DE19744768A1 - Klonierungsvektoren für die Herstellung von Adenoviralen Minimalviren - Google Patents

Klonierungsvektoren für die Herstellung von Adenoviralen Minimalviren

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Abstract

Die Erfindung betrifft Klonierungsvektoren für die Herstellung von Adenoviralen Minimalviren, umfassend DOLLAR A - zwei mehr als 8 Bp lange invariable Erkennungssequenzen für eine Restriktionsendonuklease, die die beiden adenoviralen terminalen invertierten Replikationssequenzen (ITR, inverted terminal repeats) flankieren, DOLLAR A - eine Multiple Klonierungsstelle zur Insertion von therapeutischen DNA-Fragmenten, in welche ggf. nichtkodierende chromosomale Säugetier-DNA einkloniert ist, DOLLAR A - eine Reportergenkassette, DOLLAR A - ein Verpackungssignal eines Bakteriophagen, DOLLAR A - zwei adenovirale terminale, invertierte Replikationssequenzen sowie ein adenovirales Verpackungssignal und DOLLAR A - ein bakterielles Plasmidrückgrat mit Replikationsursprung und bakteriellem Resistenzgen.

Description

Die Erfindung betrifft Klonierungsvektoren für die Herstellung von Adenoviralen Minimalviren. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Adenovirale Vektoren sind effiziente Gentransfervehikel für die somatische Gentherapie. Die Vektoren der ersten Generation bestehen aus dem vollständigen Genom des Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) mit Deletionen in der E1- und der E3-Region, in die jeweils Fremdgene inseriert werden können. Diese Vektoren sind in geeigneten Zellinien, welche die E1-Funktionen zur Verfügung stellen, zur selbständigen Vermehrung befähigt. Aufgrund der verbleibenden viralen kodierenden Sequenzen haben solche Vektoren eine maximale Transportkapazität von ca. 8 Kb Fremd- DNA. Restexpression adenoviraler Gene scheint maßgeblich für die immunologische Eliminierung transduzierter Zellen in vivo, und damit auch für die zeitliche Begrenzung der Transgenesxpression und der entsprechenden therapeutischen Effekte verantwortlich zu sein (Yang, Y. et al., 1994, Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted for gene therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4401-4411).
Ein vielversprechender Ansatz zur Erhöhung der Transportkapazität bei gleichzeitiger Reduktion der Immunogenität ist die Auslagerung aller kodierenden adenoviralen Genomabschnitte aus dem therapeutischen Vektor (Chen, H.H. et al., 1997, Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1645-50). Zur Vermehrung und Verpackung solcher sogenannter Adenoviraler Minimalviren, die neben dem zu transportierenden therapeutischen Fremdgen nur noch die kurzen Signalsequenzen für die virale Replikationsmaschinerie (invertierte terminale Replikationssequenzen, engl. inverted terninal repeats, ITRs) sowie für die Verpackung in virale Hüllen (engl. packaging signal, PS) enthalten, sind auf Helferviren beruhende Systeme bereits beschrieben (Parks, R.J. et al., 1996, A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by cre-mediated excision of the viral packaging signal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13565-13570) und werden derzeit weltweit weiterentwickelt. Aufgrund der Größe der Konstrukte, die besondere Anforderungen an die Klonierungsstrategien stellt, ist die Klonierung von Minimalviren derzeit ein aufwendiger und zeitraubender Prozeß.
Ein Vektor zur Minimalvirusherstellung, aus dem nach Insertion therapeutischer Expressionkassetten Minimalviren hergestellt werden können, ist bereits beschrieben (Hardy, et al., 1997, Construction of adenovirus vectors through cre-lox recombination, J. Virol. 71, 1842-1849). In diesem wurde jedoch im Austausch gegen die adenoviralen kodierenden Sequenzen DNA des Phagen Lambda eingebaut, die nach dem heutigen Kenntnisstand destabilisierend auf das Adenovirale Minimalvirusgenom wirkt. Ferner schränkt der dort gewählte Mechanismus zur Virusentstehung die Auswahl der Transgene ein. Außerdem können die mit diesem System erzeugten Minimalviren nur in vitro eingesetzt werden, da ein stark immunogenes Reporterenzym verwendet wurde.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Klonierungssystem bereitzustellen, mit dem die Herstellung Adenoviraler Minimalviren vereinfacht wird und neue Komponenten einzufügen, die den Einsatz dieser Vektoren in vitro und in vivo erlauben.
Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Erfindungsgemäß werden im folgenden zwei Konstrukte (pMV und pMVX) vorgestellt, mit denen eine wesentlich vereinfachte und beschleunigte Herstellung rekombinanter Adenoviren des Minimalvirustyps möglich ist.
Die Klonierung der Adenoviralen Minimalviren wurde hier vereinfacht durch die Verwendung der Cosmidklonierung (siehe C.1.4.). Der hier geschaffene Mechanismus zur Virusentstehung schränkt die Transgenwahl nicht ein (siehe C.1.3.). Darüber hinaus wurde ein neuartiges Titerungssystem konstruiert, das die in-vivo-Anwendung der Adenoviralen Minimalviren erlaubt (siehe C.1.5.2.). Zudem enthält pMVX ein Fragment chromosomaler humaner DNA als virales Rückgrat zur Verbesserung der Stabilität (siehe C.2.6.1.) und der Flexibilität bei der Wahl der einzubauenden Fremd-DNA (siehe C.2.6.2.). Beide Vektoren sind mit allen bislang beschriebenen Helfersystemen zur Vermehrung und Verpackung von Minimalviren kompatibel.
C. Komponenten der Klonierungsvektoren C.1. Klonierungsvektor pMV (vgl. Abb. 1) C.1.1. Bakterielles Rückgrad aus pBlueskript
Das bakterielle Rückgrat des Plasmids stammt aus pBlueskript und enthält neben dem Replikationsursprung ein Beta- Lactamasegen zur Vermittlung einer Ampicillin-Resistenz. Das Beta-Lactamasegen ermöglicht die Anwendung üblicher Selektionsverfahren bei der Vermehrung von pMV und seiner Derivate sowie deren Klonierung. Der Replikationsursprung von pBlueskript unterliegt einer Multi-Kopien-Kontrolle in E.coli und ermöglicht dadurch die präparative Vermehrung des Minimalvirusvektors mit hoher Ausbeute in geeigneten E.coli- Stämmen.
C.1.2. Sequenzsignale für Replikation und Verpackung aus Adenovirus Serotyp 5 (Ad5)
Das Plasmid enthält das 5'-ITR mit dem Verpackungssignal (die ersten 514 Basenpaare (Bp) des Adenovirusgenoms) sowie das, 3'- ITR (die letzten 162 Bp des Adenovirusgenoms). Dies sind die minimal erforderlichen Signalsequenzen für die Erkennung des Minimalvirusgenoms durch die Replikationsmaschinerie des adenoviralen Helfervirus sowie die Verpackung der replizierten Minimalvirusgenome in virale Capside.
Die Verwendung der Enden des Adenovirusgenoms zur Einbringung der ITRs und des Verpackungssignals in Konstrukte zur Minimalvirusherstellung ist zwingende Grundlage zur Herstellung von Minimalviren und daher auch von anderen beschrieben.
C.1.3. Die ITRs flankierende Restriktionsschnittstellen für die Meganuklease (I-SceI) zur Freisetzung des rekombinan­ ten Virusgenoms
Die Freisetzung der ITRs ermöglicht ihre effektive Erkennung durch den Replikationsapparat. Die 18 Bp lange Erkennungssequenz vermittelt die höchste Spezifität für die Freisetzung der Enden und gleichzeitig höchste Flexibilität bei der Wahl der transgenen Sequenzen. Eine 18 Bp-Sequenz tritt statistisch nur einmal in 6,8 × 1011 Hasenpaaren auf, das menschliche Genom als Quelle potentieller Transgene enthält nur ca. 3 × 109 Basenpaare. Es ist damit praktisch auszuschließen, daß in einem gewünschten Transgen eine solche Erkennungssequenz auftritt, die mit dem Freisetzungsmechanismus interferieren würde.
Gezielt neben den ITRs eingebrachte Restriktionsschnittstellen für selten schneidende Restriktionsenzyme haben auch Hardy et al. (1997) beschrieben. Zur Freisetzung der ITRs werden hier Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease SfiI verwendet. Dieses Enzym hat aber eine nur 8 Bp lange spezifische Erkennungssequenz. Das Auftreten von Schnittstellen in der gewünschten Transgenkassette kann mit diesem System nicht ausgeschlossen werden kann.
C.1.4. Das cos-Signal des Phagen Lambda zur Klonierungserleichterung
Minimalvirusgenome besitzen die größte Stabilität, wenn ihre Genomgröße der des Wildtyp-Adenovirus (ca. 36 Kilobasenpaare (Kb)) möglichst nahe kommt. In diesem Größenbereich sind die klassischen Klonierungsverfahren sehr ineffizient und fehlerbehaftet.
Durch das cos-Signal erhält das Konstrukt die Eigenschaften eines Cosmidvektors. Die Verwendung von Cosmidklonierungs­ techniken ermöglicht eine hocheffiziente und größenselektierte Konstruktion rekombinanter Minimalvirusgenome. Die Größen­ selektion ergibt sich dabei aus der Verpackungskapazität des Lambda-Phagen, die nach Abzug des bakteriellen Teils im Plasmid genau dem als stabil geltenden Minimalvirus-Größenbereich von ca. 25-38 Kb (Mitani, K. et al., 1995, Rescue, propagation, and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3854-858) entspricht. Die Cosmidklonierungstechnik wird bislang hauptsächlich zur Herstellung von Genbanken eingesetzt. Ihre Anwendung zur Vereinfachung der Minimalvirusklonierung ist neu.
C.1.5. Reportergenkassette zur Titration
Minimalviren sind nicht zur selbständigen Replikation befähigt, daher kann die Titerung nicht nach den klassischen Adenovirus-Titerungsverfahren erfolgen. Die Titerung von Minimalviren, die aus pMV und dessen Derivaten erzeugt wurden, kann über Reportergene erfolgen, die über enzymatische Farbreaktionen oder immunologische Detektionsverfahren eine direkte Visualisierung infizierter Zellen ermöglichen. Es besteht die Auswahl zwischen zwei Reportersystemen, von denen eines neuartig ist:
C.1.5.1. Konstitutive Beta-Galaktosidase-Reportergenkassette in pMV-BG für in-vitro-Anwendungen
In pMV-BG ist eine konstitutive Beta-Galaktosidase- Expressionskassette inseriert. Sie besteht aus dem Beta- Galaktosidase-Gen unter Kontrolle des RSV-3'-LTRs (RSV- Promoter) und einem nachgeschalteten Polyadenylierungssignal. Die Visualisierung infizierter Zellen ist durch X-Gal-Färbung möglich.
Das Beta-Galaktosidase-Reportersystem zur Visualisierung viraler Infektion sowie zur Titerung von Viren ist ein allgemeines Verfahren und wurde bei Gentransfervektoren unterschiedlichster Art, einschließlich adenoviraler Minimalviren, bereits eingesetzt.
C.1.5.2. Regulierte PLAP-Reportergenkassette in pMV-PLAP für in-vivo-Anwendungen
Beta-Galaktosidase, ist in vivo ein starkes Immunogen. Zur Erzeugung von Minimalviren, die für in vivo Anwendung vorgesehen sind, wird in pMV-PLAP ein alternatives Titerungssystem angeboten, das auf einem Reportergensystem beruht, das in vivo nicht als Immunogen auftritt. Neben dem Polyadenylierungssignal enthält die regulierte Reportergenkassette zwei Komponenten, die für geringstmögliche Immunogenität sorgen:
Die Reportergenexpression wird durch den tet-Promotor gesteuert, der derzeit als der am besten regulierbare Promotor in Säugerzellen gilt (Gossen, M.& Bujard, H., 1992, Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline­ responsive promoters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 5547-551). Der Promotor ist nur in Anwesenheit des tet-Transaktivators aktiv. In Säugerzellen, die den Transaktivator natürlicherweise nicht exprimieren, ist der Promotor weitgehend stumm. Zur Titerung haben wir eine Zellinie erzeugt, die durch Adenoviren gut infizierbar ist und den tet-Transaktivator konstitutiv exprimiert.
Als Reportergen ist PLAP (placenta-like alkaline phosphatase) inseriert, ein gut charakterisiertes humanes Reportergen mit etablierten Nachweisverfahren (Kumar-Singh, R. and Chamberlain, J.S., 1996, Encapsidated adenovirus minichromosomes allow deliwery and expression of a 14 Kb dystrophin cDNA to muscle cells, Hum. Mol. Genet. 5, 913-921.), das im Menschen keine bekannten antigenen Eigenschaften hat.
Bei diesem Titerungssystem sind sowohl die beiden Komponenten (tet-Promotor und PLAP-Gen) als auch das zugrundeliegende Prinzip einer Doppelstrategie zur Vermeidung einer Immunantwort (regulierter Promotor, der im Zielorganismus stumm ist und Verwendung eines Reportergens, das dem Genom des Zielorganismus entstammt) zur Titerung von Gentherapievektoren generell neuartig.
C.1.6. Multiple Klonierungsstelle zur Insertion von therapeutischen DNA-Fragmenten bis zu einer Größe von ca. 30 Kb
pMV enthält eine Multiple Klonierungstelle mit unikalen Schnittstellen für mehrere Restriktionsenzyme zur erleichterten Insertion von therapeutischen DNA-Fragmenten. Unter Berücksichtigung der adenoviralen Verpackungskapazität können Fragmentgrößen bis ca. 30 Kb inseriert werden. Vektoren zur Minimalvirusherstellung mit einer Multiplen Klonierungsstelle sind bislang nicht beschrieben.
C.2. Klonierungsvektor pMVX (vgl. Abb. 2)
Der Minimalvirusvektor pMVX besitzt alle Komponenten von pMV außer der Multiplen Klonierungsstelle, an deren Stelle ein Stück nichtkodierende DNA aus dem menschlichen Genom eingefügt ist. Dieses verleiht dem Vektor neue Eigenschaften. Auch pMVX wird mit zwei verschiedenen Reportergenkassetten angeboten.
C.2.1. siehe C.1.1.
C.2.2. siehe C.1.2.
C.2.3. siehe C.1.3.
C.2.4. siehe C.1.4.
C.2.5. Reportergenkassette
C.2.5.1. Konstitutive Beta-Galaktosidase-Reportergenkassette in pMVX-BG siehe C.1.5.1.
C.2.5.2. Regulierte PLAP-Reportergenkassette in pMVX-PLAP siehe C.1.5.2.
C.2.6. 27,4-Kb-DNA-Fragment nichtkodierender humaner genomischer DNA
pMVX enthält ein 27,4 Kb großes, humanes DNA-Fragment X- chromosomalen Ursprungs, dessen Sequenz vollständig bekannt ist und keine codierenden Regionen enthält. Unerwünschte Effekte durch Genexpression aus dieser Komponente sind daher weitgehend auszuschließen. Gegenüber pMV ergeben sich folgende zusätzliche Eigenschaften:
C.2.6.1. Stabilisierung des Minimalvirusgenoms
Das chromosomale Fragment bildet das Rückgrat der von pMVX ableitbaren Minimalviren. Bislang bestehende Systeme verwenden z. B. DNA des Phagen Lambda als Rückgrat. Die mit Lambda-DNA aufgefüllten Minimalviren sind, wie aus Kongreßberichten bekannt, instabil, während die Insertion chromosomaler Fragmente stabilisierend wirkt. Obwohl dies bekannt ist, sind Vektoren zur Minimalviruserzeugung, die dieses systematisch ausnutzten, indem verschiedene Transgenkassetten in konstanten chromosomalen Kontext eingebaut werden können, bislang nicht beschrieben.
C.2.6.2. Restriktionsendonukleaseschnittstellen für erleich­ terte Insertion von therapeutischen Kassetten bei hoher Flexibilität bezüglich deren Größe
Durch geeignete Schnittstellen für kommerziell erhältliche Restriktionsendonukleasen können in pMVX mit einem Klonierungschritt Kassetten in einem Größenbereich von bis zu 18 Kb inseriert werden, und gleichzeitig kann eine Minimalvirus-Genomgröße eingehalten werden, die höchste Stabilität des abgeleiteten Minimalvirus sichert. Diese Flexibilität bezüglich der Größe der zu inserierenden Kassette ist für Minimalvirus-Klonierungsvektoren neuartig.
Alle Enzyme liefern Enden, die entweder bereits glatt oder durch Klenow-Polymerase auffüllbar sind. Eine Klonierung über glatte DNA-Enden ist bei der hier zur Anwendung kommenden Cosmidklonierung vorzuziehen.
In der Mitte des Rückgrats liegt eine unikale SnaBI- Schnittstelle (erzeugt direkt glatte DNA-Enden). Hier können unter Berücksichtigung der adenoviralen Verpackungskapazität Expressionskassetten bis zu einer Größe von ca. 5 Kb in die chromosomale Umgebung inseriert werden. Zur Insertion größerer Kassetten stehen paarweise organisierte Schnittstellen zur Verfügung. Je nach Größe der zu inserierenden Kassette kann die Klonierung über XhoI/XhoI (um ca. 5 Kb erhöhte Aufnahmekapazität), PmaCI/PmaCI bzw. PshAI/PshAI (um ca. 10 Kb erhöhte Aufnahmekapazität) oder PmaCI/PshAI (um ca. 18 Kb erhöhte Aufnahmekapazität) erfolgen. Ergebnis ist immer eine vom chromosomalen Rückgrat oder Teilen desselben eingerahmte Expressionskassette in einem Minimalvirusgenom mit der erforderlichen Genomgröße. Durch Kombination der beschriebenen Schnittstellen können auch Zwei- und Dreigenvektoren problemlos konstruiert werden.
C.2.6.3. Effektiverer Gentransfer
Die Einbettung der therapeutischen Kassette in den chromosomalen Kontext führt durch verschiedene Mechanismen zu effektiverem Gentransfer. Das ist vor allem darauf zurückzuführen, daß die in den Adenoviralen Minimalviren angewendete humane genomische DNA den Vektor nach Transfer in die Zielzelle stabilisiert.
D. Potentielle Anwendungsbereiche für pMV und pMVX D.1. Adenoviraler Gentransfer allgemein
Von pMV und pMVX abgeleitete Minimalviren sind nach dem derzeitigen Kenntnisstand ohne Einschränkung für das gesamte Spektrum des adenoviralen Gentransfers einsetzbar. Sie erfüllen die Sicherheitskriterien für gentherapeutische Vektoren und sind mit allen derzeit beschriebenen Helfersystemen zur Minimalvirusvermehrung kompatibel.
D.2. Adenoviraler Transfer von Genen in unverkürzter chromosomaler Form
Meistens enthalten die bislang konstruierten Minimalviren als therapeutische Expressionskassetten cDNA-Konstrukte, die in der Regel durch virale Promotoren gesteuert werden. Diese Konstrukte können unnatürlich hohe Expression des Transgenes bedingen, die über den therapeutischen Rahmen hinaus geht und die Zelle schädigen kann.
In die hier beschriebenen Minimalvirusvektoren lassen sich komplette Gene in natürlicher chromosomaler Organisation mit einer Gesamtgröße bis ca. 30 Kb (pMV) bzw. ca. 23 Kb (pMVX) inklusive ihrer physiologischen Promotoren einsetzen, deren Expression dann den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegt. Schädigende Wirkungen der Überexpression lassen sich so vermeiden.
D.3. Herstellung von Virusbanken
Bei der Herstellung von therapeutischen Minimalviren mit den hier beschriebenen Vektoren erfolgt klonales Arbeiten mit homogenen Insertpopulationen. Werden dagegen inhomogene Präparationen von DNA-Fragmenten (z. B. fragmentierte genomische DNA) in pMV oder pMVX eingesetzt, so entstehen Cosmidbanken. Werden diese zur Minimalvirusherstellung eingesetzt, entstehen Virusbanken, die zur Expressionsanalyse von Genen eingesetzt werden können.
Dieses könnte in Projekten zur Genomanalyse zur Anwendung kommen, da hier Techniken zur systematischen Funktionsanalyse der sequenzierten DNA-Stücke gesucht werden. Da bei der Genomanalyse häufig DNA-Fragmente untersucht werden, die im Bereich der Adenovirusverpackungskapazität liegen, wären Adenoviren interessante Expressionsvehikel für diese systematische Funktionsanalyse.
D.4. Erzeugung transgener Tiere
Adenoviren der ersten Generation wurden zur Herstellung von transgenen Mäusen eingesetzt (Tsukui et al., 1996, Transgenesis by adenovirus-mediated gene transfer into mouse zona-free eggs, Nature Biotechnology 14, 982-985). Die Konstruktion der entsprechenden homologen Rekombinationskonstrukte mit den hier beschriebenen Vektoren liefert aufgrund der erheblich erhöhten Aufnahmekapazität von Minimalviren für Fremd-DNA die Möglichkeit zur Insertion längerer homologer Bereiche, was zu erhöhter Rekombinationsfrequenz führen sollte. Zudem könnte die Erzeugung transgener Tiere bei Spezies, deren genetische Manipulation über die Es-Zell-Technologie derzeit noch nicht möglich ist, durch eine virale Strategie unter Verwendung von Minimalviren ermöglicht werden.
E. Ausführungsbeispiel
Die Erfindung soll nachfolgend am Beispiel der Klonierung des Vektors pMVX-BG näher erläutert werden:
E.1. Vorarbeiten
Die ITRs und das Verpackungssignal von Adenovirus Typ 5 (Ad5) sowie die konstitutive Beta-Galaktosidase-Expressionskassette wurden zunächst in das von der Firma Pharmacia vertriebenen Plasmid pSL1190 kloniert.
E.1.1. Klonierung des 3'-ITR von Ad5 in pSL1190 (es entsteht pSLITR)
Das 3'-ITR wurde mit den Starteroligonukleotiden AD5ITR1 (enthält als Verlängerung eine BglII-Schnittstelle) und AD5ITR3 (enthält als Verlängerung eine EcoRI-Schnittstelle) und wt-Ad5- DNA als Matrize durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das resultierende 176-Bp-PCR-Produkt wurde mit BglII und EcoRI verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen in der Multiplen Klonierungsstelle von pSL1190 inseriert.
Sequenz der verwendeten Starteroligonukleotide:
E.1.2. Klonierung des 5'-ITRS und des Verpackungssignals von Ad5 in pSL1190 (es entsteht pSLITRPS)
Das 5'-ITR mit dem angrenzenden Verpackungssignal von Ad5 wurde mit den Starteroligonukleotiden AD5ITR1 (enthält als Verlängerung eine terminale BglII-Schnittstelle) und AD5ITR2 (enthält als Verlängerung eine terminale Asp718-Schnittstelle) und wt-Ad5-DNA als Matrize durch PCR amplifiziert. Das resultierende 545-Bp-PCR-Produkt wurde mit BglII und EcoRI verdaut und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen in der Multiplen Klonierungsstelle von pSL1190 inseriert.
Sequenz der verwendeten Starteroligonukleotide:
E.1.3. Klonierung der Beta-Galaktosidase-Expressionskassette in pSLITRPS (es entsteht pSLITRPSBG)
Die konstitutive Beta-Galaktosidase-Kassette - bestehend aus dem RSV-Promoter, dem Beta-Galaktosidase-Gen sowie dem SV40- Polyadenylierungssignal - wurde aus pRSVBGSV40 (kloniert von Herrn Peter Löser) durch Doppelverdau mit NruI und XbaI als 4230-Bp-Fragment freigesetzt und in die kompatiblen HpaI- und AvrII-Restriktionsschnittstellen. in der Multiplen Klonierungsstelle von pSLITRPS (vgl. 1.2) inseriert.
E.2. Klonierung des Vektors pMVX-BG
Ausgangsplasmid für die Konstruktion der Vectors pMVX-BG war - neben den oben beschriebenen Plasmiden pSLITR (vgl. 1.1) und pSLITR2BG (vgl. 1.3) - das von der Firma Stratagene vertriebene Plasmid pBSKS-, auf dessen bakteriellem Rückgrat (Replikations­ ursprung und Ampicillin-Resistengen) aufbauend die einzelnen Komponenten inseriert wurden.
E.2.1. Insertion des 3'-ITR aus pSLITR (aus pBSKS- entsteht pBSITR)
Das 3'-ITR wurde durch Doppelverdau mit EcoRI und Asp718 als 222 Bp-Fragment aus pSLITR freigesetzt und in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen des Polylinkers von pBSKS- inseriert.
E.2.2. Insertion des 5'-ITRs, des Verpackungssignals und der konstitutiven Beta- Galaktosidase-Expressionskassette aus pSLITRPSBG (aus pBSITR entsteht pBSITR2BG)
Durch Doppelverdau des Ausgangsplasmides pSLITRPSBG mit PstI und BglII wurde ein 4780-Bp-Fragment freigesetzt, das das 5'- ITR, das Verpackungssignal sowie eine direkt daran anschließende konstitutive Beta-Galaktosidase- Expressionskassette (bestehend aus RSV-Promoter, Beta- Galaktosidase-Gen und SV40-Polyadenylierungssignal) enthält. Dieses wurde über die entsprechenden Restriktionsschnittstellen in die Multiple Klonierungsstelle von pBSITR inseriert.
E.2.3. Insertion ITR-flankierender Schnittstellen für die Meganuklease I-SceI (aus pBSITR2BG entsteht pMV-BG.MH)
In pMV-BG.PL liegen flankierend zu den ITRs unikale Schnittstellen für BglII und Spel. Zur Insertion von Schnittstellen für die Meganuklease I-SceI wurde das Plasmid durch Doppelverdau mit BglII und SpeI in ein 2952 Bp-Fragment (das bakterielle Rückgrat enthaltend) und ein 4965 Bp-Fragment (die Beta-Galaktosidase-Kassette sowie die ITRs und das PS enthaltend) gespalten. Die Fragmente wurden getrennt isoliert und die 5'-überhängenden Enden des 2952-Bp-Fragments durch Klenow-Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt. Die gerichtete Insertion der Meganukleaseschnittstellen erfolgte durch eine Vier-Fragment-Ligation dieser beiden Fragmente mit zwei synthetischen DNA-Verbindungsstücken, die die Erkennungssequenz der Meganuklease enthalten sowie jeweils ein glattes und ein überhängendes Ende (passend zu den glatten Enden des 2952- Fragmentes bzw. zu den überhängenden BglII und SpeI-Enden des 4965-Bp Fragments) enthalten. Diese DNA-Verbindungsstücke wurden durch Hybridisierung des Oligonukleotids ISceI-Rev mit dem Oligonukleotid ISceI-BglII bzw. ISceI-SpeI erzeugt.
Sequenz der verwendeten Oligonukleotide:
E.2.4. Insertion der cos-Erkennungssequenz des Bakteriophagen Lambda (aus pMV-BG.MH ensteht pMV-BG.COS)
Das Cos-Sequenzmotiv wurde aus dem Cosmid-Vektor pWE15 durch Doppelverdau mit ClaI und AccI als 2367-Bp-Fragment entnommen und in den unikalen NheI-Ort im bakteriellen Rückgrad von pMV- Bg.MH inseriert. Da die Enden der verwendeten Enzyme nicht kompatibel sind, wurden alle Fragmentenden mit Klenow- Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt und dann ligiert. Daraus resultierten zwei Produkte mit unterschiedlichen Insertionsorientierungen der Cos-Sequenz. Da die Sequenz orientierungsunabhängig ist, wurde eine der beiden Orientierungen willkürlich ausgewählt.
E.2.5. Insertion des 27,4-kB-Fragments nicht-codierender menschlicher genomischer X-chromosomaler DNA (aus pMV-BG.COS entsteht pMVX-BG)
Das 27,4-kB-Fragment wurde aus einem von Dr. David Bauer, AG Genomanalyse, IMB Jena, zur Verfügung gestellten Cosmid (cos3H10) durch Verdau mit NgoMI freigesetzt. Durch Insertion in die zu NgoMI kompatible AgeI-Restriktionsschnittstelle von pMV-BG.COS wurde die humane genomische Sequenz zwischen dem 5- ITR/PS und der Beta-Galaktosidase-Expressionskassette inseriert.
E.3. Sequenz des Vektors pMVX-BG(37808 Bp)

Claims (14)

1. Klonierungsvektor für die Herstellung von Adenoviralen Minimalviren, umfassend
  • - zwei mehr als 8 Bp lange invariable Erkennungssequenzen für eine Restriktionsendonuklease, die die beiden adenoviralen terminalen invertierten Replikationssequenzen (ITR, inverted terminal repeats) flankieren,
  • - eine Multiple Klonierungsstelle zur Insertion vor therapeutischen DNA-Fragmenten, in welche ggf. nichtkodierende chromosomale Säugetier-DNA einkloniert ist,
  • - eine Reportergenkassette,
  • - ein Verpackungssignal eines Bakteriophagen,
  • - zwei adenovirale terminale, invertierte Replikationssequenzer sowie ein adenovirales Verpackungssignal und
  • - ein bakterielles Plasmidrückgrat mit Replikationsursprung ung bakteriellem Resistenzgen.
2. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Erkennungssequenzen für die Meganuklease I-Sce I vorliegen.
3. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß chromosomale Säugetier-DNA-Fragmente mit einer Größe von 15 bis 35 Kb verwendet werden.
4. Klonierungsvektor nach Anspruch 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß Fragmente aus humaner chromosomaler DNA verwendet werden.
5. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, 3 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß ein Fragment aus humaner X-chromosomaler DNA mit mindestens 2 dualen Restriktionsschnittstellen verwendet wird.
6. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, 3, 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß eine konstitutiv exprimierte Beta- Galaktosidase-Reportergenkassette eingesetzt wird.
7. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine reguliert exprimierte Reportergenkassette eingesetzt wird.
8. Klonierungsvektor nach Anspruch 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß zur Regulation ein Promotor mit Tetracyclin- Operator eingesetzt wird.
9. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Reportergen verwendet wird, dessen Produkt in Zielorganismus nicht nachweisbar immunogen ist.
10. Klonierungsvektor nach Anspruch 1 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß ein Reportergen verwendet wird, das aus dem Genon des Organismus entstammt, in dem die vom Klonierungsvektor gebildeten Adenoviralen Minimalviren zur Anwendung kommen.
11. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, 9 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß als Reportergen die humane Placentale Alkalische Phosphatase verwendet wird.
12. Klonierungsvektor nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein cos-Signal aus dem Phagen Lambda verwendet wird.
13. Klonierungsvektor pMVX-BG aus 37808 Bp nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß E.3., die Bestandteil des Anspruchs ist.
14. Klonierungsvektor pMV gemäß Abb. 1, die Bestandteil des Anspruchs ist.
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