genom ische Sequenz vorliegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einge schleuste Sequenz die p53-Wildtyp-Sequenz eines anderen Säugers ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einge schleuste Sequenz eine oder mehrere für eine Krebsart, ausgewählt aus Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymp homen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typische Mutation(en) in p53 enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einge schleuste Sequenz die Exons 5 bis 9 des p53-Gens eines anderen Säugers in unveränderter oder mutierter Form umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz aus dem menschlichen p53-Gen stammt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-menschliche Säuger ein Nager, insbesondere eine Maus ist.

7. Transgener nicht-menschlicher Säuger, bei dem die Gesamtheit oder einen Teil des p53-Gens durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.

8. Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die p53-Wildtyp-Sequenz eines anderen Säugers ist.

9. Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz eine oder mehrere für eine Krebsart, ausgewählt aus Kolon-, Lungen-, Leber-, Brust-, Blasen-, Speiseröhrenkrebs, sowie Lymphomen, Osteosarkomen und Neurofibrosarkomen, typische Mutation(en) in p53 enthält.

10. Säuger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz die Exons 5 bis 9 des p53-Gens eines anderen Säugers umfaßt.

11. Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste Sequenz vom menschlichen p53-Gen stammt.

12. Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nager, insbesondere eine Maus, ist.

13. Selektierbar markierter Rekombinationsvektor zur homologen Rekom bination in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

14. Rekombinationsvektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er das Plasmid 14-1-3 bzw. 29-38, hinterlegt am 16. Dezember 1997 bei der DSMZ Braunschweig (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) unter den Hinterlegungsnummern DSM 11904 bzw. DSM 11905 ist.

15. Stabil transfizierter Zellclon, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtheit oder ein Teil des p53-Gens eines nicht-menschlichen Säugers durch ein homologes p53-Gen oder einen homologen p53-Genabschnitt eines anderen Säugers funktionell ersetzt ist, wobei die jeweils eingeschleuste Sequenz als genomische Sequenz vorliegt.

16. Verfahren zum Test von neuen Arzneistoffen auf ihre Wirksamkeit gegen menschliche Tumore, dadurch gekennzeichnet, daß man einen transgenen nicht-menschlichen Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 12 mit dem neuen Arzneistoff behandelt und die Tumorregression bzw. -remission nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.

17. Verfahren zum Test von Chemikalien auf ihr p53-mutagenes bzw. krebsin duzierendes Potential, dadurch gekennzeichnet, daß man einen trans genen nicht-menschlichen Säuger nach einem der Ansprüche 7 bis 12 mit der Chemikalie behandelt und die Mutationsspektren bzw. die Tumorin duktion nach an sich bekannten Verfahren bestimmt.

18. Verwendung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugers nach einem der Ansprüche 7 bis 12 zum Austesten von Medikamenten, Chemikalien und Therapieansätzen.