DE69933299T2

DE69933299T2 - Verfahren zur identifizierung von mutanten und molekülen

Info

Publication number: DE69933299T2
Application number: DE69933299T
Authority: DE
Inventors: F. William Madison DOVE; Alexandra Madison SHEDLOVSKY
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: AU770538B2; EP1095165A1; JP2002520070A; EP1095165B1; US20020133831A1; DE69933299D1; IL140598A0; ATE340268T1; WO2000004186A1; CA2337406C; NZ509171A; US6949692B2; AU4984399A; CA2337406A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Weltweit bemüht man sich, die genomischen DNA-Sequenzen von Menschen und Tieren zu bestimmen. Diese Bemühungen konzentrieren sich typischerweise auf die Gewinnung von Sequenzinformationen aus cDNAs in Bibliotheken, die aus RNAs verschiedener Gewebe erzeugt worden sind. Somit umfassen Sammlungen von "exprimierten Sequenzmarkierungen" (ESTs) Teile von Kodierungsregionen aus den meisten humanen Genen.
Obgleich ESTs wertvolle Strukturinformationen liefern, vermitteln sie nur geringe Erkenntnisse über die funktionellen Beziehungen zwischen den Genen. Die funktionellen Beziehungen sind von besonderer Bedeutung zur Bestimmung des Satzes von Genen, der an einem biologischen Vorgang beteiligt ist und somit zur. Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln, die eine oder mehrere der Komponenten des biologischen Vorgangs beeinflussen; vergl. z. B. G. A. Friedrich, "Moving Beyond the Genome Projects: Does the Future of Genomics-Based Drug Discovery Lie With the Mouse?" Nature Biotechnology, Bd. 14 (1996), S. 1234- 1237.
Friedrich argumentiert zu Gunsten der Verwendung von Modellsystemen, die die humane Physiologie widerspiegeln, bei der Bestimmung der Gene, die an einem biologischen Vorgang beteiligt sein können, und vertritt die Auffassung, dass die Maus einen hervorragenden Modellorganismus für die humane Biologie insofern darstellt, als sie mit dem Menschen die wichtigsten Aspekte der Säugetierphysiologie gemeinsam hat. Die Genome von Maus und Mensch weisen in etwa die gleiche Größe, Organisation und Struktur auf. Friedrich macht den Vorschlag, dass die Maus als wirksames Werkzeug für die Arzneistoffentwicklung entwickelt werden kann. Friedrich macht einen "radikalen" Vorschlag dahingehend, dass es keine logische Barriere gibt, die einen Hinderungsgrund für phänotypische Screeningmaßnahmen im Grußmaßstab unter Verwendung von Mäusen darstellt.
Friedrich schlägt vor, ein Insertionsmutagen in embryonalen Stammzellen zu verwenden, um willkürliche Mutationen im Mäusegenom zu erzeugen und anschließend ein Screening auf eine Vielzahl von vorgegebenen Phänotypen und eine Klonierung von betroffenen Genen vorzunehmen.
Insbesondere sind die Physiologie und die Behandlung von Kolonkrebs von besonderem biomedizinischem Interesse. Kolonkrebs ist in der westlichen Welt eine der häufigsten malignen Erkrankungen, wobei allein in den Vereinigten Staaten pro Jahr schätzungsweise 145 000 neue Fälle und 60 000 Todesfälle auftreten. Genetische Faktoren spielen bei dieser Krankheit eine Schlüsselrolle. Mutationen im humanen, adenomatösen Polyposis coli (APC)-Gen stellen die Ursache einer. Gruppe von familiären Kolonkrebs-Syndromen dar. Mäuse, die eine Mutation im entsprechenden Gen (Apc) aufweisen, entwickeln auch zahlreiche intestinale Adenome.
Heterozygoten für die Min-Allele (Min = multiple intestinale Neoplasie) des Mäuse-Apc-Gens entwickeln zahlreiche intestinale und Kolon-Adenome [durchschnittlich 29 Å 10 vor einem C57BL/6J- (oder einem äquivalenten Derivat) -Hintergrund], die eine ähnliche Morphologie wie die Adenome aufweisen, die bei humanen, vererbten Kolon-Polypose-Syndromen auftreten, z. B. bei familiärer, adenomatöser Polypose und beim Gardner-Syndrom. Min/Min-Homozygoten sterben in utero. Die Min-Mutation befindet sich am Mäusechromosom 18. Die Sequenz des Apc-Gens ist bekannt und veröffentlicht. Min-Mäuse tragen eine nonsense-Mutation im Exon 15 des Mäuse-Apc-Gens (eine Mutation der Art, die typischerweise bei humanen Kolonkrebs-Arten auftritt). Mäuse mit Min stellen somit ein Modellsystem zur Untersuchung von humaner, familiärer, adenomatöser Polypose dar.
Ein Locus (Mom-1), der stark die Tumorzahl bei Heterozygoten Min/+-Mäusen modifiziert, wurde dem distalen Chromosom 4 zugeordnet; W. F. Dietrich et al., "Genetic Identification of Mom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse", Cell, Bd. 75 (1993), S. 631-639. Mom-1 liegt in einer Region der Syntenie-Konservierung mit dem humanen Chromosom 1p35-36, einer Region mit häufigem somatischem Verlust an heterozygoter Beschaffenheit in einer Vielzahl von humanen Tumoren, einschließlich Kolontumoren. Mom-1 stellt nur einen einer unbekannten Vielzahl von Loci dar, die die Expression eines ererbten Krebssyndroms modifizieren, und erklärt nicht die Gesamtheit der genetischen Variation der Tumorzahlen in intraspezifischen Rückkreuzungen.
WO-98/22622 beschreibt ein Verfahren zur Züchtung von mutagenisierten Mäusen, das den Nachweis von genetischen Loci ermöglicht, die einen bekannten Index-Phänotyp modifizieren können. Dieses Verfahren beinhaltet die Kreuzung eines mutagenisierten Gründerstammes und eines zweiten Stammes von Mäusen, die eine Allele an einem Locus tragen, der den Index-Phänotyp verleiht. In der Testgeneration werden Cluster von Individuen beobachtet, die vom typischen Phänotyp abweichen.
Es besteht ein Mangel an einem systematischen Verfahren zur Lokalisierung von genetischen Loci, die an der Modifikation bekannter Phänotypen durch Verstärkung oder Suppression beteiligt sind. Im speziellen Fall von Kolonkrebs bei Menschen und Tieren wäre es erstrebenswert, die Sequenzen im Genom (und die durch diese Sequenzen kodierten Moleküle) zu lokalisieren, die am Auftreten von intestinalen Adenomen beteiligt sind. Der Mangel an einer derartigen systematischen Methode hat das Verständnis der Onkogenese eingeschränkt und somit die Entwicklung von pharmazeutischen Präparaten, die den onkogenen Vorgang modifizieren, behindert. Ein systematisches Verfahren sollte nicht nur nicht-essentielle Loci, für die zahlreiche mutante Allelen unter Homozygoten Inzucht-Mäusestämmen gefunden werden, umfassen, sondern auch essentielle Loci, für die mutante Allelen in heterozygoter Form den Phänotyp beeinflussen können. Mutationen, die ein essentielles Gen inaktivieren, sind normalerweise dann, wenn sie homozygot sind, letal und treten daher unter Inzucht-Mäusestämmen nicht auf.
Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erlaubt den Nachweis eines genetischen Locus oder von Loci, die einen gewählten bekannten Phänotyp, der durch eine gewählte dominante Allele verliehen wird, modifizieren kann. Das Verfahren umfasst einen mutagenen Prozess, der das Identifizieren und Isolieren der genetischer Sequenzen, die für die Moleküle, die den gewählten Phänotyp modifizieren können, kodieren, sowie der den Phänotyp modifizierenden Moleküle selbst erleichtert.
Das Verfahren kann unter Verwendung von Inzuchtstämmen von nichthumanen Tieren ausgeübt werden, wobei es sich vorzugsweise um Säugetiere und insbesondere um Nagetiere handelt. Es sind Inzuchtstämme von Mäusen, Ratten und Kaninchen verfügbar. Beim vorliegenden Verfahren stellen Mäuse die nicht-humanen Säugetiere der Wahl dar, und zwar aufgrund der Syntenie zwischen Menschen und Mäusen und aufgrund der Tatsache, dass die Genetik und Züchtung von Mäusen hochgradig entwickelt ist. Ferner kann die Maus Krankheitsphänotypen aufweisen, die sehr ähnlich wie beim Menschen sind, wie es in der beispielhaften Ausführungsform der Fall ist. Die murinen genetischen Sequenzen und die bei dem Verfahren erhaltenen Moleküle werden dazu verwendet, entsprechende Sequenzen und Moleküle von Menschen zu erhalten. Die humanen Sequenzen und Moleküle können sodann in bekannten Verfahren zur Entwicklung von pharmazeutischen Mitteln verwendet werden.
Das grundlegende Inzuchtverfahren umfasst die nachstehend aufgeführten Stufen. Jeweils ein Satz von Mäusen eines Gründerinzuchtstammes wird mutagenisiert und sodann zum gleichen Inzuchtstamm gezüchtet, um eine Inzuchthaltegeneration ("Generation 1" oder "Gen1") zu erzeugen. Die Tiere des Gen1-Gründermäusestammes tragen willkürliche Punktmutationen relativ zu Wildtypmäusen dieses Stammes. Gen1-Mäuse werden einer Fremdeinkreuzung mit einer Maus eines Index-Inzuchtmäusestammes unterzogen, um eine Gen1F₁-Nachkommenschaft zu erhalten. Der Index-Inzuchtmäusestamm trägt eine dominante Allele an einem Locus, von dem bekannt ist, dass er einen gewählten Phänotyp verleiht. Der gewählte Phänotyp wird als "Indexphänotyp" bezeichnet. Der Indexphänotyp, der das Screeningverfahren auf den Phänotyp von Interesse richtet, ist in einem Indexstamm charakterisiert und liefert einen Referenzphänotyp, mit dem mögliche Mutanten verglichen werden können. Die dominante Indexallele kann einen beliebigen Zustand umfassen, der einen biologischen Prozess in einen Bereich bringt, in dem er auf heterozygote Verstärker- oder Suppressormutationen der erfindungsgemäß identifizierten Art reagiert. Bei dem Zustand kann es sich um einen erkennbaren genetischen Zustand handeln oder es könnte sich auch um einen nichtgenetischen umweltbedingten Zustand handeln. Mindestens einige Mitglieder der Gen1-Gen1-F₁-Nachkommen tragen sowohl. die dominante Allele als auch mindestens eine willkürliche Mutation, die den durch die dominante Allele verliehenen Indexphänotyp modifizieren kann. Ein Gründertier wird als interessant beurteilt, wenn eine Untergruppe seiner Gen1F₁-Nachkommenschaft in Bezug auf den Indexphänotyp umfassend modifiziert ist.
Wenn eine Gründermaus mindestens einen Gen1F₁-Nachkommen hat, der einen modifizierten Phänotyp relativ zu Kontrolltieren zeigt, wird das Gründertier (Gen1) mit einer nicht-mutagenisierten Maus des Gründerstammes gekreuzt, um eine zweite Generation (Gen2) von Nachkommen zu erzeugen. Diese Nachkommen werden erneut mit dem Indexstamm fremdeingekreuzt, um Gen2F₁-Nachkommen zu erhalten. Das Vorliegen einer Phänotyp-modifizierenden Mutation wird sodann verifiziert, wenn eine Untergruppe der Gen2F₁-Nachkommen ebenfalls in Bezug auf den Indexphänotyp modifiziert ist. Ein Cluster von Tieren mit modifizierten Indexphänotypen liefert in zunehmendem Maße Sicherheit, dass der Gen1-Gründer eine Mutation von Interesse trägt.
Genetisches Material, das die Phänotyp-modifizierende Mutation umfasst, kann sodann unter Anwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden. Moleküle, die durch das genetische Material kodiert werden, können ebenfalls erhalten werden. Die erhaltenen genetischen Materialien und Moleküle (oder entsprechende humane Äquivalente) werden in aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren eingesetzt, um pharmazeutische Mittel zu erzeugen, die Phänotypen bessern können, die bei humanen oder nicht-humanen Patienten, die vom biologischen Vorgang von Interesse betroffen sind, festgestellt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer raschen, fokussierten Vorgehensweise, um Gene in einem Modellsäugetierorganismus zu erhalten, die einen biomedizinisch relevanten Phänotyp beeinflussen können.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Verfahren gleichzeitig eine Gruppe von mehreren Genen identifizieren kann, die den Indexphänotyp modifizieren können.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Verfahren Gene, die keinen anderen bekannten Phänotyp aufweisen, aufdecken kann.
Die vorliegende Erfindung bietet gegenüber vorhandenen Verfahren zur Gewinnung von Genen, wie eine Analyse von ESTs, Vorteile insofern, als die im vorliegenden Verfahren sichergestellten Gene notwendigerweise für einen biologischen Phänotyp relevant sind. Im Gegensatz dazu können Genom-Sequenzierungsverfahren voluminöse Sequenzinformationen für zahlreiche Gene liefern, bieten aber nur wenige oder gar keine Richtlinien bezüglich der funktionellen Beziehung unter den sequenzierten Genen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren einer segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Einzelpunktmutation in nicht-humanen Tieren bereitgestellt, wobei die Einzelpunktmutation an einem Modifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
Fremdeinkreuzung (Outcrossing) eines ersten männlichen Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das männliche Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, mit einem zweiten weiblichen Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, wobei das weibliche Tier eine dominante Allele am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp zeigt und genetisch vom Gründerinzuchtstamm unterscheidbar ist, um eine F₁-Nachkommenschaft zu erzeugen, von der ein Teil sowohl die dominante Allele am Indexlocus als auch mindestens eine willkürliche Punktmutation trägt;
Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den das weibliche Tier des Indexinzuchtstammes zeigt, aufweisen, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist; Rückkreuzen eines männlichen F₁-Individuums, das den abweichenden Phänotyp zeigt, mit einem weiblichen Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne die dominante Allele am Indexlocus zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die die dominante Allele trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist; und
Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende, Indexphänotyp-modifizierende Einzelpunktmutation hervorgerufen worden ist.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren einer humanen genetischen Sequenz, die einer segregierenden Indexphänotyp-modifizierenden Mutation in nicht-humanen Tieren entspricht, bereitgestellt, wobei die Segregationsmutation an einem Modifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
Fremdeinkreuzung eines ersten Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das erste Tier willkürliche Punktmutationen relativ zum Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes zeigt, mit einem zweiten Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, wobei das zweite Tier eine dominante Allele am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp aufweist und genetisch vom ersten Tier des Gründerinzuchtstammes unterscheidbar ist, zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, von der ein Teil sowohl die dominante Allele am Indexlocus als auch mindestens eine willkürliche Mutation trägt;
Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den das zweite Tier des Indexinzuchtstammes zeigt, aufweist, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist; Rückkreuzen eines F₁-Individuums, das den abweichenden Phänotyp zeigt, mit einem Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne die dominante Indexallele zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die die dominante Allele trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist;
Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende Mutation hervorgerufen wird;
Identifizieren von genetischen Markern, die mit der segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Mutation verknüpft sind;
Identifizieren eines Gens an einem Contig, das für die segregierende, Indexphänotyp-modifizierende Mutation kodiert; und
Gewinnen von humanen genetischen Sequenzen, die dem für die Mutation kodierenden Gen entsprechen.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren einer segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Mutation in nicht-humanen Tieren bereitgestellt, wobei die Mutation an einem Modifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
Kreuzen eines ersten Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das erste Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, mit einem zweiten Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, der einen gemeinsamen isogenen genetischen Hintergrund mit dem Gründerinzuchtstamm aufweist, wobei das zweite Tier eine kongene dominante Allele am Indexlocus trägt, zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, von der ein Teil die dominante Allele trägt und einen abweichenden Phänotyp aufweist; und
Verifizieren, dass die F₁-Nachkommenschaft, die die dominante Allele trägt und einen modifizierten Indexphänotyp aufweist, eine segregierende Mutation trägt.
Ferner wird eine genetisch veränderte Maus beschrieben, die in ihrem Genom folgendes umfasst:
eine kongene, dominante, heterozygote Allele, die der Maus einen Indexphänotyp verleiht;
einen segregierenden Modifikator des Indexphänotyps, wobei der Modifikator einer Einzelpunktmutation zuzuschreiben ist; und
einen Einzelnucleotid-Kartierungspolymorphismus, der genetisch mit der Einzelpunktmutation verknüpft ist.
Beschrieben wird ferner ein nicht-humanes Tier, das eine segregierende Mutation aufweist, die einen durch einen Indexlocus verliehenen Indexphänotyp modifiziert, wobei das Tier durch ein Verfahren erzeugt worden ist, das die folgenden Stufen umfasst:
Fremdeinkreuzung (Outcrossing) eines männlichen Tiers eines nichthumanen Gründerinzuchtstammes mit einem weiblichen Tier eines nichthumanen Indexinzuchtstammes zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, wobei das männliche Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, wobei das weibliche Tier eine kongene dominante Allele am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp zeigt und genetisch von einem Tier des Gründerinzuchtstammes unterscheidbar ist, wobei ein Teil der F₁-Nachkommenschaft sowohl die dominante Allele als auch mindestens eine willkürliche Punktmutation trägt;
Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den das zweite Tier des Indexinzuchtstammes zeigt, aufweisen, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist;
Rückkreuzen von Gameten aus der männlichen F₁-Nachkommenschaft, die den abweichenden Phänotyp zeigen, mit mindestens einem weiblichen Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne die dominante Indexallele zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die die dominante Allele trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist;
Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende Mutation hervorgerufen worden ist; und
Auswählen eines Tiers, das den abweichenden Phänotyp zeigt.
Ferner wird ein nicht-humanes Tier beschrieben, das eine segregierende Mutation umfasst, die einen durch einen Indexlocus verliehenen Indexphänotyp modifiziert, wobei das Tier durch ein Verfahren erzeugt. worden ist, das die folgenden Stufen umfasst:
Kreuzen eines ersten Tiers eines Gründerinzuchtstammes mit einem zweiten Tier eines Indexinzuchtstammes zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, wobei das erste Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, das zweite Tier einen gemeinsamen isogenen genetischen Hintergrund mit dem Gründerstamm aufweist und eine kongene dominante Allele am Indexlocus trägt, wobei ein Teil der F₁-Nachkommenschaft die dominante Allele trägt und einen in bezug zum Indexphänotyp des zweiten Tiers abweichenden Phänotyp aufweist;
Verifizieren, dass die F₁-Nachkommenschaft, die die dominante Allele trägt und den abweichenden Phänotyp aufweist, eine segregierende Mutation trägt; und
Auswählen eines Tiers, das den abweichenden Phänotyp zeigt.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Aspekte der Zeichnung
1 zeigt die Wahrscheinlichkeit des Überlebens von Gen1F₁-Mäusen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet worden sind. 1 stellt ferner die Überlebenszeiten von Individuen von vier Verwandten ("kindreds") dar, die Nachkommen mit längeren oder kürzeren Überlebenszeiten relativ zur durchschnittlichen Überlebenszeit von Gen1F₁-Mäusen, die die Index-Min-Allele tragen, aufwiesen. Die länger überlebenden Suppressor (Su)-Kandidat-Verwandten 248 und 258 sind als Quadrate dargestellt. Die kürzer überlebenden Verstärker (En)-Kandidaten-Verwandten 333 und 425 sind als Kreise dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, genetische Loci und genetische Sequenzen zu identifizieren, die einen bekannten Phänotyp modifizieren können. Obgleich eine derartige Analyse unter Anwendung einer Mutagenese bei Menschen aus ethischen Gründen nicht durchgeführt werden kann, bietet die Syntenie und die Sequenzkonservierung zwischen humanen und murinen Genomen eine einfache Brücke, um derartige Loci und Sequenzen beim Menschen zu identifizieren. Es ist wahrscheinlich, dass derartige Sequenzen mit vorhandenen humangenetischen Sequenzinformationen korrelieren. Somit können äquivalente Loci und genetische Sequenzen im humanen Genom unter Anwendung herkömmlicher, verfügbarer Hybridisierungs- und PCR-Techniken gesucht werden.
Beim Verfahren handelt es sich um ein Index-gerichtetes, Clusterverstärktes, Modifkator-Locus und Molekül-Identifikationsverfahren, das als ein "ICMM-Verfahren" bezeichnet werden kann.
Die Verfügbarkeit von Inzuchtmäusen mit einer gut definierten genetischen Zusammensetzung und gut untersuchten Phänotypen, die humane Syndrome, Krankheiten und andere Zustände modellartig abbilden, machen die Maus zur bevorzugten Säugetierspezies, mit der das vorliegende Verfahren ausgeführt wird. Eine bevorzugte Mäusespezies ist Mus musculus.
Das hier beschriebene Züchtungssystem stützt sich auf die Existenz eines Phänotyps, der in Mäusen evident ist, die in Bezug auf die Allele, die den gewählten Indexphänotyp verleiht, heterozygot sind. Es ist durchweg bevorzugt, einen Indexstamm zu verwenden, der eine Allele trägt, die den Indexphänotyp im heterozygoten Zustand ergibt. Der Indexphänotyp kann durch visuelle, biochemische oder andere Nachweisverfahren "evident" gemacht werden. Die den Phänotyp steuernde Allele kann letal sein, wenn sie im homozygoten Zustand vorliegt. Bei Krebs kann sich der Phänotyp entweder auf Wirkungen, die sich aus der Gegenwart einer aktivierten, krebsinduzierenden Allele ergeben, oder auf Wirkungen beziehen, die sich aus der Inaktivierung eines Tumor-Suppressorgens, der die Tumorbildung in Abwesenheit einer normalen Kopie des Gens verursacht, ergeben. Der Phänotyp kann durch eine Allele eines Sexualchromosoms oder eines Autosoms gesteuert werden. Wenn die Allele sich auf einem Geschlechtschromosom befindet, können die hier beschriebenen Züchtungen in bekannter Weise modifiziert werden, um zu gewährleisten, dass die Allele im Züchtungspool erhalten bleibt.
Der Indexphänotyp wird vorzugsweise durch eine einzige dominante Allele verliehen, obgleich Phänotypen unter der Kontrolle von mehr als einem Locus im Verfahren untersucht. werden können, indem man für die Erzeugung von geeigneten Gründertieren sorgt. Es ist nicht notwendig, dass es sich bei der den Phänotyp verleihenden Allele um eine definierte genetische Sequenz handelt, vielmehr kann die Allele durch klassische genetische Verfahren definiert werden. Es ist vorteilhaft, dass die Allele fest mit einem genetischen Marker für die Genotypanalyse verknüpft ist, wie es hier an anderer Stelle beschrieben wird. Mit der derzeit verfügbaren dichten Mikrosatellitenkarte des Mäusegenoms wird dieser Zustand immer erfüllt.
Den Phänotyp modifizierende Loci werden erfindungsgemäß erhalten. Bei einer "Modifikation" handelt es sich um eine beliebige nachweisbare Veränderung im Indexphänotyp relativ zu Kontrolltieren, denen die den Phänotyp modifizierende Allele fehlt, unter Einschluss von (ohne Beschränkung hierauf) einer Verstärkung oder Unterdrückung eines Phänotyps, z. B. einer Verlängerung oder Verkürzung der Lebensdauer eines Tiers oder des zirkadischen Verhaltens. Es ist nicht erforderlich, dass das gesamte Tier von der Modifikation betroffen ist. Beispielsweise kann es sich bei einem modifizierten Phänotyp um eine Veränderung eines bestimmten Verhaltens oder um eine Veränderung in der Konzentration eines bestimmten Biomoleküls, z. B. eines Blutproteins, nach Einführung einer den Phänotyp modifizierenden Mutantenallele im erfindungsgemäßen Verfahren handeln. Der Test auf modifizierte Abweichler im ersten Stadium des Screenings, Gen1F₁, ist üblicherweise relativ grob. Man muss beurteilen, ob ein Abweichler im ersten oder letzten 10-Percentilbereich der phänotypischen Verteilung liegt. Beispielsweise kann in einem Stamm von Mäusen mit einer gut definierten Laufaktivität, die durch eine einzige dominante Mutation ("Clock") gesteuert wird, das hier beschriebene Verfahren dazu verwendet werden, Tiere zu erhalten, bei denen ein modifizierter zeitlicher Ablauf dieser Laufaktivität vorliegt. Das genetische Material (und Proteinmoleküle), die für diese Modifikation verantwortlich sind, lassen sich durch Kartierung und Positionsklonierung der modifizierenden Mutation erhalten.
Das System ist insbesondere für Studien von genetischen Wechselwirkungen bei Krebsarten, von denen bekannt ist, dass sie eine genetische Komponente aufweisen, geeignet. Insbesondere liegt bei Menschen, die ein fehlerhaftes APC-Gen tragen, eine Veranlagung zur Entwicklung zahlreicher Tumoren im Darmtrakt vor. Mäuse, die in Bezug auf die Min-Allele von Apc, dem murinen Homologen von humanem APC, heterozygot sind, entwickeln ebenfalls zahlreiche Tumoren im Darmtrakt, die ähnlich den humanen, vererbten Kolon-Polyposesyndromen sind. Hier wird nachgewiesen, dass Mutationen, die im Genom an einer anderen Stelle als am Apc-Locus herbeigeführt worden sind, die Überlebensrate und die intestinale Tumorbelastung von Mäusen, die die Min-Allele an diesem Locus tragen, modifizieren können.
Mehrere wichtige Züchtungsüberlegungen bestimmen die Richtung bei der Auswahl von Inzuchtmäusestämmen zur Verwendung in diesem Verfahren. Es ist ersichtlich, dass der Fachmann auf dem Gebiet der Mäusezucht mit den Züchtungserfordernissen von verfügbaren Mäusestämmen vertraut ist, so dass diese Erfordernisse hier nicht aufgeführt werden müssen.
Bei dem Stamm, in dem die willkürlichen Mutationen eingeführt werden, muss es sich um einen Inzuchtstamm handeln, so dass sämtliche Modifikationen das Ergebnis der eingeführten Mutagenese und nicht einer genomischen Divergenz sind. Der Stamm soll gegenüber einer wirksamen Keimlinien-Mutagenese empfindlich sein. Mit "empfindlich" will die Anmelderin zum Ausdruck bringen, dass der Stamm charakteristische Vorwärtsmutationsraten von mindestens 1/500 pro Gamete pro Locus aufweist. Ferner soll der Stamm eine lange Züchtungsspanne von mindestens einem Jahr aufweisen. Außerdem ist es bevorzugt, dass der Stamm große Würfe hervorbringt, durchschnittlich 8 oder mehr Junge pro Wurf. Ein Stamm, der diese Anforderungen erfüllt, ist der Inzuchtstamm BTBR, der von der Fa. Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, erhältlich ist.
Es ist wichtig, dass der Inzuchtstamm, in dem die Mutationen herbeigeführt werden, vom Stamm, der die den Phänotyp verleihende Allele enthält, unterschieden werden kann, z. B. durch Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP) oder durch einfache Sequenzlängen-Polymorphismen (SSLP). Ein hochgradiges Auftreten von informativen Unterschieden in den üblichen genetischen Markern zwischen den beiden Stämmen ist für die Kartierung und Klonierung etwaiger Mutationen von Interesse von Bedeutung. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde der Indexphänotyp (Min) vor einem Hintergrund von C57BL/6J (oder einem äquivalenten Derivat) (nachstehend als "B6-Min" bezeichnet) bereitgestellt. Ein "äquivalentes Derivat" weist einen Indexphänotyp auf, der mit dem von B6-Min vor einem genuinen C57BL/6J-Hintergrund vergleichbar ist. Der BTBR-Stamm, der für die Mutagenese in dieser Ausführungsform verwendet wird, ist an mindestens der Hälfte der SSLP-Markerloci relativ zum B6-Inzuchtstamm polymorph. In heterozygoter Form hat BTBR keinen starken Einfluss auf den Min-Phänotyp.
Ferner ist es wichtig, dass die beiden im Verfahren verwendeten Stämme relativ frei von polymorphen, dominanten Modifikatoren des gewählten Indexphänotyps sind. Unter "relativ frei" versteht die Anmelderin, dass Unterschiede im Indexphänotyp zwischen Gen1F₁-Tieren und dem Indexstamm ausreichend klein sind, so dass die Effekte der neu induzierten Mutationen nicht maskiert werden. Der Fachmann ist dazu in der Lage, die zulässige Variation für jeden gegebenen Indexphänotyp festzustellen. Beispielsweise sollten im Fall des Min-Indexphänotyps Gen1F₁-Tiere nicht mehr als eine 1,5-fache Veränderung der Tumormultiplizität im Vergleich zu B6-Min aufweisen. Im Clock-Fall sollte die Verschiebung des zirkadischen Rhythmus nicht mehr als 30 Minuten betragen.
Bei dem Verfahren wird der Stamm, der zu mutagenisieren ist, mit einem mutagenen Mittel behandelt, das Mutationen in der Keimlinie herbeiführt. Aus Gründen, die mit dem anschließenden Nachweis und der Isolierung von Mutanten von Interesse im Zusammenhang stehen, ist es wichtig, dass das Mutagen ein wirksames Punktmutagen darstellt, das mindestens eine Mutation pro Locus pro 500 Gameten im Gründertierstamm herbeiführen kann. Ethylnitrosoharnstoff (ENU) stellt ein geeignetes und bevorzugtes Mutagen dar, das fast ausschließliche Punktmutationen in die Mauskeimlinie einführt. Ein geeignetes Verfahren zur ENU-Mutagenese von Mäusen wird von Shedlovsky et al., Genet. Res. Camb., Bd. 47 (1986), S. 135-142, beschrieben. Es ist bevorzugt, jedoch nicht wesentlich, dass die Mutagenese an männlichen Mäusen durchgeführt wird, da es möglich ist, zahlreiche Nachkommen von einem einzigen mutagenisierten männlichen Tier zu erhalten. Die Mäuse werden sodann mit nicht-mutagenisierten Mäusen des gleichen Stammes gekreuzt, um isogene Tiere zu erzeugen, die nur in Bezug auf die verschiedenen, durch die Mutagenese induzierten Mutationen heterozygot sind.
Jedes Mitglied der Gruppe von Gen1-Tieren wird mit Mäusen gekreuzt, die in Bezug auf die Mutation, die den Indexphänotyp verleiht, heterozygot sind. Es ist erstrebenswert, bis zu 1 000 derartiger Gen1-Tiere zu erzeugen, um die statistische Wahrscheinlichkeit, dass jedes der etwa 1×10⁵-Gene im Mäusegenom mindestens 1-mal geprüft wird, ein Maximum erreicht. Wenn die Mutationsfrequenz 1 pro Locus pro 500 Gameten beträgt, enthält eine 1 000 Mitglieder umfassende Bibliothek von Gen1-Tieren durchschnittlich 2 Treffer für jeden Locus, der den Indexphänotyp modifizieren kann. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein auffallender Locus der Aufmerksamkeit entgehen könnte, würde dann e^–2 oder ë10% betragen. Die Kreuzung kann unter Verwendung von Gen1-Tieren beiderlei Geschlechts vorgenommen werden, es sei denn der Indexphänotyp beeinträchtigt die erfolgreiche Züchtung eines Geschlechts. Es ist gelegentlich möglich, einen Nachkommen in Pflege zu geben, wenn das weibliche Elternteil beeinträchtigt ist.
Die Verwandten werden folgendermaßen bewertet. Die phänotypischen Verhaltensweisen der vollständigen Gruppe von Gen1F₁-Tieren wird bewertet, ebenso die Phänotypen von einzelnen Verwandten. Sofern keine Modifikation vorliegt, erstreckt sich das Verhalten der Individuen in der Verwandtschaft über den gesamten Verhaltensbereich der vollständigen Gruppe. Wenn jedoch eine modifizierende Mutation induziert worden ist zeigen aufgrund der Tatsache, dass das Gründerelternteil in Bezug auf die modifizierende Mutation heterozygot war, durchschnittlich 50% der Mitglieder der Verwandtschaft einen abweichenden Phänotyp.
Um die statistische Wahrscheinlichkeit, dass ein modifizierter Phänotyp echt ist, zu erhöhen, ist es bevorzugt, dass die Modifikation bei zwei oder mehr Tieren einer Verwandtschaft mit vier oder mehr Mitgliedern beobachtet wird. Eine weitere Verdichtung des Verfahrens ist unter diesen Umständen möglich; vergl. die nachstehenden Ausführungen. Es ist besonders bevorzugt, dass die Verwandtschaft mindestens 6 Mitglieder aufweist und dass drei oder mehr Mitglieder betroffen sind. Es kann jedoch nützlich sein, kleinere Verwandtschaften, die nur einen einzigen extremen Abweichler aufweisen, zu studieren.
Die weiblichen Elternteile von Verwandtschaften, die eine mögliche Modifikation gemäß dem vorerwähnten Standard zeigen, werden sodann mit nicht-mutagenisierten Mäusen des gleichen Gründerstammes gekreuzt, um die Mutation vor einem fixierten Hintergrund aufrechtzuerhalten (eine "Kopiergeneration"). Die Nachkommen der Kopiergeneration werden erneut mit Mäusen, die in Bezug auf den gewählten Phänotyp heterozygot sind, gekreuzt, um festzustellen, ob einer ihrer Nachkommen eine echt modifizierende Mutation trägt. Eine Genotypanalyse kann durchgeführt werden, um festzustellen, ob diese Nachkommen das Gen tragen, das den Indexphänotyp verleiht. Es kann von besonderer Bedeutung sein, die Nachkommen rasch zu charakterisieren, wenn es sich um einen solchen Phänotyp handelt, der die Lebenserwartung der Gen1-Gründertiere beeinträchtigt.
Mäuse, von denen durch Genotypanalyse gezeigt worden ist, dass sie die Indexdeterminante tragen, werden so früh wie möglich getestet, um festzustellen, ob eine Modifikation ersichtlich ist. Wenn ein derartiger modifizierter Phänotyp beobachtet wird, können die spezifischen genetischen Sequenzen, die für die Modifikation verantwortlich sind, systematisch unter der nunmehr im Stand der Technik verfügbaren Technologie identifiziert werden; vergl. z. B. Y. Zhang et al., "Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue" Nature, Bd. 372 (1994), S. 425-432; K. Kusumi et al., "The mouse pudgy mutation disrupts Delta homologue D113 and initiation of early somite boundaries", Nature Genetics, Bd. 19 (1998), S. 274; und D. P. King et al., "Positional Cloning in the Mouse Circadian Clock Gene," Cell, Bd. 89 (1997), S. 641. Die einzelnen Druckschriften liefern konkrete Beispiele für eine mutationsgeführte Positionsklonierung. Im letztgenannten Beispiel wurden Mutationen mit ENU herbeigeführt. Bei dieser. Verfahrensweise werden murine Kodierungssequenzen an einem Contig (eine zusammenhängende Nucleinsequenz eines Teils eines Chromosoms, bestimmt durch Analyse eines Satzes von überlappenden Bestandteilen von Nucleinsäuresequenzen), die in der Region von mit einer Mutation verknüpften Markern konstruiert sind, identifiziert. Die murinen Kodierungssequenzen wurden durch Exon-Trapping (D. M. Church et al., Nature Genet., Bd. 6.(1994), S. 98-105), Sequenzieren der eingefangenen Exons, Vergleichen der Sequenzen der eingefangenen Exons mit sämtlichen Genbank-Sequenzen, Screening von mutmaßlichen Exons auf die Anwesenheit von entsprechender RNA in einer Vielzahl von Geweben durch Northern-Blots und Umkehr-Transkriptions-PCR identifiziert. Anschließend wurde durch bekannte Verfahren der Hybridisierung mit humanem genetischem Material das entsprechende humane Gen erhalten. Alternativ können PCR-Primer, die aus murinen genetischen Sequenzen hergestellt worden sind, zur Amplifikation von entsprechenden humanen Sequenzen aus humanem genetischem Material verwendet werden. Der Fachmann kann leicht die Ähnlichkeit feststellen, die zwischen von Mäusen abgeleiteten Primern und humanen Zielsequenzen in PCR-Verfahren erforderlich ist.
Obgleich das vorstehend beschriebene Verfahren zum Auffinden von segregierenden Mutationen, die einen Indexphänotyp modifizieren, wirksam ist, wird das Verfahren durch Bereitstellen eines ersten verbesserten Verfahrens verbessert, das rasch Modifikatoren mit einem starken und ausgeprägten, heterozygot verstärkenden oder unterdrückenden Einfluss auf einen Indexphänotyp identifiziert, oder indem man ein zweites verbessertes Verfahren bereitstellt, das die Identifizierung und Kartierung von Modifikatoren durch Verringerung des genetischen Hintergrundgeräusches erleichtert. Die verbesserten Verfahren werden nachstehend beschrieben.
Ferner wird darauf hingewiesen, dass nunmehr männliche Gameten in vorteilhafter Weise im sexuellen Reifezustand (etwa 6 Wochen für Mäuse) geerntet und unbegrenzt aufbewahrt oder in einem in vitro-Fertilisationsverfahren verwendet werden können; vergl. beispielsweise das in der Literatur beschriebene Verfahren von J. M. Sztein, J. S. Farley, A. F. Young und L. E. Mobraaten, "Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing", Cryobiology, Bd. 35 (1) (1998), S. 46-52. Durch Anwendung des Kryokonservierungsverfahrens kann Keimplasma, von dem festgestellt worden ist, dass es eine modifizierende Mutation umfasst, gewonnen und bei einer beliebigen, hier beschriebenen Kreuzung verwendet werden, selbst wenn das Quellentier zu diesem Zeitpunkt für die Züchtung zu alt oder zu krank ist. Jedes männliche Tier liefert eine ausreichende Spermamenge, um mindestens 500 Nachkommen zu erzeugen. Bei jeder beschriebenen Kreuzung ist es auch bevorzugt, dass Tiere (oder breit ausgedrückt Gameten), die potentiell einen Modifikator in die Kreuzung einführen, männliche Tiere (oder Gameten) sind, es sei denn, am Indexphänotyp ist ein mütterlicher Effekt beteiligt; der Grund hierfür ist, dass somit unter Verwendung von männlichen Tieren anstelle von weiblichen Tieren wesentlich mehr Gameten einem Screening unterzogen werden können. Je nach den eingesetzten Stämmen kann eine Aufzucht durch Ammentiere erforderlich sein.
Das erste verbesserte Verfahren, das kompakter und wirksamer als das herkömmliche Verfahren ist, erfordert weniger Kreuzungsstufen, beseitigt eine Haltegeneration und kann dann wertvoll sein, wenn der modifizierte Indexphänotyp den Tod beschleunigt oder die Züchtungskapazität verringert. Bei diesem verbesserten Verfahren wird ein Teil der Stärke des Screenings des dominanten Modifikators in der zweiten Generation insofern eingebüßt, als es keinen Kandidaten auf der Basis eines Clusters von Abweichlern auf der Überlebenskurve präsentiert, und insofern, als die strikte Isogenizität nach der ersten Generation verloren geht. Jedoch zielt es in wirksamer Weise auf Modifikatoren in vitalen Genen ab, deren Klonierung auf die beschriebene Weise betrieben werden kann. Bei diesem verbesserten Verfahren kann man neue Modifikatorallelen, und zwar für extreme Verstärker- und Suppressor-Abweichler in der F₁-Generation, nachweisen oder statt dessen kann man das Clusterprinzip des grundlegenden Verfahrens anwenden, um subtile F₁-Abweichler durch Screening auf Cluster von Tieren, die in der Rückkreuzungsgeneration (N2) subtiler modifiziert worden sind, zu bestätigen. Ein "extrem" abweichender Phänotyp kann fallweise definiert werden, und zwar je nach der Art des Indexphänotyps. Ein nicht-beschränkendes Beispiel ist ein Phänotyp, der in einem Maße verstärkt oder supprimiert ist, das unter dem 10. Percentil bzw. über dem 9. Percentil liegt. In einem weiteren Fall können "extreme" Niveaus am 2. und 98. Percentil festgestellt werden. Eine "subtile" Änderung ist eine Änderung, die innerhalb des statistischen Geräusches in den F₁-Tieren liegt, die aber erst in der Rückkreuzungsgeneration oder einer anschließenden Kreuzung statistisch signifikant wird.
Beim ersten verbesserten Verfahren wird ein mutagenisiertes Inzuchttier eines geeigneten Stammes direkt mit einem Tier des Indexstammes gepaart, um F₁-Nachkommen zu erzeugen, die einem Screening auf den modifizierten Indexphänotyp unterworfen werden.
Wenn ein F₁-Tier offensichtlich eine Modifikatormutation trägt, wird es mit dem Indexstamm (mit oder ohne die Indexallele) rückgekreuzt, um N2-Nachkommen zu erhalten. In dieser Generation werden mehrere Tiere einem Screening unterzogen, um Cluster von Nachkommen mit einem modifizierten Phänotyp aufzufinden. Cluster von Tieren, die den modifizierten Phänotyp aufweisen, tragen die Modifikatormutation, während Tiere, die die Modifikation nicht aufweisen, diese Mutation nicht tragen. Träger müssen heterozygot in Bezug auf Allelen, die mit dem Locus genetisch verknüpft sind, sein, während Nichtträger homozygot in Bezug auf den Indexstamm an diesen gleichen Loci sein müssen. Somit liefern diese Tiere das Material zur Kartierung der neuen Mutation unter Anwendung bekannter, PCR-gestützter Kartierungsverfahren (SSLPs und SNPs). Einzelnucleotid-Polymorphismen werden von L. Kruglyak, "The Use of a Genetic Map of Biallelic Markers in Linkage Studies", Nature Genetics, Bd. 17 (1997), S. 21, beschrieben.
Das zweite verbesserte Verfahren erleichtert die Identifizierung und Kartierung von modifizierenden Mutationen durch Verringerung des genetischen Hintergrundgeräusches. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein isogenes Modifikator-Screeningverfahren, bei dem Tiere, die die dominante Allele beitragen, und Gründerinzuchttiere, die willkürliche Punktmutationen tragen, den gleichen genetischen Inzuchthintergrund aufweisen. Abgesehen von der dominanten Indexallele stimmen die Indextiere eng mit den die Mutation tragenden Gründerinzuchttieren überein.
Zwei Ausführungsformen dieses zweiten verbesserten Verfahrens kommen in Betracht. Bei der ersten Ausführungsform können sowohl Verstärker- als auch Suppressor-Modifikatoren nachgewiesen werden, wenn der gemeinsame genetische Hintergrund der Indextiere und der Gründertiere keinen offensichtlichen Einfluss auf den Indexphänotyp ausübt. In einem Beispiel dieser Ausführungsform kann ein Indexmäusestamm eine Min-Allele an einem Apc-Locus vor einem C57BL/6J (B6)-Hintergrund enthalten, während es sich bei den mutagenisierten Gründertieren um B6-Mäuse handeln kann.
Bei der zweiten Ausführungsform dieses Verfahrens beeinflusst der genetische Hintergrund den Indexphänotyp insofern, als dann, wenn die dominante Allele, die den Indexphänotyp verleiht, vor einem bestimmten genetischen Hintergrund bereitgestellt wird, der Indexphänotyp im Tier verstärkt oder unterdrückt wird, was den selektiven Nachweis der Suppression bzw. der Verstärkung von Modifikatoren erleichtert. Beim Indexstamm kann es sich um ein kongenes Derivat eines Stammes handeln, der einen genetischen Hintergrund aufweist, der den Indexphänotyp verstärkt oder unterdrückt, wobei der kongene Stamm die dominante Allele trägt, die einen Indexphänotyp verleiht. Beispielsweise ist in einem kongenen Stamm mit einer Min-Allele an einem Apc-Locus im genetischen Hintergrund des Inzucht-BTBR-Stammes der Min-Phänotyp signifikant verstärkt.
Kongene Inzuchttiere, die die Indexallele tragen, werden mit Tieren gekreuzt, die in einer an anderer Stelle beschriebenen Art und Weise mutagenisiert worden sind, um Gen1-Tiere zu erzeugen. Die Suppression und/oder Verstärkung des Indexphänotyps kann auf die beschriebene Weise bestimmt werden. Sofern der Indexelternteil in dieser Kreuzung einen verstärkten Indexphänotyp aufweist, können mutmaßliche Unterdrückungsmodifikatoren des Indexphänotyps in einigen Gen1-Tieren als eine Verschiebung im Indexphänotyp weg vom verstärkten Niveau und in Richtung zum Wildtypniveau ersichtlich sein. Mutmaßliche Modifikatoren in Gen1-Tieren können kartiert werden, indem man die Gen1-Tiere mit einem genetisch unterscheidbaren Inzuchtstamm kreuzt.
Auf jeden Fall, werden mit dem Ziel, die Kartierung und Klonierung eines mutmaßlichen Modifikators zu erleichtern, Tiere, die einen mutmaßlichen Modifikator enthalten, mit einem genetisch unterscheidbaren Keimplasma gekreuzt, da die Kartierungsverfahren Unterschiede zwischen den Tieren, die mutmaßliche Modifikatoren enthalten, und den für die Kartierung verwendeten Stämmen erfordern. Jedoch können polymorphe Unterschiede im genetischen Hintergrund dieser Stämme die Phänotypmodifikation, die durch eine induzierte Verstärker- oder Suppressormutation ausgeübt worden ist, verschleiern. Dieses Problem kann überwunden werden, indem man einen Indexstamm erzeugt, der. sich vom Gründerstamm nur in einzelnen Nucleotidpolymorphismen (SNPs), die um das Genom verstreut sind, unterscheidet. Kurz zusammengefasst, es wird ein isogener Indexstamm durch Mutagenisieren des Indexstammes unter Verwendung eines Mutagens erzeugt, das einzelne Nucleotidänderungen induziert, z. B. ENU. Der SNP-markierte Indexstamm wird durch systematische Bruder-Schwester-Paarung erzeugt, wobei man mit einem Sohn und einer Tochter des mutagenisierten Tiers, das mit dem die Indexmutation tragenden Tier gepaart worden ist, beginnt. Das Verfahren der sequenziellen Bruder-Schwester-"sib"-Paarung beseitigt allmählich schädliche und letale Mutationen. Um zu bestätigen, dass die eingeführten SNP-Marker phänotypisch neutral sind, kann der Indexphänotyp des SNP-markierten Stammes bestimmt werden. Beispielsweise lässt sich erwarten, dass eine ENU-Mutagenese von BTBR- oder B6-Mäusestämmen derartige Markerpolymorphismen in einer Dichte im Bereich von 1 pro centiMorgan liefert. Der Weg zur Herstellung eines derartigen Indexstammes ermöglicht es, dass genetische Screeningvorgänge so nahe, wie es überhaupt vorstellbar ist, an einem isogenen Zustand liegen.
Die Verfahren zum Identifizieren von heterozygoten Trägern von Verstärkern und Suppressoren eines Indexphänotyps können in wirksamer Weise durch Anwendung einer geeigneten statistischen Analyse auf die Phänotypdaten in als Kandidaten in Frage kommenden Verwandten gesteuert werden (z.B. Tumarzählung im Fall von Min). Unter Anwendung des Algorithmus ist es möglich, die Wirksamkeit, mit der man mutmaßliche Träger und Nichtträger eines als Kandidaten in Frage kommenden heterozygoten Modifikatorgens identifiziert, zu verstärken.
Der erste Teil einer geeigneten, zweiteiligen statistischen Analyse bestätigt die Anwesenheit eines segregierenden Modifikatorgens in einer als Kandidaten in Frage kommenden Verwandtschaft: durch Anwenden eines Wahrscheinlichkeitsverhältnistests der Nullhypothese, dass kein phänotypmodifizierendes Gen segregierend ist. Der Wahrscheinlichkeitsverhältnistest berücksichtigt die alternative Hypothese, dass ein Modifikatorgen segregierend ist, und der Test wird durch Monte Carlo genau kalibriert; d. h. ein p-Wert wird erhalten, indem man wiederholt die Statistik des Wahrscheinlichkeitsverhältnisses für willkürliche Permutationen von Tieren unter verwandten Untergruppen berechnet. Für einen diskreten Phänotyp, wie eine Tumorzählung, werden der Hintergrund und die modifizierten Phänotypverteilungen modellartig in Form von negativen Binomen dargestellt. Gauss-Verteilungen können für kontinuierliche Phänotypen geeignet sein. Wenn der p-Wert > 0,05 ist, gibt es keine Anzeichen für ein Modifikatorgen. Entweder werden mehr. Daten benötigt oder es sollten verschiedene Verwandte für die weitere Analyse in Betracht gezogen werden.
Bei einem p-Wert von <0,05 wird im zweiten Teil der Analyse eine LOD-Bewertung für die Anwesenheit des Modifikatorgens für jeden potentieller, Träger, der Nachkommen mit Phänotypinformationen aufweist, berechnet. Bei der LOD-Bewertung handelt es sich um den Logarithmus auf der Basis 10 des Verhältnisses der Wahrscheinlichkeit von Nachkommen-Phänotypdaten, wenn das Tier das Modifikatorgen trägt, verglichen mit der Wahrscheinlichkeit der Phänotypdaten, wenn das Tier. nicht das Modifikatorgen trägt. Die Wahrscheinlichkeiten werden aus einer ermittelten Hintergrundverteilung für den Nenner und aus einem Gemisch des ermittelten Hintergrunds und der ermittelten modifizierten Verteilung für den Zähler berechnet. Die ermittelten Verteilungen werden durch das Verfahren der maximalen Wahrscheinlichkeit erhalten. Negative binomiale Verteilungen können für den Tumorzähl-Phänotyp und Gauss-Verteilungen für kontinuierliche Phänotypen verwendet werden. Potentielle Träger werden sodann gemäß ihren LOD-Bewertungen eingestuft. Die Kartierung läuft ab, indem man zunächst Tiere mit den höchsten positiven LOD-Bewertungen (vermutliche Träger) und den höchsten negativen LOD-Bewertungen (vermutliche Nichtträger) analysiert.
Eine ENU-induzierte Modifikatormutation kann in geringer Auflösung auf der Grundlage ihres heterozygoten Phänotyps kartiert werden, wie vorstehend ausgeführt. Wie ausführlich am Ende des nachstehenden Beispiels dargelegt wird, ist eine höher auflösende Kartierung erzielbar, wenn Homozygoten für die ENU-induzierte Modifikatormutation einen qualitativ unterschiedlichen Phänotyp, wie Letalität, aufweisen.
Ein besseres Verständnis der Erfindung ergibt sich aus dem folgenden, nicht-beschränkenden Beispiel.
Beispiel
Bei der Min-Mutation, beschrieben von Moser et. al., "A Dominant Mutation that Predisposes to Multiple Intestinal Neoplasia in the Mäuse", Science, Bd. 247 (1990), S. 322-324, handelt es sich um eine dominant übertragene, vollständig penetrante Mäusemutation, die in Heterozygoten einen Phänotyp verursacht, der eine weitgehende Ähnlichkeit mit humanen, vererbten Kolon-Polyposesyndromen aufweist. In diesem Beispiel wurden C57BL/6-Mäuse, die die Min-Allele tragen, mit genetisch unterscheidbaren BTBR-Mäusen gezüchtet, die willkürliche, von mutagenisierten Vätern ererbte Punktmutationen trugen.
In Abständen von etwa 1 Monat wurden 6 bis 12 männliche BTBR-Mäuse mit ENU gemäß dem Verfahren von Shedlovsky (a.a.O.) behandelt und sodann mit weiblichen, nicht-mutagenisierten BTBR-Mäusen gekreuzt. Die Gen1-Nachkommen dieser Kreuzung waren isogene BTBR-Tiere, die in Bezug auf mögliche Mutationen, die die Tumorbelastung in Mäusen, die die Min-Mutation enthalten, beeinflussen könnten, heterozygot waren. Etwa 900 weibliche Gen1-Nachkommen wurden im Laufe der Zeit erhalten.
295 weibliche Gen1-Mäuse wurden mit männlichen B6-Min-Mäusen gekreuzt. Als Nebenbemerkung ist festzustellen, dass man mehrere männliche Gen1-Tiere mit weiblichen B6-Min-Mäusen hätte kreuzen können, wenn die Würfe durch Ammenmütter (wie ICR-Mäuse, die im Handel erhältlich sind) innerhalb einiger Tage nach der Geburt versorgt worden wären. Über 90% derartiger Jungtiere überleben. Diese Strategie wäre insofern von Vorteil, als durch Bereitstellung von mehrfachen weiblichen B6-Min-Tieren die Erzeugung einer ausreichenden Anzahl an Gen1F₁-Tieren beschleunigt werden könnte.
Um die Kreuzung durchzuführen, wurden zwei weibliche und ein männliches Tier in einen Käfig gebracht. Nach 2 Wochen wurden die Weibchen entnommen und durch zwei neue Weibchen ersetzt. Trächtigkeit wurde durch wöchentliche Palpation der abgetrennten Weibchen nachgewiesen. Wenn nach 2-wöchiger Trennung keine Trächtigkeit festgestellt wurde, wurde das Weibchen wieder dem Paarungsvorgang zugeführt. Die Gen1F₁-Nachkommen eines jeden Weibchens wurden in Bezug auf Min genotypisiert und 2-mal wöchentlich, beginnend im Alter von 100 Tagen, auf Krankheitsanzeichen abgesucht. Wenn die Tiere allmählich ein blasses Aussehen zeigten, wurden sie 2-mal täglich einem Screening unterzogen, bis sie offensichtlich dem Tod nahe waren. Die genotypische Analyse bediente sich einer allelen spezifischen PCR oder einer allelen spezifischen Hybridisierung, wie sie von Dietrich et al., a.a.O., S. 637, und in den dort zitierten Literaturstellen beschrieben wurde, wobei man die gleichen PCR-Primer und Bedingungen wie Dietrich et al. heranzog.
Unter den Nachkommen befanden sich 92 Verwandte mit 6 oder mehr Mitgliedern. Von diesen 92 Verwandten zeigten 5 Verwandte mindestens 2 Min/+-Mitglieder. mit einer möglichen Verstärkung des Min-Phänotyps (d. h. mit einer Überlebenszeit, die kürzer als die 90. Percentil-Überlebenszeit der gesamten Population der Gen1F₁-Mäuse ist). 7 Verwandte zeigten mindestens 2 Min/+-Mitglieder mit einer Suppression des Min-Phänotyps (d. h. einer längeren Überlebenszeit als 10. Percentil). Erwartungsgemäß führte die Verstärkung oder Suppression des Phänotyps zu einer Segregation innerhalb einer Verwandtschaft, da die Min-Mäuse in der Gen1F₁-Generation einer Verwandtschaft in Bezug auf etwaige neu induzierte Mutationen heterozygot. sind.
Die folgende Tabelle zeigt die Überlebenszeit von 4 Verwandtschaften, die als Kandidaten in Frage kommende, segregierende Verstärker- oder Suppressor-Loci umfassen:
Wenn die Wahrscheinlichkeit, dass eine Maus von normalem Genotyp ein bestimmtes Alter überlebt, 10% ist, so beträgt die statistische Wahrscheinlichkeit, dass 2 Mäuse in der gleichen Verwandtschaft dieses Alter überleben, nur 1%. Die statistische Wahrscheinlichkeit, dass 3 Mäuse in einer Verwandtschaft länger leben, beträgt wiederum nur 0,1%. Somit steigt mit einer zunehmenden Anzahl an Mitgliedern einer Verwandtschaft mit einer abweichenden kurzen oder langen Überlebenszeit auch die Wahrscheinlichkeit, dass die Abweichung das Ergebnis einer bona fide-Mutation ist, die vom mutagenisierten BTBR-Gründertier geerbt worden ist. Dies stellt das Clusterprinzip des Verfahrens dar. Durch vorheriges Bestimmen eines angestrebten Grads der Clusterbildung kann man Grenzen bezüglich der Fähigkeit zum Nachweis von Mutanten festlegen und den Reinigungsgrad der erhaltenen Mutanten erhöhen, wodurch der "Screen" für Mutanten angereichert wird.
1 stellt die Überlebenswahrscheinlichkeit gegen das Alter der Gen1F₁-Generation der Kreuzung zwischen Gen1-BTBR-Weibchen und B6-Min-Männchen dar. Die Symbole unterhalb und auf der linken Seite der Kurve geben Individuen in zwei Verwandtschaften an, von denen angenommen wird, dass sie Mutationen enthalten, die den Min-Phänotyp verstärken (En333 und En425). Die Symbole oberhalb und auf der rechten Seite der Kurve geben die Mitglieder von zwei Verwandtschaften an, bei denen der Min-Phänotyp offensichtlich unterdrückt ist (Su248 und Su258). Eine Anzahl der Mäuse in der letztgenannten Kategorie überlebte mehr als 365 Tage. Mäuse, die statistisch eine geringere oder größere Überlebensdauer aufwiesen, wurden unter üblichen Verfahren gezüchtet, um die Mutation aufrechtzuerhalten. In einigen Fällen gelang es nicht, das Gen1-Tier zu züchten; statt dessen wurden die Gen1F₁-Mäuse mit langer Überlebenszeit mit dem Wildtyp-Gründerstamm gekreuzt, und zwar als Rückzugsverfahren zur Sieherstellung von Mutationen von Interesse. Beispielsweise war das Gründerelternteil der nachstehend beschriebenen Verwandtschaft Su258 nicht zur Züchtung geeignet, nachdem eine Kandidatenmutation in seiner Nachkommenschaft identifiziert worden war. Die langlebigen Nachkommen Nr. 2 und 4 wurden daher mit BTBR-Mäusen gekreuzt.
Um sicherzustellen, dass diese abweichenden Mitglieder einer Verwandtschaft tatsächlich eine Verstärkungs- oder Suppressionsmutation enthalten, wurde eine Verwandtschaft der zweiten Generation untersucht. Dies eignet sich sowohl zur Gewinnung von Trägern einer starken Verstärkermutation als auch zum Nachweis von subtileren, dominanten Einflüssen entweder der Suppressor- oder der Verstärkerklasse. Üblicherweise zeigen Heterozygoten in Bezug auf einen Verlust einer Genfunktion nur eine subtile heterozygote Wirkung.
Um die Verwandtschaft der zweiten Generation zu erzeugen, wurde das Gründertier, das eine Verwandtschaft hervorbrachte, die entweder eine Verstärker- oder eine Suppressorfunktion zeigte, mit normalen BTBR-Tieren gekreuzt. Von durchschnittlich 50% der Nachkommen dieser Kreuzung ist zu erwarten, dass sie die Suppressor- oder Verstärkermutation enthalten. Die Nachkommen dieser Kreuzung, als Gen2 bezeichnet, wurden mit B6-Min-Mäusen gekreuzt.
Nach 90 Tagen wurden die Nachkummen, die aufgrund der genotypischen Analyse die Min-Mutation trugen, getötet und ihre Tumorbelastung wurde. unter Anwendung üblicher Verfahren zur Bestimmung der Durchschnittswerte des Tumorvolumens und der Tumorzahl ermittelt. Die Tumorbelastung ist als das Produkt aus dem durchschnittlichen Tumorvolumen und der Anzahl der Tumoren pro Maus definiert.
Als weiterer Beweis, dass eine Suppressormutation in der Verwandtschaft. 258 erhalten wurde, wurden zwei lange Zeit überlebende Tiere in der Gen1F₁-Generation gezüchtet. Dabei wurde festgestellt, dass ihre Abkömmlinge sehr geringe Tumorzahlen (etwa 10 oder weniger Tumoren) aufwiesen. Dies lieferte einen starken Hinweis darauf, dass eine bona fide-Mutation mit der Wirkung der Unterdrückung des Min-Phänotyps bei Passage auf die Nachkommen segregierend war. Auf der Basis von 699 Tieren in der Suppressorverwandtschaft 258 beträgt die statistisch ermittelte Tumormultiplizität von +/+-Tieren durchschnittlich 1.8,8, während der Wert von Su/+-Tieren zu 5,9 ermittelt wurde. Für die Verstärker-Verwandtschaft 333 beträgt die ermittelte Tumormultiplizität der +/+-Tiere 20,5, während die En/+-Mitglieder der Verwandtschaft eine ermittelte Tumormultiplizität von 36 aufweisen.
Aufgrund der bekannten SSLP-Polymorphismen zwischen B6- und BTBR-DNA ist es möglich, den Teil des Nachkommengenoms zu isolieren, der BTBR-DNA enthält, und anschließend die Punktmutation zu isolieren, die für die Modifikation des Phänotyps verantwortlich ist, wobei man sich üblicher Techniken bedient, die nunmehr dem Molekulargenetiker zur Verfügung stehen. Die Tatsache, dass ENU-induzierte Mutationen nur Einzelbasenpaar-Substitutionen sind, macht diesen Schritt besonders schlagkräftig. Dies ist die Grundlage für die "Modifying Molecule"-Bezeichnung des ICMM-Verfahrens. Der Teil des Genoms; der die Punktmutation enthält, kann mit bekannten ESTs verglichen werden oder er kann neuerdings sequenziert werden, um die genetische Sequenz zu bestimmen, die für die Kodierung des Moleküls, das den Phänotyp modifiziert, verantwortlich ist. Unter Anwendung üblicher Verfahren kann die genetische Sequenz in ein geeignetes genetisches Konstrukt eingeführt werden, das einen transkriptionalen Promotor enthält, um eine Erzeugung in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle zu erreichen. Man kann das klonierte Gen dazu verwenden, weitere Mutationen in diesem Gen in Begleitmäusestämmen zu erzeugen.
Die genetische Sequenz lässt sich leicht mit bekannten Sequenzen von Menschen vergleichen, um die Identität des entsprechenden humanen Gens zu bestimmen. Das humane Gen kann durch übliche Hybridisierungs-, PCR- oder Expressionsklonierungsverfahren isoliert werden. Das humane Protein kann gleichermaßen unter Anwendung üblicher Techniken erhalten werden, entweder durch Isolation aus humanem Gewebe oder durch Erzeugung in einem nicht-nativen Wirt unter Anwendung rekombinanter DNA-Verfahren.
Es kann möglich sein, Mutationen zu isolieren, die den Index-Min-Phänotyp in einem kompakteren, jedoch weniger empfindlichen Verfahren unterdrücken. Bei diesem Verfahren werden weibliche (heterozygote) B6-Min-Mäuse direkt mit männlichen, ENU-mutagenisierten BTBR-Mäusen gekreuzt. Als Kontrolle werden auch männliche, nicht-mutagenisierte BTBR-Mäuse auf die gleiche Weise behandelt. Die F₁-Nachkommen werden von ICR-Mäusen aufgezogen. Männliche F₁-Mäuse, die den Min-Phänotyp aufweisen, werden weiterhin gehalten.
Nach 170 Tagen werden sämtliche ApcMin/+-F₁-Männchen, deren Körpergewicht mehr als 95% des Kontrollkörpergewichts beträgt, als in Frage kommendem Träger eines dominanten Suppressors des Min-Phänotyps, Su/+, angesehen.
Derartige, als Kandidaten in Frage kommende Träger werden im Alter von 170 Tagen mit weiblichen Wildtyp-B6-Mäusen gekreuzt. Die weiblichen Nachkommen dieser Kreuzung (Apc^Min/+ und Apc^+/+) werden mit dem als Kandidaten in Frage kommenden Männchen, das nunmehr ein Alter von etwa 230 Tagen aufweist, rückgekreuzt.
Die Nachkommen der letztgenannten Kreuzung werden sodann im Alter von 90 Tagen phänotypisiert. Zu diesem Zeitpunkt weist das in Frage kommende Männchen ein Alter von 340 Tagen auf. Unter den Nachkommen liefern etwaige nachteilige oder letale Phänotypen Informationen über die Kartierungsposition des Suppressors und geben einen Hinweis darauf, ob das als Kandidat in Frage kommende Männchen eine Suppressormutation trägt.
Apc^Min/+-Nachkommen:
+/+ normaler Min-Phänotyp
Su/+ geringe Tumorbelastung nach 90 Tagen?
Su/Su sehr geringe Tumorbelastung nach 90 Tagen?
oder nachteilig oder letal?
Apc^+/+-Nachkommen:
+/+ normal
Su/+ normal?
Su/Su nachteilig oder letal?
Nachteilig beeinflusste Tiere sind in Bezug auf BTBR-Marker, die mit dem Suppressorlocus verknüpft sind, homozygot. Wenn im Gegensatz dazu Su/Su eine embryonale letale Mutation darstellt, fehlen beim Satz von lebend geborenen Nachkommen Tiere, die in Bezug auf BTBR-Marker, die mit dem Suppressorlocus verknüpft sind, homozygot sind.
Es kann auch von Bedeutung sein, ein Keimplasma sicherzustellen, das eine Modifikatormutation trägt, die bei Anwendung einer in vitro-Fertilisation den Min-Phänotyp verstärkt oder unterdrückt, jedoch insbesondere verstärkt. Beispielsweise kann ein als Kandidat in Frage kommender männlicher Träger, der für die Züchtung zu krank ist, getötet werden. Sperma, das dem getöteten Männchen entnommen worden ist, kann zur Befruchtung von Eiern aus einem geeigneten Weibchen (z. B. BTBR oder eine Maus, die die Mutation von Interesse trägt) verwendet werden. Die hierzu anwendbaren Techniken werden von B. Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Auflg., (1994), beschrieben.
Die vorstehenden Beispiele sind nicht als Beschränkung der Erfindung anzusehen. Vielmehr umfasst die Erfindung sämtliche Modifikationen und Variationen, die unter den Schutzumfang der folgenden Ansprüche fallen.

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Einzelpunktmutation in nicht-humanen Tieren, wobei die Einzelpunktmutation an einem Mudifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: Fremdeinkreuzung (Outcrossing) eines ersten männlichen Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das männliche Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, mit einem zweiten weiblichen Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, wobei das weibliche Tier ein dominantes Allel am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp zeigt und genetisch vom Gründerinzuchtstamm unterscheidbar ist, um eine F₁-Nachkommenschaft zu erzeugen, von der ein Teil sowohl das dominante Allel am Indexlocus als auch mindestens eine willkürliche Punktmutation trägt; Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den das weibliche Tier des Indexinzuchtstammes zeigt, aufweist, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist; Rückkreuzen eines männlichen F₁-Individuums, das den abweichenden Phänotyp zeigt, mit einem weiblichen Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne dem dominanten Allel am Indexlocus zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die das dominante Allel trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist; und Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende, Indexphänotyp-modifizierende Einzelpunktmutation hervorgerufen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei beliebige der Kreuzungen sich konservierter Gameten bedienen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die F₁-Nachkommenschaft und einige Mitglieder der N2-Nachkommenschaft einen extrem abweichenden Phänotyp aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei. der segregierenden Mutation um einen heterozygoten Modifikator des Indexphänotyps handelt, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus einem verstärkenden Modifikator und einem unterdrückenden Modifikator besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem dominanten Allel um ein Min-Allel handelt, wobei es sich beim Indexlocus um den Apc-Locus in einer Maus handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Indexinzuchtstamm und der Gründerinzuchtstamm einen gemeinsamen isogenen genetischen Hintergrund aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 6, ferner umfassend die Stufe des Kartierens der segregierenden Mutation unter Verwendung eines Kartierungspartnerstammes, wobei der Kartierungspartnerstamm durch folgende Stufen erzeugt wird: Behandeln eines Tiers des Indexstammes mit einem mutagenen Mittel zur Induktion von Punktmutationen im behandelten Tier; Kreuzen des behandelten Tiers mit einem Tier des Indexstammes zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft; und sib-Paarung der F₁-Nachkummen und der Nachkommen der folgenden Generation, bis schädliche und letale Mutationen beseitigt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei. den nichthumanen Tieren um Mäuse handelt und der Gründerinzuchtmäusestamm durch ein Verfahren erzeugt wird, das die Stufe der Behandlung einer Wildtyp-Inzuchtmaus mit einem mutagenen Mittel zur Induktion von Punktmutationen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem mutagenen Mittel um Ethylnitrosoharnstoff handelt.
Verfahren zum Identifizieren einer humanen genetischen Sequenz, die einer segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Mutation in nicht-humanen Tieren entspricht, wobei die segregierende Mutation an einem Modifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: Fremdeinkreuzung eines ersten Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das erste Tier willkürliche Punktmutationen relativ zum Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes zeigt, mit einem zweiten Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, wobei das zweite Tier ein dominantes Allel am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp aufweist und genetisch vom ersten Tier des Gründerinzuchtstammes unterscheidbar ist, zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, von der ein Teil. sowohl das dominante Allel am Indexlocus als auch mindestens eine willkürliche Mutation trägt; Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den das zweite Tier des Indexinzuchstammes zeigt, aufweist, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist; Rückkreuzen eines F₁-Individuums, das den abweichenden Phänotyp zeigt, mit einem Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne dem dominanten Indexallel zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens. ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die das dominante Allel trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist; Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende Mutation hervorgerufen wird; Identifizieren von genetischen Markern, die mit der segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Mutation verknüpft sind; Identifizieren eines Gens an einem Contig, das für die segregierende, Indexphänotyp-modifizierende Mutation kodiert; und Gewinnen von humanen genetischen Sequenzen, die dem für die Mutation kodierenden Gen entsprechen.
Verfahren zum Identifizieren einer segregierenden, Indexphänotyp-modifizierenden Mutation in nicht-humanen Tieren, wobei die Mutation an einem Modifikatorlocus auftritt und der Indexphänotyp durch einen Indexlocus verliehen wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: Kreuzen eines ersten Tiers eines nicht-humanen Gründerinzuchtstammes, wobei das erste Tier willkürliche Punktmutationen relativ zu einem Wildtyptier des Gründerinzuchtstammes trägt, mit einem zweiten Tier eines nicht-humanen Indexinzuchtstammes, der einen gemeinsamen isogenen genetischen Hintergrund mit dem Gründerinzuchtstamm aufweist, wobei das zweite Tier ein kongenes dominantes Allel am Indexlocus trägt, zur Erzeugung einer F₁-Nachkommenschaft, von der ein Teil das dominante Allel trägt und einen abweichenden Phänotyp aufweist; und Verifizieren, dass die F₁-Nachkommenschaft, die das dominante Allel trägt und einen modifizierten Indexphänotyp aufweist, eine segregierende Mutation trägt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der genetische Hintergrund keinen modifizierenden Einfluss auf den Indexphänotyp aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der genetische Hintergrund einen modifizierenden Einfluss auf den Indexphänotyp aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der genetische Hintergrund einen verstärkenden Einfluss auf den Indexphänotyp aufweist und wobei die F₁-Tiere einen unterdrückten Phänotyp relativ zum Indexinzuchtstamm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 11, ferner umfassend die folgenden Stufen: Kartieren der segregierenden Mutation durch Kreuzen von F₁-Tieren, die das dominante Allel und einen modifizierten Indexphänotyp aufweisen, mit einem genetisch unterscheidbaren Inzuchtstamm; und Bewerten der Nachkommenschaft der Kartierungskreuzung.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der genetisch unterscheidbare Inzuchtstamm einen gemeinsamen isogenen genetischen Hintergrund mit den Gründer- und Indexstämmen aufweist und ferner Einzelnucleotidpolymorphismen relativ zum Gründerinzuchtstamm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren eine segregierende Mutation an einem genetischen Locus identifiziert, der die Tumormultiplizität in einer C57BL/6-Maus, die für das Min-Allel am Apc-Locus kongen ist, modifiziert, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: Fremdkreuzung mindestens einer männlichen C57BL/6-Maus, die willkürliche Punktmutationen trägt, mit einer C57BL/6-Maus, die für das Min-Allel am Apc-Locus kongen ist, zur Erzielung einer F₁-Nachkommenschaft; Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Tumormultiplizitätsphänotyp relativ zum Tumormultiplizitätsphänotyp in einer C57BL/6-Maus, die für das Min-Allel am Apc-Locus kongen ist, aufweist, wodurch gezeigt wird, dass mindestens ein F₁-Individuum eine segregierende Mutation aufweist, die die Tumormultiplizität modifiziert; und Rückkreuzen von Gameten aus der männlichen F₁-Nachkommenschaft mit mindestens einer weiblichen C57BL/6-Maus, die für das Min-Allel am Apc-Locus kongen ist, zur Erzielung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft das Min-Allel trägt und eine Tumormultiplizität aufweist, die relativ zur Tumormultiplizität in einer C57BL/6-Maus, die für das Min-Allel am Apc-Locus kongen ist, modifiziert worden ist, wobei die modifizierte Tumormultiplizität für die dadurch identifizierte segregierende Mutation charakteristisch ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die modifizierte Tumormultiplizität nach einem Verfahren bewertet wird, das die folgenden Stufen umfasst: auf willkürliche Permutationen von Mäusen unter N2-Rückkreuzungsunterfamilien ("backcross subkindreds") wird ein Wahrscheinlichkeitsverhältnistest der Nullhypothese, dass kein Multiplizitätsmodifikator segregierend ist, wiederholt angewandt, um einen p-Wert zu erhalten, wobei ein p-Wert von weniger als 0,05 einen Hinweis auf einen potentiellen Träger der segregierenden Mutation darstellt; wobei dann, wenn der p-Wert weniger als 0,05 ist, für jeden potentiellen Träger, der Nachkommen mit Informationen über die Tumormultiplizität aufweist, eine LOD-Bewertung für die Anwesenheit. der segregierenden Mutation berechnet wird, wobei es sich bei der LOD-Bewertung um den log₁₀ eines Verhältnisses einer ersten Wahrscheinlichkeit von Nachkommen-Phänotypdaten, wenn die potentielle Trägermaus einen Multiplizitätsmodifikator trägt, zu einer zweiten Wahrscheinlichkeit von Nachkommen-Phänotypdaten, wenn die potentielle Trägermaus keinen Multiplizitätsmodifikator trägt, handelt, wobei die zweiten Wahrscheinlichkeiten aus einer geschätzten Hintergrundverteilung berechnet werden und die ersten Wahrscheinlichkeiten aus einer Mischung der geschätzten Hintergrundverteilung und einer geschätzten modifizierten Verteilung berechnet werden, wobei die geschätzten Verteilungen durch ein Verfahren der maximalen Wahrscheinlichkeit erhalten werden; und die LOD-Bewertungen von potentiellen Trägern der Reihe nach geordnet werden, wobei Tiere mit den höchsten LOD-Bewertungen vermutlich Träger der segregierenden Mutation sind.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, ferner umfassend die Stufe der Kartierung der segregierenden Mutation in der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft unter Verwendung eines Kartierungspartnerstammes mit einem genetischen C57BL/6-Hintergrund.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Kartierungspartner durch folgende Stufen erzeugt wird: Behandeln einer C57BL/6-Maus mit einem Mutagen zur Einführung von willkürlichen Punktmutationen; Kreuzen der behandelten Maus mit einer C57BL/6-Maus unter Erzeugung einer F₁-Nachkommehschaft; und sib-Paarung der F₁-Nachkommen und der Nachkommen der anschließenden Generation bis schädliche und letale Mutationen beseitigt sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei den nicht-humanen Tieren um Mäuse handelt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: Fremdeinkreuzung einer ersten männlichen Maus eines Gründerinzuchtstammes, wobei die männliche Maus willkürliche Punktmutationen relativ zu einer Wildtypmaus des Gründerinzuchtstammes trägt, mit einer zweiten weiblichen Maus eines Indexinzuchtstammes, wobei die weibliche Maus ein dominantes Allel am Indexlocus trägt, den Indexphänotyp zeigt und genetisch vom Gründerinzuchtstamm unterscheidbar ist, um eine F₁-Nachkommenschaft zu erzeugen, von der ein Teil sowohl das dominante Allel am Indexlocus als auch mindestens eine willkürliche Punktmutation trägt; Identifizieren von einem oder mehreren F₁-Individuen, die einen abweichenden Phänotyp relativ zum Indexphänotyp, den die weibliche Maus des Indexinzuchtstammes zeigt, aufweist, was zeigt, dass mindestens ein F₁-Individuum eine Indexphänotyp-modifizierende Mutation aufweist; Rückkreuzen eines männlichen F₁-Individuums, das den abweichenden Phänotyp zeigt, mit einem weiblichen Tier des Indexinzuchtstammes mit oder ohne dem dominanten Allel am Indexlocus zur Erzeugung einer N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, wobei mindestens ein Mitglied der N2-Rückkreuzungsnachkommenschaft, die das dominante Allel trägt, auch den abweichenden Phänotyp aufweist; und Verifizieren, dass der abweichende Phänotyp durch eine segregierende, Indexphänotyp-modifizierende Einzelpunktmutation hervorgerufen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich beim abweichenden Phänotyp um den Indexphänotyp handelt, der auf ein Niveau unter dem zehnten Percentil oder über dem neunzigsten Percentil verstärkt oder gedrückt ist.