DE19936999A1

DE19936999A1 - Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern

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Publication number: DE19936999A1
Application number: DE19936999A
Authority: DE
Original assignee: Jena Optronik GmbH
Current assignee: Jena Optronik GmbH
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2019-08-03
Also published as: US6580081B1; DE19936999C2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern mit einer Vielzahl von Einzelproben, insbesondere zur Analyse von chemischen und biologischen Probenträgern. DOLLAR A Die Aufgabe der Erfindung, eine neue Möglichkeit zum Erfassen von Fluoreszenzstrahlung matrixförmiger Probenträger mit einer Vielzahl von Einzelproben zu finden, die ein quantitatives Auslesen der von den einzelnen Probensubstanzen charakteristisch beeinflußten Fluoreszenzstrahlung mit großer Empfindlichkeit gestattet, wird erfindungsgemäß gelöst, indem bei gleichzeitigem Anregen der Fluoreszenzstrahlung einer Vielzahl von Substratpixeln die Übertragungsoptik (23) zum Übertragen der von einzelnen Substratpixeln abgegebenen Fluoreszenzstrahlung auf einen Vielelement-Empfänger (51) ein abbildendes Objektiv (41) enthält, über das jedes Substratpixel einer festgelegten Gruppe von Empfängerelementen des Vielelement-Empfängers (51) zugeordnet ist und das mit einer zusätzlichen Aperturblende (42) zur Beschränkung des Winkelbereichs der aufgenommenen Fluoreszenzstrahlung ausgestattet ist, so daß den Empfängerelementen, die jeweils einem bestimmten Substratpixel zugeordnet sind, im wesentlichen kein Fluoreszenzlicht benachbarter Substratpixel zugeführt wird, und eine Dunkelfeldbeleuchtung zur Anregung einer Vielzahl von Substratpixeln mit einem Anregungsstrahlenbündel, das die Apertur des Objektivs (41) sowie einen wesentlichen, die Objektivapertur umgebenden ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern, insbesondere zur Analyse von chemischen und biologischen Probenträgern, wie z. B. Nanotiterplatten oder Bio-Chips.

Für Aufgaben der biotechnischen Analyse (Screening) großer Probenmengen, vorzugsweise für die Genanalyse (z. B. bei der Virendiagnostik) ist die Verwendung sogenannter Mikrotiterplatten und zugehöriger Handhabetechnik eine eingeführte Technik (Pharmaforschung, klinische Praxis usw.). Diese Technik zeichnet sich dadurch aus, daß in einer Mikrotiterplatte der Größe 8 cm × 12 cm je nach Ausführungsform 96 (verbreitetster Typ), 384 oder 1536 verschiedene Probensubstanzen untergebracht werden können. Zum Befüllen der einzelnen Kavitäten sind je nach Art der Mikrotiterplatte Probenmengen in der Größenordnung von 100 µl erforderlich.

Im Zuge der Effektivitätssteigerung sind international Forschungs- und Entwicklungsarbeiten zur wesentlichen Vergrößerung der Anzahl der (gleichzeitig verarbeitbaren) Kavitäten bei gleichzeitiger wesentlichen Verkleinerung der erforderlichen Probenmengen und einer wesentlichen Erhöhung des Probendurchsatzes im Gange. Diese Ziele sollen erreicht werden durch den Übergang von Mikrotiterplatten zu (z. B. mit mikrophotolithographischen Technologien hergestellten) Bio-Chips und schnellem Auslesen und Verarbeiten (High Throughput-Screening, HTS) der Bio-Chips.

Zum Auslesen von Bio-Chips (wie auch von Mikrotiterplatten oder beliebigen anderen chemischen Probenträgern) wird das Probenmaterial mit Licht je nach Art der Proben im UV- bis in den NIR-Bereich bestrahlt, um bestimmte Substanzen in den Proben (bevorzugt werden Fluoreszenz-Marker dem Probenmaterial zugesetzt) durch die Wirkung der Beleuchtungsstrahlung zu einer stimulierten Strahlung zu veranlassen und damit das Vorhandensein von bestimmten Substanzen (oder Bestandteilen, an die eine Marker- Substanz angekoppelt hat) nachzuweisen bzw. deren Anteil im Probenmaterial zu bestimmen.

Ein einzelner Bio-Chip kann auf einer Fläche von einigen mm² bis cm² mehrere zehntausend Spots (vergleichbar mit den Kavitäten der Mikrotiterplatte) beinhalten, wobei in Summe über alle Spots lediglich Probenmengen in der Größenordnung von einigen Nanolitern (nl) erforderlich sind. Wegen der dadurch enorm gestiegenen Zahl der auszuwertenden Proben setzt sich zum schnellen Auslesen der matrixförmigen Anordnung der Pixel neben dem ebenfalls etablierten Scannerprinzip (mit serieller Laserbeleuchtung der Spots und Detektion der angeregten Strahlung mittels eines Einzelempfängers, z. B. Photonenzähler [SEV bzw. PMT]) zunehmend das sogenannte Kameraprinzip durch. Dabei werden die Pixel des Bio- Chips parallel beleuchtet und viele oder alle Pixel des Probenträgers gleichzeitig ausgelesen unter Verwendung einer optoelektronischen Empfängermatrix (z. B. CCD). Beispiele für das Kamera-Prinzip sind die Geräte:
DIANA (Raytest, US)
ARTHUR-Fluoroimager (EG Wallac, FI)
ArrayWoRx (Applied Precision, US)

Ein Beispiel für die Anwendung des Kamera-Prinzipes ist ein Nanotiterplatten-Auslesesystem aus einem BMBF-Verbundprojekt LINDAU (Laser-induzierte Fluoreszenz-Detektion auf mikrostrukturierten Probenträgern zur Analytik im Umweltbereich), das in dem Fachartikel "Optische Mikrosysteme für die Umweltmeßtechnik" (in: Laser und Optoelektronik, 30 (1), 1998, S. 33-35) beschrieben ist. Gemäß dieser Veröffentlichung arbeitet man mit einer direkten Auflichtbeleuchtung über einen dichroitischen Spiegel, der die Strahlungswellenlängen von Beleuchtung und Fluoreszenzstrahlung weitgehend trennen soll. Obwohl die hier verwendete (und auch allgemein empfohlene) Beleuchtungsart bei der Analyse von Fluoreszenzstrahlung eines Objekts die Auflichtbeleuchtung ist, weil sie die wenigsten Probleme bei unterschiedlicher Transmission der untersuchten Proben mit sich bringt, haben reflektierte oder gestreute Anteile des Beleuchtungslichts - infolge der spezifischen Oberfläche der Bio-Chip-Pixel, wie sie nachfolgend noch genauer beschrieben wird, auch bei Einsatz guter Sperrfilter für die Wellenlängen der Beleuchtungsstrahlung - merklichen Einfluß auf das Meßergebnis, da der Empfänger wegen der sehr viel schwächeren Fluoreszenzstrahlung eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweisen muß.

Eine weitere im Stand der Technik übliche Maßnahme zur Steigerung der Empfindlichkeit der Detektion von Fluoreszenzstrahlung ist die optische Abbildung der Probenpixel auf den Empfänger mittels hochaperturiger Objektive, um möglichst viel von dem an sich schwachen Fluoreszenzlicht auf den Empfänger zu konzentrieren. Beispielsweise weisen Anbieter von Bio-Chip-Analysegeräten, so z. B. der Anbieter von Laserscansystemen, General Scanning, Inc. (USA), als Verkaufsargument auf die hohe Apertur des verwendeten Objektivs hin. Auch nach allgemeiner Lehrmeinung, wie man sie beispielweise bei O. Beyer im Handbuch der Mikroskopie (Verlag Technik Berlin, 3. Auflage, 1988, S. 221 ff.) für die Fluoreszenzmikroskopie nachlesen kann, sind bei Objektiven gleicher Vergrößerung diejenigen mit hoher Apertur zu bevorzugen, wobei zur weiteren Apertursteigerung noch auf Objektivimmersionen verwiesen wird.

Die Oberfläche jedes einzelnen Spots eines Bio-Chips ist (nach einer ganzen Reihe von technologischen Schritten zur Präparation des Bio-Chips) im optischen Sinne allgemein nicht eben, da sie zunächst eine gewölbte Tröpfchenform aufweist, die dann im Laufe der Bearbeitungsschritte nach und nach eintrocknet und damit eine unregelmäßige (schrumpelige) Oberfläche erhält. Damit ergeben sich bei der üblichen Auflichtbeleuchtung Probleme im Auswertekanal dadurch, daß durch Reflexion und Streuung an der allgemein unregelmäßigen, rauhen Oberfläche unerwünschte Anteile der Beleuchtungsstrahlung zum Empfänger gelangen. Dieser Tatsache wird in dem oben erwähnten Fluoroimager von EG WALLAC [vgl. z. B. Firmenprospekt 1442-960-01 (April 1998) zum ARTHUR multi-wavelength fluoroimager] insoweit Rechnung getragen, daß Durchlichtbeleuchtung, indirekte und laterale Auflichtbeleuchtung angeboten werden. Als Strahlungsquellen zur lateralen Anregung von Fluoreszenz werden ein Xenon-Strahler, der ein kontinuierliches Spektrum mit relativ gleichbleibender Intensität abgibt, und UV-Strahler, die sich durch intensive diskrete Spektrallinien im nahen UV- und sichtbaren Bereich auszeichnen, verwendet, wobei die gewünsche Beleuchtungswellenlänge durch Auswahl eines entsprechenden Anregungsfilters ausgewählt werden kann. Ob oder inwieweit durch diese Arten der Beleuchtung jedoch die Quantität der erzeugten Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Proben vergleichbar ist, kann der Veröffentlichung nicht entnommen werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Möglichkeit zum Erfassen von Fluoreszenzstrahlung matrixförmiger Probenträger mit einer Vielzahl von Einzelproben zu finden, die ein quantitatives Auslesen der von den einzelnen Probensubstanzen charakteristisch beeinflußten Fluoreszenzstrahlung mit großer Empfindlichkeit gestattet. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Anregungsintensität bei Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzstoffen vergleichbar zu machen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einer Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern mit einer Vielzahl von Einzelproben, die metrisch geordnete Pixel auf einem Substrat darstellen und eine durch die jeweilige Probensubstanz charakteristisch beeinflußte Fluoreszenzstrahlung abgeben, mit einer Beleuchtungseinrichtung zum gleichzeitigen Anregen der Fluoreszenzstrahlung einer Vielzahl von Substratpixeln, enthaltend eine Lichtquelle und ein spektral schmalbandiges Anregungsfilter, das je nach vorliegendem Fluoreszenzstoff wechselbar ist, mit einer Übertragungsoptik zum Übertragen der von einzelnen Substratpixeln abgegebenen Fluoreszenzstrahlung auf einen Empfänger mit einer Vielzahl von Empfängerelementen und einem dem Empfänger vorgelagerten wechselbaren Filter zum Durchlassen der Wellenlänge des Fluoreszenzstoffes und Blockieren der Anregungswellenlänge, dadurch gelöst, daß die Übertragungsoptik ein abbildendes Objektiv enthält, über das jedes Substratpixel einer festgelegten Gruppe von Empfängerelementen des Empfängers zugeordnet ist und das mit einer zusätzlichen Aperturblende zur Beschränkung des Winkelbereichs der vom Objektiv erfaßten Fluoreszenzstrahlung ausgestattet ist, so daß den Empfängerelementen, die jeweils einem bestimmten Substratpixel zugeordnet sind, im wesentlichen kein Fluoreszenzlicht benachbarter Substratpixel zugeführt wird, und daß die Beleuchtungseinrichtung eine Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur großflächigen Beleuchtung einer Vielzahl von Substratpixeln unter Ausbildung eines bezüglich der Achse des Objektivs symmetrischen Anregungsstrahlenbündels, das die Apertur des Objektivs sowie einen wesentlichen, die Objektivapertur umgebenden Winkelbereich ausspart, aufweist.

Vorteilhaft wird als Objektiv ein Mikroobjektiv eingesetzt, um eine ausreichend vergrößerte Abbildung mit geringen Abbildungsfehlern der Substratpixel auf dem Empfänger zu erhalten. Zur Vermeidung eines nachweisbaren Übersprechens der Fluoreszenzstrahlung benachbarter Substratpixel auf ihnen nicht zugeordnete Empfängerelemente wird die zusätzliche Aperturblende vorzugsweise so dimensioniert, daß die wirksame numerische Apertur des Mikroobjektivs um 10 bis 30% reduziert ist.

Es ist zweckmäßig, als Objektiv ein Mikroobjektiv mit einer außerhalb des Objektivs liegenden Aperturblendenebene, in der die zusätzliche Aperturblende einfach angebracht werden kann, vorzusehen.

Vorzugsweise kann ein Mikroobjektiv mit zehnfacher Vergrößerung und einer Apertur von 0,2 bis 0,25 eingesetzt werden. Dabei ist mittels der zusätzlichen Aperturblende die wirksame Apertur des Mikroobjektivs um 15 bis 30% zu reduzieren.

Bei einem ins Unendliche abbildenden Mikroobjektiv ist zweckmäßig die Übertragungsoptik durch eine in einem längenverstellbaren Tubus angeordnete Tubuslinse ergänzt zur Erzeugung einer scharfen optischen Abbildung der die Fluoreszenzstrahlung emittierenden Substratpixel auf die zugeordneten Gruppen von Empfängerelementen.

Die Dunkelfeldbeleuchtungseinheit wird aus Gründen der Homogenität der Anregungsstrahlung in der Substratebene zweckmäßig symmetrisch ausgeführt.

Das kann zum einen vorteilhaft mittels Lichtleitern, deren Lichtaustrittsfenster, verteilt um die optische Achse des Objektivs, auf einen Fleck des Substrats fokussiert sind, geschehen.

Zum anderen wird als Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur Durchlichtbeleuchtung des Substrats vorzugsweise ein rotationssymmetrisch aufgebauter Dunkelfeldkondensor zur Erzeugung eines ringförmigen Anregungsstrahlenbündels verwendet. Dazu ist ein Trocken- Dunkelfeldkondensor besonders geeignet.

Bei Verwendung eines Dunkelfeldkondensors ist es vorteilhaft, diesem eine zusätzliche Optik als Kollektor voranzustellen.

Um Fluoreszenzstrahlungsmessungen bei Anregung mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen vergleichbar zu machen, sind die spektrale Emission der Beleuchtungseinrichtung und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abzustimmen, daß deren Produkt über einen für die zu detektierenden Fluoreszenzsubstanzen erforderlichen Wellenlängenbereich annähernd eine Konstante ergibt. Zur optimalen Anregung von Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Fluoreszenzstoffe wird vorteilhaft eine intensive, kontinuierliche Lichtquelle mit einem austauschbaren, an die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzstoffes angepaßten Bandpaßfilter eingesetzt.

Als breitbandige Lichtquelle ist zweckmäßig eine Halogenlampe oder Xenonlampe eingesetzt. Damit die Lichtquelle räumlich und damit vorzugsweise thermisch von den übrigen Komkponenten getrennt ist, wird die Lichtquelle vorteilhaft über einen Lichtleiter mit der Dunkelfeldbeleuchtungseinheit gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt vorzugsweise mittels eines Flüssigkeitslichtleitkabels, um die Transmissionsverluste der Intensität der Anregungsstrahlung im gewünschten Wellenlängenbereich gering zu halten.

Bei Verwendung einer Lichtquellenankopplung über Lichtleitkabel sind die spektrale Emission der Lichtquelle, die spektrale Transmission des Lichtleiters und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abgestimmt, daß das Produkt aus diesen drei spektralen Größen annähernd eine Konstante ergibt.

Die erwähnten optischen Baugruppen werden für die Anpassung an spezielle Anwendungsfälle in vorteilhafter Weise zu austauschbaren Modulen zusammengesetzt. Zweckmäßig ist die erfindungsgemäße Anordnung aufeinanderfolgend in ein Lichtquellenmodul, vorzugsweise mit angeschlossenem Lichtleiter zur Übertragung des Anregungslichts, ein Modul zur Lichteinkopplung und Strahlaufweitung, ein Substratträgermodul, ein Abbildungsmodul für die Fluoreszenzstrahlung und ein Kameramodul unterteilt, wobei das Substratträgermodul insbesondere zur Aufnahme großflächiger Substrate und zum fortlaufend aufeinanderfolgenden Verarbeiten mehrerer Substrate eine Substratverschiebeeinheit enthält.

Der Grundgedanke der Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß die im Stand der Technik der Fluoreszenzanalyse geltende Empfehlung, die Übertragung des sehr schwachen Fluoreszenzlichts auf den Empfänger mit möglichst hochaperturigen Objektiven zu realisieren, nicht in jedem Fall günstig ist. Wie sich in theoretischen und experimentellen Ergebnissen bei der Erprobung des Kamera-Prinzips gezeigt hat, führen große Aperturwerte von realen Abbildungsoptiken bei einer quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten von kleinen und eng benachbarten Matrixelementen zu merklichem Übersprechen (Anteile der Fluoreszenzstrahlung eines bestimmten Substratpixels gelangen bei der Abbildung auf eine CCD-Matrix auch auf benachbarte Empfängerelemente, die eigentlich jeweils ausschließlich die Fluoreszenzintensität eines benachbarten Substratpixels erfassen sollten). Insbesondere bei einer hohen Objektivapertur führt das Übersprechen zu einer solchen Beeinflussung der Fluoreszenzmessungen, daß diese Verfälschung der einzelnen Probenmeßwerte für quantitative Fluoreszenzanalysen nicht tolerierbar ist. Die Lösung dieses Problems wird gemäß der Erfindung erreicht, indem die vorgegebene Apertur eines vergrößernd abbildenden Objektivs in einem solchen Umfang beschränkt wird, daß das Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung ausreichend unterdrückt wird. Dabei hängt das Ausmaß der Reduzierung der Apertur im wesentlichen vom Korrektionsgrad des Objektivs gegenüber Abbildungsfehlern (Aberrationen) ab. So sind bei Einsatz von (in der Regel gut korrigierten) Mikroobjektiven Reduzierungen unter 30% völlig ausreichend, während bei Fotoobjektiven Aperturreduzierungen bis 50%, teilweise sogar bis zu 65%, vonnöten sind, um das Übersprechen ausreichend zu unterbinden.

Nicht nur im letzteren Fall geht mit der Aperturverringerung auch eine erhebliche Lichtschwächung der Fluoreszenzstrahlung einher, die durch geeignete Maßnahmen bei der Beleuchtung der Substrate kompensiert werden muß. Dazu wird den unterschiedlichen verwendeten Fluoreszenzstoffen bezüglich deren spezifischer optimaler Anregungs wellenlänge und einer gleichmäßig intensiven Anregung bei den unterschiedlichen Anregungswellenlängen Rechnung getragen durch Verwendung einer geeigneten kontinuierlich intensiven Lichtquelle, Übertragungsmedien mit entsprechend hoher Transmission und abgestimmten spektralen Charakteristiken von Beleuchtung und Empfänger. Für die letztere Maßnahme werden die spektrale Emission der Beleuchtungseinrichtung und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abgestimmt, daß deren Produkt über einen für die zu detektierenden Fluoreszenzstoffe erforderlichen Wellenlängenbereich annähernd eine Konstante ergibt. Zu erwähnen ist in diesem Zusammenhang, daß - genau genommen - das Produkt aus der spektralen Emission der Beleuchtung auf der Anregungswellenlänge und der spektralen Empfindlichkeit des Empfängers auf der Emissionswellenlänge der Fluoreszenz eine Konstante ergeben müßte. Da die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzwellenlängen der gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffe jedoch nur um einige 10 nm auseinanderliegen, kann diese kleine Ungenauigkeit außer Betracht bleiben, wenn das Produkt der spektralen Charakteristika über den gesamten benötigten Wellenlängenbereich ausreichend konstant ist.

Mit der erfindungsgemäßen Anordnung ist es somit möglich, das Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung benachbarter Substratpixel auf dem Empfänger zu minimieren und die dabei zwangsläufig eintretenden Einbußen an detektierter Fluoreszenzintensität durch effizientere Beleuchtung der untersuchten Substratpixel zu kompensieren. Somit wird ein quantitatives Auslesen von Fluoreszenzstrahlung realisiert, bei dem jede einzelne auf einem Probenträger mit einer Vielzahl von Einzelproben befindliche Probensubstanz mit großer Empfindlichkeit bezüglich der Menge des enthaltenen Fluoreszenzstoffes analysiert werden kann und dessen Ergebnisse gerade auch bei Anwendung verschiedener Fluoreszenzstoffe untereinander vergleichbar sind.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Die Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung in modularer Bauweise,

Fig. 2 eine Intensitätsverteilung der Fluoreszenzstrahlung eines Substratpixels bei der Abbildung auf den Empfänger ohne die Reduzierung der Apertur des Objektivs,

Fig. 3 eine Intensitätsverteilung der Fluoreszenzstrahlung eines Substratpixels bei der Abbildung auf den Empfänger mit reduzierter Apertur des Objektivs,

Fig. 4 eine Darstellung der spektralen Charakteristika von Lichtquelle, Flüssigkeitslichtleiter und Empfänger

Die erfindungsgemäße Anordnung besteht, wie Fig. 1 entnehmbar, in ihrem Grundaufbau aus einer Lichtquelleneinheit (nicht dargestellt), die über einen angekoppelten Lichtleiter 1 spektral an den verwendeten Fluoreszenzstoff angepaßtes Anregungslicht bereitstellt, einer Beleuchtungsoptik 23, einem Substrat 32, einer Übertragungsoptik 43 mit einer beschränkenden Aperturblende 42 und einem Empfänger in Form einer CCD-Kamera 51.

Die Gesamtheit der optischen Komponenten ist in Modulen aufgebaut, in einem Lichtquellenmodul mit angeschlossenem Lichtleiter 1 zur Bereitstellung des Anregungslichts, einem Beleuchtungsmodul 2 zur Lichteinkopplung und Strahlaufweitung, einem Substratträgermodul 3 und einem Abbildungsmodul 4 für die Abbildung der vom Substrat 32 erzeugten Fluoreszenzstrahlung auf die in einem Kameramodul 5 enthaltene CCD- Kamera 51. Der Modulaufbau ermöglicht die einfache Anpassung der erfindungsgemäßen Anordnung an spezielle Anforderungen zur Analyse verschiedenster Substrate 32, die von Nanotiterplatten über getupfte Objektträger aus Glas (spotted glass slides) bis zu Bio-Chips mit mehreren zehntausend Spots reichen können. Der in Fig. 1 skizzierte Aufbau geht - ohne Beschränkung der Allgemeinheit - von einem Substrat 32 in Form eines Bio-Chips mit 20.000 Spots aus, bei denen ein Bio-Chip 32 jeweils als Ganzes ausgelesen werden kann und eine Substratbewegung mit Hilfe einer Substratverschiebeeinheit 33 lediglich zum Einbringen des nächsten Bio-Chips 32 vonnöten ist.

Das aus dem Lichtleiter 1 austretende Beleuchtungslicht wird von der Beleuchtungsoptik 23 aufgenommen und zur Ausleuchtung des Bio-Chips 32 übertragen. Dazu sorgt eine geeignete Lichtleiterhalterung 22 am Eingang des dem Lichtquellenmodul nachgeordneten Beleuchtungsmoduls 2 zur Lichteinkopplung und Strahlformung für eine ordnungsgemäße Arretierung und Justierung des Lichtleiters 1 gegenüber der Beleuchtungsoptik 23. Die Beleuchtungsoptik 23 realisiert bezüglich des Bio-Chips 32 ein Durchlicht- Dunkelfeldverfahren und besteht aus einem Kollektor 21 und einem Trocken- Dunkelfeldkondensor 31. Der Kollektor 21 sammelt zunächst die aus dem Lichtleiter 1 divergent austretende Lichtquellenstrahlung, bevor der Dunkelfeldkondensor 31 eine ringförmige Beleuchtung derart realisiert, daß der innere Aperturwinkel der Beleuchtung deutlich größer als der vorgegebene Aperturwinkel des Objektivs 41 der Übertragungsoptik 43 ist. Der vergrößerte Aperturwinkel des Dunkelfeldkondensors 31 dient der Aussparung von durch den Bio-Chip 32 hindurchtretender, gebeugter Anregungsstrahlung, so daß diese nicht in die Apertur des Objektivs 41 eintreten kann. Des weiteren ist zur Abschirmung von unerwünschtem Streulicht beliebiger Genese eine geeignet geformte Streulichtblende 34 vor dem Objektiv 41 angebracht.

Die im Bio-Chip 32 enthaltenen Fluoreszenzstoffe geben infolge der über den Dunkelfeldkondensor 31 indirekt einfallenden Anregungsstrahlung Fluoreszenzstrahlung ab, die für jedes einzelne Substratpixel des Bio-Chips 32 quantitativ erfaßt werden soll. Dazu ist eine exakte Zuordnung der Abbildung der Fluoreszenzstrahlung jedes einzelnen Substratpixels zu einer bestimmten Gruppe von Empfängerelementen der CCD-Kamera 51 realisiert, wobei ein Übersprechen der von einem bestimmten Substratpixel des Bio-Chips 32 stammenden Fluoreszenzstrahlung auf nicht zugeordnete Empfängerpixel der CCD-Kamera 51 wegen der Meßwertverfälschung weitgehend ausgeschlossen werden muß.

Zur gleichzeitigen Erfassung möglichst vieler (hier sogar aller) Substratpixel des auszulesenden Bio-Chips 32 wird in Übereinstimmung mit der allgemeinen Lehre der Fluoreszenzanalyse die optische Abbildung mit einem hochaperturigen Mikroobjektiv 41 (z. B. Mikroobjektiv 10 × 0,2 der Reihe EPIPLAN®) realisiert. Um das oben erwähnte Übersprechen der Fluoreszenzstrahlung zu unterdrücken, ist eine zusätzliche Aperturblende 42 in der außerhalb des Objektivs 41 liegenden Aperturblendenebene (gegebenenfalls auch in einer konjugierten Ebene) angebracht, die die angegebene Apertur des Mikroobjektivs 41 auf 0,16 bis 0,15 (um ca. 25%) reduziert. Die zusätzliche Aperturblende 42 wird, wie in Fig. 1 für ein als Beispiel angegebenes Mikroobjektiv 41 mit außerhalb liegender Aperturblendenebene dargestellt, am einfachsten in die Anschraubfassung des Objektives 41 integriert und kann damit bei der Fertigung des feststehenden Teils des Tubus 45 berücksichtigt werden.

Die Wirkung der zusätzlichen Aperturblende 42 ist bei vergleichender Betrachtung der Fig. 2 und 3 deutlich zu erkennen. Die Fig. 2 und 3 zeigen den Effekt, daß sich bei kleinerer Apertur die Fluoreszenzenergie besser auf das Empfängerelement und dessen unmittelbare Umgebung konzentrieren läßt. Das heißt, daß die bei großer numerischer Apertur des Objektivs 41 (gemäß Fig. 2) "gewonnene" Fluoreszenzenergie nicht nur zu einem guten Teil nicht vom zugeordneten Empfängerelement genutzt werden kann, sondern sogar noch zu einer Verfälschung der Meßwerte der benachbarten Empfängerelemente führt. Folglich ist beim Auslesen (gemäß dem sogenannten Kamera-Prinzip) von kleinen und eng benachbarten fluoreszierenden Elementen eines Bio-Chips 32 die Forderung nach einer möglichst großen Abbildungsapertur für eine quantitative Fluoreszenzanalyse nicht unbedingt sinnvoll. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, daß bei realen optisch abbildenden Elementen stets Abbildungsfehler (Aberrationen) vorhanden sind, die nicht oder nicht ausreichend korrigiert sind und somit das Fluoreszenzlicht der einzelnen Substratpixel untereinander vermischen (überlagern). Dagegen ist gemäß Fig. 3 aufgrund der Reduzierung der Apertur des eingesetzten Mikroobjektivs 41 mittels der zusätzlichen Aperturblende 42 die Fluoreszenzlicht-"Streuung" deutlich verringert gegenüber der Intensitätsverteilung bei normaler (voller) Apertur desselben Objektivs 41, wie sie für die Aufnahme von Fig. 2 vorhanden war.

Generell ist der Betrag der Reduzierung der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs einerseits von der numerischen Apertur selbst und andererseits - in wesentlich größerem Maße - vom Korrektionsgrad der Abbildungsfehler des Objektivs abhängig. Bei gängigen Mikroobjektiven mit einer numerischen Apertur zwischen 0,2 bis 0,25 ist reicht in der Regel eine Verringerung der numerischen Apertur um 15 bis 30%, um ein Übersprechen von Fluoreszenzlicht auf benachbarte Pixel ausreichend zu unterdrücken. Zum Vergleich sei angemerkt, daß beim Einsatz guter Fotoobjektive mit ähnlichen Aperturwerten eine Reduzierung um bis zu 50%, teilweise sogar bis zu 65% erforderlich ist, um das Übersprechen, wie in Fig. 3 dargestellt, hinreichend zu vermindern.

Das in den Substratpixeln des Bio-Chips 32 angeregte Fluoreszenzlicht wird zu einem Teil vom Mikroobjektiv 41 erfaßt, durch die zusätzliche Aperturblende 42 begenzt und über nachfolgende optische Elemente auf die CCD-Kamera 51 abgebildet. Da das verwendete Mikroobjektiv 41 den Bio-Chip 32 ins Unendliche abbildet, ist die Übertragungsoptik 43 mit einer Tubuslinse 44 komplettiert, die über einen einstellbaren Tubus 45 und eine Kamera- Adapteroptik 52 für eine scharfe Abbildung der Substratpixel des Bio-Chips 32 in die Ebene der Empfängerelemente der CCD-Kamera 51 sorgt. Mit dem Tubus 45 und der darin befindlichen Tubuslinse 43 wird eine Abbildung so realisiert, daß jedem Substratpixel eindeutig eine Gruppe von Empfängerelementen (z. B. 4, 9, 16 oder 25) der CCD-Kamera 51 zugeordnet ist. Die optischen Abstände der genannten Elemente, Mikroobjektiv 41, Tubuslinse 44 und Kamera-Adapteroptik 52, sind im Tubus 45 in gewissen Grenzen noch frei wählbar, da im Gegensatz zu einem herkömmlichen Mikroskop-Strahlengang, bei dem chromatische Abbildungsfehler in der Regel lediglich im Zusammenwirken der gesamten Abbildungsoptik korrigiert sind, die Abbildung nur für einen engen chromatischen Bereich der Fluoreszenzstrahlung realisiert werden muß.

Innerhalb des Tubus 45 ist weiterhin ein (möglichst direkt dem Empfänger vorgeordnetes) Filter 46 zum Durchlassen der Fluoreszenzstrahlung und Blockieren der Anregungsstrahlung vor der Tubuslinse 44 angebracht, das je nach Fluoreszenzfarbstoff im Bio-Chip 32 entsprechend der nachzuweisenden Fluoreszenzwellenlänge austauschbar ist.

Der Kameramodul 5 enthält eine (z. B. mit Peltierelement) gekühlte CCD-Kamera 51, um durch Unterdrückung thermischen Rauschens auch bei langen Integrationszeiten des CCD (von einigen Sekunden bis zu einigen Minuten) ein großes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Somit können auch auf diesem Wege die Verluste an Fluoreszenzenergie, die aus der verringerten Objektivapertur resultieren, durch Verlängerung der Integrationszeit der CCD-Kamera 51 zumindestens teilweise ausgeglichen werden.

Aufgrund des erwünschten großen Probendurchsatzes bei der Fluoreszenzanalyse von Bio- Chips sind jedoch lange Integrationszeiten nur bedingt vertretbar, so daß die - infolge der mittels zusätzlicher Aperturblende 42 reduzierten Apertur des Objektivs 41 - eintretende Schwächung der auf die CCD-Kamera 51 einfallenden Fluoreszenzstrahlung durch weitere geeignete Maßnahmen kompensiert werden muß.

Dabei stellt sich als erste wirkungsvolle Maßnahme eine besser zugeschnittene Anpassung der Anregungsstrahlung an die Anregungswellenlänge der Fluoreszenzstoffe dar. Die Schwierigkeit besteht allerdings darin, alle gängigen Fluoreszenzfarbstoffe, die bei der Bio- Chip-Analyse zum Nachweis bestimmter Inhaltsstoffe (z. B. DNA-Sequenzen) eingesetzt werden und unterschiedliche Anregungswellenlängen haben, mit gleicher Intensität anzuregen und damit die Fluoreszenzmessungen verschiedener Substrate auch bei Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzstoffe vergleichbar zu machen. Deshalb wird eine intensive Lichtquelle mit kontinuierlichem Spektrum, z. B. eine Halogenlampe, verwendet. Die emittierte Strahlung der Halogenlampe kann in an sich bekannter Weise mittels eines Anregungsfilters, welches schmalbandig für die optimale Anregungswellenlänge des im Biochip 32 verwendeten Fluoreszenzfarbstoffes durchlässig ist, dann bei nahezu gleichbleibender Intensität für beliebige Fluoreszenzstoffe frei gewählt werden.

Eine zweite die meßbare Fluoreszenzintensität der Subtratpixel des Bio-Chips 32 fördernde Maßnahme liegt in der Anpassung der spektralen Charakteristika der Beleuchtung und des Empfängers. Dazu sind - bei Zugrundelegung der speziellen Ausführung der Erfindung gemäß Fig. 1 - beleuchtungsseitig die spektrale Emission der Lichtquelle und die spektrale Transmission des Lichtleiters 1 und empfangsseitig die spektrale Empfindlichkeit der CCD- Kamera 51 so gestaltet, daß das Produkt dieser Größen über den Bereich der erforderlichen Anregungs- und Fluoreszenzwellenlängen nahezu eine Konstante ergibt. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse, wie sie für die im Beispiel verwendete Halogenlampe, den Lichtleiter 1 in Form eines Flüssigkeitslichtleiters vom Typ LUMATEC Ser. 380 und die CCD-Kamera 51 mit einem CCD-Chip vom Typ FT 1010 erzielt wurden.

Genau genommen müßte eigentlich das Produkt aus der spektralen Emission der Lichtquelle und der spektralen Transmission des Lichtleiters 1 auf der Anregungswellenlänge sowie der spektralen Empfindlichkeit des Empfängers auf der Emissionswellenlänge der Fluoreszenzstrahlung eine Konstante ergeben. Da jedoch die Anregungswellenlängen und die zugehörigen Fluoreszenzwellenlängen der gebräuchlichen Fluoreszenzfarbstoffe nur um einige 10 nm auseinanderliegen, kann diese kleine Ungenauigkeit außer Betracht bleiben, wenn das Produkt der spektralen Charakteristika über den gesamten benötigten Wellenlängenbereich ausreichend konstant ist.

Die vorgenannten Maßnahmen zur Verbesserung der Fluoreszenzlichtausbeute bei erfindungsgemäß reduzierter wirksamer Apertur des Objektivs 41 ermöglichen es, die für eine quantitative Auswertung jedes Substratpixels notwendige Fluoreszenzlichtmenge auf den Empfängerelementen der CCD-Kamera 51 zu erreichen, ohne bei der Fluoreszenzauslesung eine Verringerung des Chip-Durchsatzes aufgrund von erheblich erhöhten CCD-Integrationszeiten in Kauf nehmen zu müssen.

Liste der verwendeten Bezugszeichen

1

Lichtleiter

2

Beleuchtungsmodul

21

Kollektor

22

Lichtleiterhalterung

23

Beleuchtungsoptik

3

Substatträgermodul

31

Dunkelfeldkondensor

32

Bio-Chip (Substrat)

33

Substratverschiebeeinheit

34

Streulichtblende

4

Abbildungsmodul

41

(Mikro-)Objektiv

42

zusätzliche Aperturblende

43

Übertragungsoptik

44

Tubuslinse

45

Tubus

46

Filter

5

Kameramodul

51

CCD-Kamera

52

Kamera-Adapteroptik

Claims

1. Anordnung zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung von matrixförmigen Probenträgern mit einer Vielzahl von Einzelproben, die metrisch geordnete Pixel auf einem Substrat darstellen und eine durch die jeweilige Probensubstanz charakteristisch beeinflußte Fluoreszenzstrahlung abgeben, mit einer Beleuchtungseinrichtung zum gleichzeitigen Anregen der Fluoreszenzstrahlung einer Vielzahl von Substratpixeln, enthaltend eine Lichtquelle und ein spektral schmalbandiges Anregungsfilter, das je nach vorliegendem Fluoreszenzstoff wechselbar ist, mit einer Übertragungsoptik zum Übertragen der von einzelnen Substratpixeln abgegebenen Fluoreszenzstrahlung auf einen Empfänger mit einer Vielzahl von Empfängerelementen und einem dem Empfänger vorgelagerten wechselbaren Filter zum Durchlassen der Fluoreszenzwellenlänge und Blockieren der Anregungswellenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß

- die Übertragungsoptik (43) ein abbildendes Objektiv (41) enthält, über das jedes Substratpixel einer festgelegten Gruppe von Empfängerelementen des Empfängers (51) zugeordnet ist und das mit einer zusätzlichen Aperturblende (42) zur Beschränkung des Winkelbereichs der vom Objektiv (41) erfaßten Fluoreszenzstrahlung ausgestattet ist, so daß den Empfängerelementen, die jeweils einem bestimmten Substratpixel zugeordnet sind, im wesentlichen kein Fluoreszenzlicht benachbarter Substratpixel zugeführt wird, und
- die Beleuchtungseinrichtung eine Dunkelfeldbeleuchtungseinheit (31) zur großflächigen Beleuchtung einer Vielzahl von Substratpixeln unter Ausbildung eines bezüglich der Achse des Objektivs (41) symmetrischen Anregungs strahlenbündels, das die Apertur des Objektivs (41) sowie einen wesentlichen, die Objektivapertur umgebenden Winkelbereich ausspart, aufweist.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv ein Mikroobjektiv (41) ist.

3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Apertur des Mikroobjektiv (41) mittels der zusätzlichen Aperturblende (42) um 10 bis 30% verringert ist.

4. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv ein Mikroobjektiv (41) mit einer außerhalb des Objektivs liegenden Aperturblendenebene ist, in der die zusätzliche Aperturblende (42) angeordnet ist.

5. Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv ein Mikroobjektiv (41) mit zehnfacher Vergrößerung und einer Apertur von 0,2 bis 0,25 ist, wobei die wirksame Apertur des Mikroobjektivs (41) mittels der zusätzlichen Aperturblende (42) um 15 bis 30% verringert ist.

6. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beleuchtung des Substrats (32) als Dunkelfeldbeleuchtungseinheit (31) eine um die Achse des Objektivs (41) symmetrisch angeordnete Konfiguration von Lichtleitern, deren Austrittslicht fokussiert auf einen Fleck des Substrats (32) gerichtet ist, vorgesehen ist.

7. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beleuchtung des Substrats (32) eine Dunkelfeldbeleuchtungseinheit (31) zur Durchlichtbeleuchtung vorgesehen ist.

8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur Beleuchtung des Substrats (32) ein Dunkelfeldkondensor (31) ist.

9. Anordnung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Dunkelfeldbeleuchtungseinheit zur Beleuchtung des Substrats (32) ein Trocken-Dunkelfeldkondensor (31) ist.

10. Anordnung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß dem Dunkelfeldkondensor (31) ein Kollektor (21) vorgeordnet ist.

11. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vergleichbarkeit von Fluoreszenzstrahlungsmessungen bei Anregung mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen die spektrale Emission der Beleuchtungseinrichtung und die spektrale Empfindlichkeit des Empfängers so aufeinander abgestimmt sind, daß deren Produkt über einen für die zu detektierenden Fluoreszenzsubstanzen erforderlichen Wellenlängenbereich annähernd eine Konstante ergibt.

12. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur optimalen Anregung von Fluoreszenzstrahlung unterschiedlicher Fluoreszenzstoffe eine intensive kontinuierliche Lichtquelle mit einem austauschbaren, an die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzstoffes angepaßten Bandpaßfilter vorgesehen ist.

13. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle eine Halogenlampe ist.

14. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle eine Xenonlampe ist.

15. Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle über einen Lichtleiter (1) mit der Dunkelfeldbeleuchtungseinheit (31) gekoppelt ist.

16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtleiter (1) ein Flüssigkeitslichtleiter ist.

17. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Baugruppen für die Anpassung an spezielle Anwendungsfälle zu austauschbaren Modulen zusammengesetzt sind.

18. Anordnung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß aufeinanderfolgend ein Lichtquellenmodul mit angeschlossenem Lichtleiter (1) zur Bereitstellung des Anregungslichts, ein Beleuchtungsmodul (2) zur Lichteinkopplung und Strahlformung, ein Substratträgermodul (3), ein Abbildungsmodul (4) für die Übertragung der Fluoreszenzstrahlung auf den Empfänger und ein Kameramodul (5) als Empfänger vorhanden sind, wobei das Substratträgermodul (3) insbesondere zur Aufnahme großflächiger Substrate (32) oder zum aufeinanderfolgenden Verarbeiten größerer Substrate oder Substratarrays eine Verschiebeeinheit (33) enthält.