DE19648881A1

DE19648881A1 - Polymermembran mit in der Membran lokalisierten Enzymen sowie Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen ablaufender Reaktionen

Info

Publication number: DE19648881A1
Application number: DE19648881A
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Dr Hicke; Margot Becker; Dieter Prof Dr Paul; Lothar Prof Dr Willmitzer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; GKSS Forshungszentrum Geesthacht GmbH
Current assignee: GKSS Forshungszentrum Geesthacht GmbH
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1996-11-26
Publication date: 1998-06-04
Anticipated expiration: 2016-11-27
Also published as: DE19648881C2; EP0942966A1; WO1998023734A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Polymermembran, bei der in den Poren Enzyme für biokatalytische Zwecke lokalisiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Erzeug nissen mittels in Polymermembranen ablaufender Bioreaktionen.

Bioreaktionen in künstlichen Membranen sind schon seit längerer Zeit bekannt (DE-OS 44 20 086). Biokatalytische Prozesse werden in Polymermembranen lokalisiert, um die oftmals sehr kostspielig herzustellenden bzw. zu isolierenden Enzyme durch Immobilisierung innerhalb der Membran zur ständigen Wiederverwendung zum Beispiel zur Durchführung kontinuierlicher Prozesse zur Herstellung bestimmter Produkte verfügbar zu machen. Bisherige Enzymimmobilisatoren (Partikeln, Gele) dadurch aus, daß vor allem dort die Porendiffusion geschwindigkeitsbestimmend ist mit der Folge, daß einem schnellen Stofftransport Grenzen gesetzt sind und bei hohen Umsätzen eines Substrats der Abtransport von möglicherweise inhibierend wirkenden Produkten, bei spielsweise durch pH-Wert-Verschiebung, deutliche Grenzen gesetzt sind.

Bei einer bekannten Polymermembran, der sogenannten S-Schicht-UF-Membran von SLEYTR et. al, scheint es grundsätzlich möglich zu sein, auch große Membranflächen herstellen zu können, mit denen Biokatalysatoren der gattungsgemäßen Art aufgebaut werden können. Nachteilig bei dieser bekannten Membran ist, daß eine Variation des Porendurchmessers außerhalb eines Bereichs von 6 nm oder eine Variation der Porenform nicht möglich ist. Bei einer Immobilisierung von Enzymen innerhalb dieser Poren können die Poren leicht verstopfen mit der Folge, daß eine ausreichende Substratzugänglichkeit nicht mehr gesichert ist, das heißt, daß die Membran insgesamt unbrauchbar wird.

Bei einem anderen Membrantyp, der sogenannten Kernspur filtermembran, können zwar inzwischen schon sehr unter schiedliche Porendurchmesser mit einem Durchmesser < 30 nm ausgebildet werden. Die bei dieser Membran ausgebil dete zylindrische Kapillarform ist aber nicht veränder bar, so daß damit nur sehr eingeschränkt bei bestimmten Prozessen ein gewünschter konvektiver Stofftransport realisiert werden kann.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Polymermembran der eingangs genannten Art zu schaffen, sowie ein Verfahren zu schaffen, mit denen eine steuer bare, kontrollierte Biokatalyse in der Membran ermög licht wird, wobei eine ausreichende Substratzugänglich keit zu den in den Poren lokalisierten Enzymen gewähr leistet sein soll und das entstehende Produkt die Membran konvektiv passieren können so, wobei die Ver weilzeit für Substrat und Produkt in der Membran ein stellbar sein soll, um somit hohe Umsätze des Substrats und einen raschen Abtransport des gebildeten Produkts zu erreichen.

Gelöst wird die Aufgabe gemäß der erfindungsgemäßen Membran dadurch, daß die die Membran durchquerenden offenen Poren eine im wesentlichen im Querschnitt der Membran zylindrische bis konische Porenform aufweisen, wobei wenigstens die Porenlänge und/oder der Porenquer schnitt in Abhängigkeit von der Art eines der Membran zugeführten Substrats sowie des aus dem Substrat mittels der Enzyme gebildeten Produkts einstellbar ist.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Membran liegt im wesentlichen darin, daß durch die Ausbildung einer vorbestimmten Porenform in bezug auf den Querschnitt und die Länge der Poren, d. h. durch die geometrisch vorbe stimmbare Porenform in Abhängigkeit von der Art des Substrats und des Produkts ein optimaler konvektiver transmembraner Stofftransport realisiert werden kann, d. h. ein sogenannter Tortuositätsfaktor mit kleinem Betrag möglich ist, der bestimmend für einen konvektiven transmembranen Stofftransport ist. Anderenfalls würde, wie von partikulärer oder gelförmigen Enzymimmobilisaten bekannt, die Porendiffusion zunehmen, womit sich die Möglichkeiten einer kontrollierten Produktbildung verringern würden.

Zwar ließe sich die Forderung nach einem möglichst hohen Anteil des konvektiven Stofftransports durch einen zunehmenden mittleren Porendurchmesser erreichen, aber nur mit der nachteiligen Folge, daß immer mehr Sub stratmoleküle die Membran passieren würden, ohne mit den Enzymen, die an der Porenwand lokalisiert bzw. immobi lisiert sind, in Wechselwirkung treten zu können.

Bei der Ausbildung bzw. Herstellung von Polymermembranen sind verschiedene Möglichkeiten der Herstellung der Poren, wenn es sich um ausgesprochene Porenmembranen handelt, bekannt.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Polymermembran werden die Poren nach der eigentlichen Herstellung der Membran als solcher durch nachträgliche chemische und/oder physikalische Beeinflussung hergestellt, d. h. beispielsweise nach der Ausbildung bzw. Aushärtung des Polymerfilms durch Inkontaktbringen mit entsprechenden chemischen Mitteln.

Nicht nur die Poren als solche, sondern auch die Dichte der Poren kann dementsprechend nach der Herstellung der Membran als solcher durch chemische und/oder physika lische Beeinflussung eingestellt werden, wobei hierfür letztlich die Zeit und die Mittel zur Ausbildung der Poren bestimmende Parameter für die Porendichte in der Membran sind.

Wie eingangs erwähnt, sind die Porenlänge und die Porenform für das Verhalten der Membran als Bioreaktor bestimmend. Es hat sich gezeigt, daß bei makromolekula ren Produkten vorteilhafterweise nicht die zylindrische Porenform für die niedermolekularen Substrate die optimale Porenform ist, sondern eine solche Porenform, bei der vorzugsweise die zum Substrat gerichtete Öffnung der Poren kleiner als die produktausgangsseitige Öffnung der Poren ist.

Bei einem hochmolekularen Substrat und einem niedermo lekularen Produkt sind optimale Produktergebnisse dadurch erzielt worden, daß die zum Substrat gerichtete Öffnung der Poren größer als die produktausgangsseitige Öffnung der Poren ist.

Die Polymermembran selbst ist vorteilhafterweise nach Art einer Kernspurfiltermembran aufgebaut, die vorteil hafter eine einheitliche Porengrößenverteilung gewähr leistet, was für einen gleichmäßigen Transport des die Membran beaufschlagenden Substrats zu den in den Poren lokalisierten Enzymen hin von großer Wichtigkeit ist.

Die Kernspurfiltermembran kann vorteilhafterweise aus Polycarbonat oder aus Polyethylenterephthalat bestehen, die eine geometrisch sehr einheitliche, zylindrische Ausbildung der Kapillaren ermöglichen und zudem eine sehr enge Porengrößenverteilung.

Ebenfalls vorteilhaft ist es, die substratbeaufschlagte Seite der Membran mit einer Beschichtung zu versehen und sie ggf. zusätzlich einer Oberflächenmodifizierung zu unterziehen, was vorteilhafterweise dadurch geschehen kann, daß die Oberflächenmodifizierung durch Photopoly merisation oder durch photoinitiierte Pfropfpolymerisa tion mit Monomeren ausbildbar ist oder bei einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der Polymermembran durch Plasmapolymerisation oder durch plasmainitiierte Pfropf polymerisation mit Monomeren auszubilden. Als Monomer dient beispielsweise vorzugsweise Acrylsäure. Anstelle der auf diese Weise erzeugten Carboxylgruppen können auch andere für die Enzymbildung direkt oder indirekt geeignete funktionelle Gruppen wie z. B. vorzugsweise primäre Aminogruppen eingesetzt werden.

Schließlich ist es vorteilhaft, die Polymermembran einer hydrothermischen Nachbehandlung zu unterwerfen, wobei dabei die Zusammensetzung des Nachbehandlungsmediums und des pH-Wertes entweder zu einer alleinigen chemischen Oberflächenmodifizierung ohne Veränderung des Membran aufbaus oder aber auch zu reproduzierbarer asymme trischer Quellung bei einseitiger und kurzfristiger Beaufschlagung möglich ist.

Ein Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen der vorgenannten Art ablaufender Bioreaktionen ist dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Enzymbeladung in den Poren der Membran in Abhängig keit des Porendurchmessers und der Porenlänge derart eingestellt wird, daß die dabei erzielte Querdiffusion des die Poren durchquerenden Substrats zu den im we sentlichen im Seitenwandbereich der Poren angeordneten Enzymen ein einstellbarer Parameter der zu erzielenden gewünschten Kettenlänge des makromolekularen Erzeugnis ses ist.

Durch diese vorgeschlagenen Maßnahmen ist die Qualität des verfahrensmäßig hergestellten Erzeugnisses unmit telbar zu beeinflussen.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran einstellbar, und zwar durch die Porengröße und/oder Porenform und/oder die Porengrößen verteilung, wobei die Einstellbarkeit der Geschwindig keit ebenfalls ein weiterer einstellbarer Parameter für die zu erzielende gewünschte Kettenlänge und/oder Verzweigung des makromolekularen Erzeugnisses ist. Die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran ist wiederum gekoppelt an die Verweil zeit des Erzeugnisses in der Membran, wobei diese wiederum ein die Qualität des Erzeugnisses beeinflus sender Parameter ist.

Für eine optimale Funktion der erfindungsgemäßen Poly mermembran sind aber nicht nur die Form der Poren im Querschnitt sowie die Porenlänge maßgebend, vielmehr ist auch die Art der Überströmung der Polymermembran zur Ausbildung eines optimalen Stofftransports maßgebend. Es wurde gefunden, daß ein optimaler Stofftransport dadurch realisiert wird, daß das Substrat die Polymermembran tangential überströmt (Cross-Flow-Prozeßführung) mit der Folge, daß bei einer starken tangentialen Überströmung der Membranfläche sich keine prozeßbestimmende Konzen trationspolarisation ausbilden kann.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nach folgenden schematischen Zeichnungen anhand eines Aus führungsbeispieles im einzelnen beschrieben. Darin zeigen:

Fig. 1 im Schnitt eine Membran in stark vergrößerter und zu Darstellungszwecken vereinfachter Form, bei der die Poren mittels einer Beeinflussung durch ein Monomerplasma zur Ausbildung koni scher Porenformen beeinflußt werden,

Fig. 2 in Abhängigkeit von der Molekülgröße eines Substrats und eines Produkts drei Grundarten der Porenformen zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Prinzips,

Fig. 3 Poren ähnlich wie in Fig. 1, in die definierte Enzymmoleküle eingebaut sind, und

Fig. 4 im Schnitt eine Pore einer Membran, in der schematisch eine Querströmung des Substrats dargestellt ist, das mit den in der Pore lokalisierten Enzymen in funktioneller Wech selwirkung steht, wobei im zufuhrseitigen Bereich der Pore (schematisch) ein Oligomer entsteht und unter Bildung von Zwischenschrit ten in Richtung des substratseitigen Ausgangs der Pore Polymere in funktioneller Wechselwir kung mit den Enzymen entstehen, die dann als definiertes Erzeugnis ausgetragen werden.

Unter Bezugnahme auf die Fig. 2 wird der erfindungsgemä ße Zusammenhang dargestellt. Dort zeigt Fig. 2a mehrere ideale zylindrisch in der Polymermembran 10 ausgebildete Poren 11, wie sie beispielsweise an sich aus bekannten Kernspurfiltermembranen bekannt sind. Ein Substrat 15 und ein Produkt 16 haben annähernd gleichgroße Moleküle 19 (niedermolekulare Substanzen). In Fig. 2b ist eine trichter- bzw. konische Pore 11 dargestellt, bei der die Moleküle des Substrats 15 wesentlich größer als die Moleküle des Produkts 16 sind. Bei einer derartig ausgebildeten Pore 11 ist grundsätzlich ein Substratstau möglich.

Fig. 2c zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Polymermembran 10, bei der die Pore eine konische Struktur aufweist, mit der aus einem monomeren Substrat 15 ein polymeres Produkt 16 erfindungsgemäße herstellbar ist.

Fig. 3 zeigt die Polymermembran 10, wie sie bezüglich der erfindungsgemäß ausgebildeten Poren 11 zur Schaffung eines funktionierenden Bioreaktors möglich ist. An den Wänden der Poren 11 sind Enzyme 12 lokalisiert, wobei die Enzymbeladungsdichte dadurch einstellbar ist, daß die Poren 11 entweder a priori durch reaktive Membran polymere oder durch nachträgliche chemische oder physi kalische Modifizierung mit der gewünschten Dichte solcher Funktionalitäten ausgestattet sind, die eine kovalente Enzymbindung ermöglichen.

Bei einer Membran 10 gemäß Fig. 3 entspricht der Durch messer der Öffnung 18 der Poren 11 produktausgangsseitig dem Moleküldurchmesser des entstehenden Makromoleküls. In Fig. 3c ist der Durchmesser der Öffnung 18 produkt ausgangsseitig sehr viel größer als der Makromolekül durchmesser. Hier kann beispielsweise eine entstehende Substratquerströmung, die soweit wie möglich vermieden werden muß, durch den Einbau definierter Molekülverbände von Enzymen 12 verringert werden.

In Fig. 3a ist schließlich der produktseitige Durch messer der Öffnung 18 kleiner als der gewünschte Makro moleküldurchmesser. Es kommt je nach Substratkonzentra tion und Porenabmessung mehr oder weniger rasch zur Porenverstopfung, so daß nach entsprechender Anlaufphase solche Makromolekülfraktionen sich auf diese Weise selbst ausschließen. Somit kann es in den Poren 11, die einen etwa gleich großen Durchmesser wie das gewünschte Makromolekül haben, bei sehr hohen Substratmengen ebenfalls rasch zur Verstopfung kommen. Je nach Vertei lungsbreite der entstehenden Molekülfraktionen kann man entweder die enthaltenen Filtrate nochmals über die selbe Polymermembran 10 leiten oder man kombiniert mehrere Lagen von Membranen 10 unterschiedlicher erfin dungsgemäßer Porendurchmesser in einer entsprechenden Kaskade. In einer derartigen Kaskade von erfindungsge mäßen Membranen, bei denen der Abstand zwischen den Membranen 10 beispielsweise durch Distanzhalter defi niert ist, kann man gegebenenfalls nach vorheriger Fraktionierung des Filtrats eine entsprechende Beauf schlagung der einzelnen Membranen 10 vornehmen.

Zur Verhinderung eines sogenannten Foulings kann man entweder alle Substrate 15 unmittelbar vor der ersten biokatalytischen Membran keimfrei machen, z. B. durch den Einsatz einer Mikrofiltrationsmembran, oder durch entsprechende Modifizierung der Membranoberseite wie z. B. durch Ankopplung proteolytischer Enzyme einen ständigen Abbau von Keimablagerungen erreichen (Antifou ling).

Die erfindungsgemäße Polymermembran 10 kann grundsätz lich in Form von Flachmembranen aber auch Hohlfadenmem branen ausgebildet werden, wobei die Flachmembranen und die Hohlfadenmembranen als sogenannte Komposit-Membranen aufgebaut sein können. Mit der erfindungsgemäß vorge schlagenen Lösung sind Multienzymsysteme bzw. Koenzym bindungen realisierbar, wobei man von Gemischen ausgehen kann und die Enzyme statistisch verteilt koppeln kann, oder man kann sich unterschiedliche Bindungsaffinitäten zunutze machen und damit eine topochemische Reihenfolge oder Verteilung festlegen.

Auch schließt die erfindungsgemäße Polymermembran 10 die Möglichkeit der Einstellbarkeit kontrollierter Biokata lyseverteilungsgleichgewichte ein und man kann entweder im wäßrigen Medium Resynthesen durchführen oder im organischen Medium möglicherweise neue Produkte syn thetisieren.

Beispiel 1

Eine Polyester-Kernspurfiltermembran mit einem Kapil lardurchmesser d = 50 nm wurde mit einem durch Mikro wellenanregung hergestellten Acrylsäure-Niederdruckplas ma bei einem Acrylsäurepartialdruck von 1 Pa und einer Anregungsenergie von 250 W über 10 min behandelt.

Das Enzym Amylosucrase wurde mit Hilfe der Carbodiimid- Methode an die so beschichtete, carboxylgruppenhaltige Polyester-Kernspurfiltermembran kovalent gekoppelt.

Dazu wurden die Membranen zunächst mit einer 1%-igen, wäßrigen Lösung von N-Ethyl-N'-3-dimethyl -aminopropyl carbodiimid bei pH = 4,75 über 0,5 h aktiviert und danach sofort mit dem Enzym aus der 0,1%-igen Lösung in Phosphatpuffer bei pH = 7 und T = 25°C über 3 h bela den.

Aus einer 1%-igen Saccharose-Lösung wurde im transmem branen Durchfluß bei 40°C und einer Filtrationsge schwindigkeit v° = 3 ml/h cm² eine vorwiegend wasserlös liche (ca. 85%) und filmbildende Amylose erhalten.

Beispiel 2

Eine Polyester-Kernspurfiltermembran mit einem Kapil lardurchmesser d = 80 nm wurde in einer wäßrigen Lösung von 50 g/l Acrylsäure bei einer Anregungswellenlänge von 300 nm 60 min lang bestrahlt. Als Photoinitiator wurde Benzophenon verwendet. Das Enzym Amylosucrase wurde mit Hilfe der Carbodiimid-Methode an die so beschichtete, carboxylgruppenhaltige Polyester-Kernspurfiltermembran kovalent gekoppelt.

Dazu wurden die Membranen zunächst mit einer 1%-igen, wäßrigen Lösung von N-Ethyl-N'-3-dimethyl-aminopropyl carbodiimid bei pH = 4,75 über 0,5 h aktiviert und danach sofort mit dem Enzym aus der 0,1%-igen Lösung in Phosphatpuffer bei pH = 7 und T = 25°C über 4 h bela den.

Aus einer 1%-igen Saccharose-Lösung wurde im transmem branen Durchfluß bei 40°C und einer Filtrationsge schwindigkeit v° = 25 ml/h cm² eine vollständig wasser lösliche Amylose erhalten, die keine Filmbildungs eigenschaften aufwies.

Bezugszeichenliste

10

Polymermembran (Membran)

11

Pore

12

Enzym

13

Porenlänge

14

Porenquerschnitt

15

Substrat

16

Produkt (Polymer)

17

Öffnung (Substrat)

18

Öffnung (Produkt)

19

Molekül

20

Monomerplasma

21

Beschichtung

22

Oligomer

Claims

1. Polymermembran, bei der in den Poren Enzyme für biokatalytische Zwecke lokalisiert sind, gekennzeichnet durch die Membran (10) durchquerende offene Poren (11) mit im wesentlichen im Querschnitt der Membran zylin drischen bis konischen Poren (10) wenigstens die Poren länge (13) und/oder der Porenquerschnitt (16) in Abhän gigkeit von der Art- eines der Membran (10) zugeführten Substrats (15) sowie des aus dem Substrat (15) mittels der Enzyme (12) gebildeten Produkts (16) einstellbar ist.

2. Polymermembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß die Poren (11) im Zuge der Herstellung der Membran (10) hergestellt werden.

3. Polymermembran nach einem oder beiden der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren (11) nach der Herstellung der Membran (10) als solcher durch chemische und/oder physikalische Beeinflussung herge stellt werden.

4. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Poren (11) nach der Herstellung der Membran (10) als solcher durch chemische und/oder physikalische Beein flussung eingestellt wird.

5. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Substrat (15) gerichtete Öffnung (17) der Poren (11) kleiner als die produktausgangsseitige Öffnung (18) der Poren (11) ist.

6. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran nach Art einer Kernspurfiltermembran aufgebaut ist.

7. Polymermembran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, daß die Membran im wesentlichen aus Polycarbonat besteht.

8. Polymermembran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, daß die Membran im wesentlichen aus Polyethylen terephthalat besteht.

9. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die substratbe aufschlagte Seite der Membran mit einer Beschichtung versehen oder oberflächenmodifiziert ausgebildet ist.

10. Polymermembran nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung durch Photo polymerisation oder auch photoinitiierte Pfropfpo lymerisation mit Monomeren.

11. Polymermembran nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung durch Plas mapolymerisation oder durch plasmainitiierte Pfropfpo lymerisation ausbildbar ist.

12. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprü che 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomer Acrylsäure dient.

13. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprü che 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese einer hydrothermischen Nachbehandlung unterwerfbar sind.

14. Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen ablaufender Bioreaktionen nach einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Dichte der Enzymbeladung in den Poren der Membran in Abhängigkeit des Porendurchmessers und der Porenlänge derart eingestellt wird, daß die dabei erzielte Querdiffusion des die Poren durchquerenden Substrats zu den im wesentlichen im Seitenwandbereich der Poren angeordneten Enzymen ein einstellbarer Para meter der zu erzielen gewünschten Kettenlänge und/oder Verzweigungen des makromolekularen Erzeugnisses ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran einstellbar.

16. Verfahren nach einem oder beiden der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran zu fuhrseitig vom Substrat tangential überströmt wird.