DE19748211A1 - Optisches Array-System und Reader für Mikrotiterplatten - Google Patents
Optisches Array-System und Reader für MikrotiterplattenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein optisches System zur Erfassung eines
Gegenstandsarrays, besonders in der Ausführung als "Reader" für
Mikrotiterplatten.
In der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung wie in der
molekularmedizinischen Diagnose werden Fluoreszenz-,
Lumineszenz- und Absorptions-Untersuchungen von riesigen Zahlen
kleinster Probenmengen benötigt. Hierbei ist ein hoher
Probendurchsatz bei der Messung von größter Bedeutung.
Besonders anspruchsvoll sind Kinetikmessungen, deren
Zeitkonstanten einem hohen Durchsatz im Wege stehen.
Zur Bereitstellung der Proben stehen Mikrotiterplatten mit
gerastert angeordneten Kleinst-Probenbehältern in Standard-
Ausführungen mit z. B. 96 oder einem Vielfachen davon, z. B. 384
oder 1536, Probenbehältern (Multi-Well-Microplatten) zur
Verfügung. Alternativ sind auch sogenannte Substanz-Chips als
Probenträger in Gebrauch.
Ein derartiger Reader wird beispielsweise von der Firma
Molecular Devices Corp. USA unter der Bezeichnung SPECTRAmax(R)
PLUS angeboten. Eine Lichtquelle und ein Monochromator sind
über 8 Lichtleitfasern mit 8 Spiegeloptiken zur
Durchlichtbeleuchtung jeweils eines Probenbehälters und mit 8
messenden Photodetektoren verbunden. Es ist also eine achtfache
Parallelmessung möglich.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine optische Anordnung
anzugeben, die es ermöglicht, einen derartigen Reader mit
massiv paralleler Messung auszustatten und so den
Probendurchsatz auch bei Kinematikmessungen massiv zu steigern.
Dabei soll ein hoher Wirkungsgrad der Lichtwege und ein
kompakter, möglichst einfacher Aufbau erreicht werden.
Selbstverständlich ist eine hohe Meßempfindlichkeit zu
gewährleisten.
Ein optisches System nach Anspruch 1 löst diese Aufgabe.
Es wird zur Detektion ein Detektorarray vorgesehen, das z. B.
als CCD-Array zur Verfügung steht. Klassische Optik mit
klassischen Linsen über den ganzen Querschnitt wird mit Linsen-
Arrays kombiniert. Damit wird sowohl eine maßstabgerechte
Abbildung des gesamten erfaßten Gegenstandsbereichs
(Mikrotiterplatte) auf das CCD-Array erreicht als auch eine
geeignete Abbildung von Bereichen der einzelnen Wells der
Mikrotiterplatte auf das CCD-Array (zwei verschiedene
Maßstäbe), bei strikter Kanaltrennung zwischen den
verschiedenen Wells.
Vorteilhaft werden dabei die in den Unteransprüchen angegebenen
Merkmale ergänzt. Dazu gehören ein Teleskop - einlinsig über
den Querschnitt -, ein Mikrolinsenarray vor dem Detektorarray
und die Integration einer Auflichtbeleuchtung. Letztere ergibt
mit geringstem Aufwand durch doppelte Nutzung der optischen
Elemente einen besonders guten Wirkungsgrad und besondere
Rauschunterdrückung dadurch, daß genau das Probenvolumen
ausgeleuchtet wird, das auch vom Nachweisstrahlengang erfaßt
wird.
Mit einem Lochblendenarray kann eine weitere Störunterdrückung
erreicht werden.
Näher erläutert wird die Erfindung anhand der Zeichnung.
Fig. 1 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße optische
Anordnung in einer ersten Ausführung;
Fig. 2 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Reader.
Die Darstellung der Fig. 1 zeigt von allen Array-Elementen
jeweils nur drei Exemplare, um übersichtlich das Prinzip
darstellen zu können. Eine praktische Ausführung sieht in
Anpassung an gebräuchliche Mikrotiterplatten Arrays von
8 × 12 = 96 Elementen (Pixeln) vor.
Ein Gegenstandsarray 11, 12, 13 wird von der Mikrotiterplatte 1
mit Vertiefungen (Wells) und darin eingelagerten Substanzproben
110, 120, 130 gebildet. Das gleiche Rastermaß weist das Mini-
Linsenarray 21, 22, 23 auf, das aus konventionellen kleinen
Linsen zusammengebaut ist und mit einer Brennweite von f = 7,5
und einer numerischen Apertur von ca. 0,6 das Licht von einem
zentralen Bereich 11, 12, 13 der Proben 110, 120, 130 effektiv
einsammelt. In der Zwischenbildebene im Abstand von 380 mm ist
eine Lochblende 3 angeordnet, welche ein Übersprechen zwischen
den einzelnen Array-Elementen unterbindet.
Das folgende Teleskop aus den Linsen 41 und 42 verkleinert den
Bündeldurchmesser von 130 mm auf 15 mm in Anpassung an die
Abmessungen des CCD-Arrays. Die dazwischen angeordnete
Feldlinse 5 sorgt für die Abbildung des Zwischenbilds und damit
des Gegenstandsarrays 11, 12, 13 auf die Elemente des CCD-
Arrays 6.
Die gesamte "Kollektiv"-Optik 41, 5, 42 ist in ihrem
Durchmesser nur durch die Größe der Mikrotiterplatte 1 bzw. des
Gegenstandsarrays 11, 12, 13 bestimmt. Dagegen müßte eine
normale CCD-Kamera mit der gleichen numerischen Apertur von 0,6
weitaus größere Linsen haben. Dies wird dadurch ermöglicht, daß
die numerische Apertur des erfindungsgemäßen optischen Systems
durch die Elemente 21, 22, 23 des Mini-Linsenrasters bestimmt
wird.
Das wichtigste an der Anordnung ist, daß frei von Übersprechen
jeder Probe 110, 120, 130 genau eine Bildzone auf dem CCD-Array
entspricht.
Für Fluoreszenz- oder Absorptions-Messungen wäre eine
Beleuchtungseinrichtung zu ergänzen, z. B. in der Art, wie sie
mit Fig. 2 näher erläutert wird.
Für Lumineszenzmessungen ist die Anordnung der Fig. 1 bereits
unmittelbar geeignet, allerdings wird dafür eine etwa Zehnfache
Brennweite des Linsenarrays 21, 22, 23 bevorzugt, womit das
erfaßte Probenvolumen anwächst.
Die Anordnung der Fig. 2 ist als Fluoreszenz-Reader ausgelegt.
Zunächst hat sie die gleichen Elemente wie die Fig. 1, nämlich
Mikrotiterplatte 1 mit Wells 11i, Mini-Linsenarray 2i mit 96
Linsen, große (41) und kleine (42) Teleskoplinse, dazwischen
die Feldlinse 5 und das CCD-Array 6. Abweichend kollimiert
jedoch das Mini-Linsenarray 2i, es gibt keine Lochrasterplatte,
jedoch ein Mikro-Linsenarray 7 unmittelbar vor dem CCD-Array 6
mit 96 Mikrolinsen, welche kollektiv in Mikrostrukturtechnik
hergestellt sind und die Abbildung in die Detektorzellen des
CCD-Arrays 6 bewirken.
Es wird dabei ein Rastermaß auf dem CCD-Array von etwa vierzig
Detektorzellen im Durchmesser erreicht, in dem etwa ein Spot
vom zwanzig Detektorzellen im Durchmesser von jedem
Probenelement ausgeleuchtet wird.
Zwischen der Teleskoplinse 42 und dem Mikro-Linsenarray 7 ist
ein Einkoppelspiegel 8 (dichroitischer Spiegel) angeordnet.
Eine Beleuchtungseinrichtung 9 gibt über Lichtleitfasern 91 und
Kondensor 92 Beleuchtungslicht auf den Spiegel 8, das über das
schon beschriebene optische System genau an die Stellen auf der
Mikrotiterplatte 1 geleitet wird, die auf den CCD-Detektor 6
abgebildet werden. Das Licht der Beleuchtungseinrichtung 9 wird
daher optimal für die Messung ausgenutzt. Störungen durch
Beleuchtung der Struktur der Mikrotiterplatte 1 und dergleichen
entfallen.
Die Beleuchtungseinrichtung kann aus einer Weißlichtquelle,
z. B. einer Xenon-Gasentladungslampe, bestehen, auch kombiniert
mit einem Monochromator zur Ausbildung eines
Spektrophotometers.
Auch eine Linienquelle, z. B. ein Laser, kommt in Frage.
Mit einer diskreten Scan-Einrichtung für die Relativbewegung
von Mikrotiterplatte 1 und Mini-Linsenarray 2i einschließlich
der gesamten optischen Anordnung kann z. B. eine 384-Well-
Mikrotiterplatte mit vier Stellungen nacheinander komplett
ausgelesen werden.
Übliche Filter in Beleuchtungs- und Nachweisstrahlengang zur
Trennung von Beleuchtungs- und Fluoreszenzlicht können zur
Anpassung an verschiedene Wellenlängen zusammen mit dem
dichroitischen Spiegel in einem auswechselbaren Modul
angeordnet sein und so einen schnellen Wechsel des
Fluoreszenzsystems ermöglichen.
Aus dem gleichen Grund wird vorzugsweise zumindest das
gegenstandsseitige Linsenarray 2i achromatisiert, indem jede
einzelne Linse durch eine Linsengruppe mit achromatischer
Korrektur ersetzt wird. Als Spektralbereich wird dann
typischerweise etwa 350 bis 800 nm vorgesehen.
Wird der Strahlteiler 8 nicht dichroitisch ausgebildet und wird
über der Mikrotiterplatte 1 ein Spiegel angeordnet, so kann
einfach eine Anordnung zur Absorptionsmessung analog dem
beschriebenen Gerät der Firma Molecular Dynamics abgeleitet
werden. Natürlich kann auch eine Auflichtbeleuchtung vorgesehen
werden.
Die Anordnung ist konfokal in dem Sinne, daß ein in der Probe
räumlich begrenzter Beleuchtungsfleck mit einem räumlich
begrenzten Detektionsbereich überlagert wird. Die Blende im
Beleuchtungsstrahlengang kann das Faserende oder eine
Leuchtfeldblende darstellen, die Blende im
Detektionsstrahlengang kann durch selektives Auslesen der CCD-
Pixel im Bereich der einzelnen Beleuchtungsflecken, durch ein
Lochblendenarray vor der CCD-Kamera oder durch eine Feldblende
im Bereich der Feldlinse erzeugt werden.
Auch eine Durchlichtbeleuchtung kann mit dieser Konfokalität
realisiert werden, wenn ein entsprechendes Linsenarray wie das
Linsenarray 2i vorgesehen wird.
Bei der Ausführung als Reader für Fluoreszenzmessungen wird
vorzugsweise ein Fokusdurchmesser von 50 bis 500 µm, besonders
150 µm, bei einer numerischen Apertur von 0,6 bis 0,7
vorgesehen.
Als Reader für Lumineszenz wird der Fokusdurchmesser besser dem
Töpfchendurchmesser (Durchmesser eines Wells) von 3 bis 4 mm
bei 384er Mikrotiterplatten angepaßt.
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) kann mit dem
gleichen optischen Konzept parallelisiert und damit für High-
Throughput-Anwendungen tauglich werden. Für ein gutes Signal-
Rausch-Verhältnis ist hier jedoch die Reduzierung des
Meßvolumens in den Bereich von Femtolitern mit einem
Fokusdurchmesser von 0,1-10 µm vorteilhaft. Die minimale
Korrelationszeit ist jedoch durch die Integrations- und
Auslesezeit des CCD-Arrays begrenzt. Parallel auslesbare
Detektor-Arrays wie APD-Arrays sind daher in dieser Anwendung
zu bevorzugen.
Zur leichten Anpassung an die unterschiedlichen Meßverfahren
wird daher ein modular aufgebauter Reader vorgeschlagen, bei
dem das probenseitige Linsenarray 2i austauschbar ist.
Es sind damit folgende Vorteile der Erfindung hervorzuheben:
- - Hohe Kanalzahl mit größenordnungsmäßig 102 Kanälen ist gut möglich und ergibt wirkungsvolle Parallelisierung.
- - Eine hohe Fluoreszenz-Nachweisempfindlichkeit ist durch die große mögliche Apertur der Einzellinsen 21, 22, 23 des Mini-Linsenarrays gegeben.
- - Eine geringe Leistung der Lichtquelle 9 ist ausreichend, weil die Beleuchtung strukturiert erfolgt und die hohe Fluoreszenz-Nachweisempfindlichkeit gegeben ist.
- - Eine starke Unterdrückung von störender Fluoreszenz von außerhalb des Meßvolumens (typisches Meßvolumen bei Fluoreszenzmessungen für Mikrotiterplatten und 96-Kanal- Optik: wenige Nanoliter) durch die konfokale Detektion erlaubt die Messung von homogenen Proben trotz möglicherweise starker Fluoreszenzkonzentrationen auf dem Boden durch Ausfällungen und trotz starker Eigenfluoreszenz der Böden und Wände der Wells in der Mikrotiterplatte.
- - Eine Unabhängigkeit von der Füllhöhe bei Fluoreszenzmessungen wird durch die Konfokalität ebenfalls bewirkt.
- - Fluoreszenzfilter und Strahlteiler mit Standardmaßen (Durchmesser im Bereich von 25 mm) können verwendet werden, da die großen Abmessungen der Mikrotiterplatten durch das Teleskop verkleinert werden (Durchmesser am CCD- Array ca. 15 mm).
- - Das Übersprechen zwischen benachbarten Proben (Wells) ist durch die lokale Beleuchtung und konfokale Detektion prinzipiell gering und kann durch eine Lochmaske oder Stege zwischen den Linsenelementen der Linsenarrays und simultane Verwendung z. B. nur jedes zweiten Wells (z. B. 96-Kanal-Detektion bei 384er-Mikrotiterplatten) weiter reduziert werden.
- - Die Datenerfassung ist auch bei der hohen Kanalzahl durch Verwendung eines CCD-Arrays einfach.
- - Flexibilität im Format ist gegeben, da das 96er Raster des Readers auch zu höher integrierten Mikrotiterplatten (z. B. 384, 864, 1536 Wells) und zu sogenannten Zell-Chips und DNA-Chips paßt.
- - Kinetische Fluoreszenzmessungen werden durch die Vielkanalausführung besonders unterstützt.
- - An zellbasierten Arrays können Fluoreszenzmessungen durch Fokussierung des Linsenarrays 2i auf Zellen, die auf dem Boden des Wells aufgebracht sind, durchgeführt werden. Ortsaufgelöstes Auslesen der individuellen, hier möglichst großen Spots auf der CCD mit einer Auflösung von etwa der Zellgröße oder besser erlaubt eine wesentlich detailliertere, ortsaufgelöste Analyse der biologischen Funktion der zu untersuchenden Substanz. Dieses High Content Screening (HCS) erlaubt z. B. den Vergleich der Fluoreszenzkonzentrationen außerhalb, auf und innerhalb der Zelle und im Zellkern. Auch hier ist die Kinetik wichtig.
Claims (9)
1. Optisches System mit einem Linsenarray (21-23) und einer
Feldlinse (5), das ein Gegenstandsarray (11-13) auf ein
Detektorarray (61-63) abbildet.
2. Optisches System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß zwischen Linsenarray (21-23) und Feldlinse (5) und
dieser und dem Detektorarray (61-63) je eine Linse (41,
42) eines Teleskops angeordnet ist.
3. Optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-2,
dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Detektorarray (6) ein
Mikrolinsenarray (7) angeordnet ist.
4. Optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-3,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Auflichtbeleuchtung (9,
91, 92) integriert ist.
5. Optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-4,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Lochblendenarray (3)
zwischen Linsenarray (21-23) und Feldlinse (5) angeordnet
ist.
6. Optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenstandsarray eine
Mikrotiterplatte (1) gefüllt mit der zu untersuchenden
Probe oder ein Substanz-Chip ist.
7. Optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-6,
dadurch gekennzeichnet, daß das Detektorarray (6) ein CCD-
Array oder ein Photodioden-Array ist.
8. Anordnung nach mindestens einem der Ansprüche 1-7,
gekennzeichnet durch die Ausbildung als Reader für
Mikrotiterplatten mit Absorption, Fluoreszenz
einschließlich Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, oder
Lumineszenz.
9. Spektrophotometer, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
optisches System nach mindestens einem der Ansprüche 1-8
enthält.
Priority Applications (9)
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