WO2003057872A2 - Polymermembran und verfahren zu ihrer herstellung, bei der in den poren biomoleküle für bioaffine wechselwirkungen lokalisiert sind - Google Patents

Polymermembran und verfahren zu ihrer herstellung, bei der in den poren biomoleküle für bioaffine wechselwirkungen lokalisiert sind Download PDF

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Margot Becker
Walter Hilgendorff
Bernd Keil
Michael Schossig
Mathias Ulbricht
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Gkss-Forschungszentrum Geesthacht Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a polymer membrane in which biomolecules for bioaffine interactions are localized in the pores, the pores being essentially in the form of open channels crossing the membranes and the membrane being acted upon on the supply side with a solution which contains a substance or a Contains substance mixture, and on the output side consists of a mixture of the product modified by means of the biomolecules and possibly unchanged substance, and a method for their production.
  • a polymer membrane of this type is known (DE-OS 196 48 881). With this known membrane, a controllable, controlled biocatalysis is fundamental in the membrane. additionally possible, and at least sufficient substrate accessibility to the enzymes located in the pores is guaranteed.
  • this object is achieved in that means for generating a turbulent flow of the substance and / or the mixture of substance solution and product are provided in the pores.
  • the advantage of the solution according to the invention is that a significant stabilization of the activity of the immobilized biomolecules is possible, that is, the interaction forces between permeand and membrane polymer are strengthened or the contact of substrate molecules with active ligands, ie here the biomolecules, is facilitated or even made possible to any appreciable extent. If, as in the prior art, an essentially laminar flow is formed when the substrate flows through the pores, as before, this would have the consequence that a quiescent zone would be present on the pore wall, with the disadvantageous consequence that only a diffuse mass transfer could take place.
  • the solution according to the invention eliminates these quiet zones considerably, if not completely.
  • the agent is in the form of corpuscular elements which are contained in the substance solution supplied to the membrane itself.
  • This advantageously makes it possible, for example, to adapt the average size of the corpuscular elements directly to the substrate, to the membrane itself and to the type of biomolecules bound in the pores of the membrane. It is also possible with this configuration that To feed the membrane, for example, in succession with differently sized corpuscular elements, for example alternately and / or with increasing or decreasing size.
  • the agents are advantageously fundamentally chemically inert, i.e. do not participate in the interaction between the substance and the biomolecules. That in other words, that the chemically inert turbulence means, since they form a mechanical resistance for the substance solution, only cause the turbulent flow of the substance solution or the mixture of substance solution and the product produced in the pores due to physical reasons.
  • the reactive corpuscular elements from a chemically inert core and a chemically reactive envelope.
  • the entire surface of the pore wall can be cleverly enlarged, with the result that significantly more biomolecules per Volume can be bound on the surface, which can significantly and specifically increase the performance of the membrane.
  • the corpuscular elements which ensure the turbulent flow of the solution in the pores can have any suitable structure per se. However, it has proven to be advantageous to provide the corpuscular elements essentially with a spherical structure, the manufacture of which may be simpler in comparison to other structures.
  • the corpuscular elements can in principle consist of any suitable materials, and it has proven to be advantageous to form the corpuscular elements, for example from polystyrene (latex). This material exhibits good chemically inert behavior for the polymer membrane applications described here.
  • the chemically reactive corpuscular elements described above consist at least partially of polyglyceride etachryl at, but other chemically reactive materials are also conceivable.
  • the average diameter of the corpuscular elements is largely selected depending on the membrane-forming material, the substance solution, and the pore diameter and, if appropriate, also on the type of biomolecules to be embedded in the pore wall. It has been found to select the average diameter of the corpuscular elements preferably in the range from 50 to 1000 n depending on the predetermined pore diameter, with a quarter of the diameter of the average pore size being selected particularly advantageously. It should also be pointed out that the mean diameter of the corpuscular elements in the case of the chemically inert and chemically reactive corpuscular elements can be chosen to be the same or different.
  • the advantage of the solution of the method according to the invention is that a membrane produced in this way creates the precondition for the continuous bioaffine, for example biocatalytic, production processes of products being able to be designed much more economically than hitherto, i.e. can also be carried out on an industrial scale, for example for the production of medicaments, food additives which must have certain compatibility properties, and other products.
  • the process is advantageously further developed in that a mixture of chemically inert and chemically reactive corpuscular elements is used, wherein the density of the loading of the pore wall with chemically reactive corpuscular elements can also be set in a targeted manner on the basis of their predetermined, desired interaction with the material of the membranes in the pores.
  • the dwell time according to characteristic c. can be selected depending on the material of the membrane, the material of the corpuscular elements, the chemically reactive material of the corpuscular elements and also the mechanical dimensions of the membrane.
  • it has proven to be advantageous to provide the dwell time for example, in the range of 12 h, the temperature preferably being in the region of room temperature, so that no special measures have to be taken for the production with regard to temperature control of the storage process.
  • the process is completed by finally washing the membrane filled with the corpuscular elements with an aqueous solution, in order to remove all particles which are not firmly bound and in turn to achieve a high membrane permeability as it existed before loading .
  • the washing process can preferably be carried out with an aqueous solution, for example only with water without additives or with water and at least one surfactant, for example.
  • FIG. 1 schematically shows a starting substrate in the form of sucrose, which is produced by means of the membrane in inulin and glucose by an FTF-based biocatalytic conversion,
  • FIG. 2A shows a schematic section through a pore of the polymer membrane with the laminar flow of the substrate solution and the blocking of the enzyme by the product molecules formed as a starting situation
  • FIG. 3 shows a section through the membrane, taken with a scanning electron microscope, the corpuscular elements which are embedded in the pores in the form of latex balls,
  • 4 shows a graphical representation of the strongly increasing constipation behavior as a clear decrease in the flux of membranes not loaded with corpuscular elements in the form of nuclear trace membranes and cylindrical indent pores formed therein, depending on their diameter
  • 5 shows the result of an investigation of a flat model system of a pore-free film loaded with enzyme, to what extent the activity of the system changes as a function of the reaction time in a cross-flow cell 1 e at high overflow speed
  • FIG. 6 shows the result of an experiment with the membrane according to the invention in the form of a nuclear track membrane with a cylindrical capillary diameter of 1000 nm and the same flow rate of 320 11 / hhmm mmiandndd without corpuscular elements (latex balls),
  • FIG. 7 shows a diagram in which the dependence of the enzyme activity, measured for glucose and fructose, a membrane in the form of a nuclear track membrane with a cylinder pore diameter of 400 nm, on the pore walls of which the enzyme is directly bound, can be seen from the reaction time. Enzyme activity can no longer be recovered from higher flow rates, while at
  • FIG. 8 membrane according to the invention in the same scaled diagram according to Fig. 7, in which through the vortex generated by the corpuscular elements at the same initial speed of 32 1 / h significantly higher activity with higher initial effectiveness can be seen, which is due to a stronger enzyme loading , A higher flow rate can even increase the enzyme activity again.
  • FIG. 2A A polymer membrane 10, of which only a pore 11 or a channel 11 is shown in cross section, for example, is produced in a conventional manner, for example.
  • the polymer membrane 10 can be a so-called core track membrane with very uniform pores 11, for example in the form of continuous cylindrical channels.
  • Biomolecules in the form of enzymes 12 have previously been incorporated into the pores or channels 11 of the membrane 10, cf. also to this the DE-PS 196 48 881. After the biocatalytic reaction, the product 21 and the flowing through substrate or substance solution 15 in the form of a mixture 19 (permeand) emerges from the outlet 17 shown in the illustration of FIG. 2A below.
  • sucrose as substance 15 is first split into glucose 21a and an active fructosyl residue. Immediately afterwards, these fructosyl residues combine with their binding energy to form polyfructan 21 in a coupled reaction. If the enzyme 12 is covalently immobilized in the pores 11 of the polymer membrane 10, this reaction can be carried out continuously with a pressure-driven transmembrane passage of the substance 15.
  • FFF fructosyl transferase
  • the desired convective mass transfer can be significantly improved by adding corpuscular elements, here in the example in the form of polystyrene latex ball n (diameter d ⁇ : 100 nm) into the substrate solution 15.
  • corpuscular elements here in the example in the form of polystyrene latex ball n (diameter d ⁇ : 100 nm) into the substrate solution 15.
  • the effect which interferes with the formation of a laminar flow should also be used to fasten the corpuscular elements 20 to the pore wall 110 and, as it were, as baffles protruding into the flow of the substrate 15 or the substrate solution, cause the development of turbulence.
  • the larger specific surface area with the binding of the corpuscular elements 20 is intended to immobilize a larger amount of enzyme per unit area or volume (see FIG. 2B).
  • the balls (d ⁇ : 250 nm) are chemically inert, ie consist only of polystyrene, and 1 RT is a 2% latex solution, the balls of which consist of a polystyrene core and a chemically reactive jacket made of polyglycidi 1-metachrylate, the pores 11 of the polymer membrane 10 are filled and left for example 12 h at room temperature, for example.
  • a wash Procedure with water and a 0.1% surfactant solution was approximately measured again when determining the water permeability of the polymer membrane 10.
  • fructosyl transferase FTF inulin sucrase
  • the diagram according to FIG. 7 shows the dependence of the enzyme activity (measured for glucose and fructose) on a polymer membrane 10 designed as a nuclear trace membrane with cylindrical indented pores 11 with a diameter of D z : 400 nm, on the pore walls 110 of which the enzyme 12 was directly bound to recognize from the response time.
  • This polymer membrane 10 was selected for the comparison in order to be able to approximately take into account the pore distribution in the membrane according to the invention to 500 nm due to the bound latices with D z 250 nm.
  • the polymer membrane is irreversibly blocked at a flow rate v: 32 l / hm after a reaction time t> 70 min.
  • the polymer membrane 10 according to the invention in the same scaled diagram according to FIG. 9 shows, due to the flow vortices generated at the same initial speed v: 32 l / hm, a higher activity with a higher initial activity, which results from the greater enzyme loading. In contrast to the comparison membrane, the constipation is reversible. This means that with increasing

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Abstract

Es wird eine Polymermembran (10) vorgeschlagen, bei der in den Poren (11) Biomoleküle (12) für bioaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, wobei die Poren (11) im wesentlichen in Form von die Membran (10) durchquerenden offenen Kanälen ausgebildet sind, und wobei die Membran (10) zufuhrseitig (16) mit einer Lösung beaufschlagt wird, die eine Substanz oder ein Substanzgemisch enthält, und ausgangsseitig (17) aus einem Gemisch (19) von dem mittels der Biomoleküle (12) veränderten Produkt (21) und ggf. unveränderter Substanz (15) abgeführt wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Polymermembran (10). Dabei sind in den Poren (11) Mittel (20) zur Erzeugung einer turbulenten Strömung vorgesehen. Bei einer möglichen Art des Herstellungsverfahrens der Polymermembran (10) wird die der Membran (10) zugeführte Lösung mit korpuskularen Elementen (20) beladen, und anschliessend in die Poren (11) der Membran (10) geleitet. Anschliessend werden die korpuskularen Elemente (20) in den Poren (11) eine vorbestimmte Zeit bei vorbestimmbarer Temperatur zur Reaktion belassen. Schliesslich wird die Primärmembran (10) dann mit wenigstens einem Lösemittel gewaschen, so dass die in den Poren nicht haftenden korpuskularen Elemente (20) aus der Polymermembran (10) entfernt werden. Danach erfolgt die Bindung der Biomoleküle an die an der Porenwand haftenden korpuskularen Elemente.

Description

Polymermembran, bei der in den Poren Biomoleküle für bioaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung
Beschrei bunq
Die Erfindung betrifft eine Polymermembran, bei der in den Poren Biomoleküle für bioaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, wobei die Poren im wesentlichen in Form von die Membranen durchquerenden, offenen Kanälen ausgebildet sind und wobei die Membran zufuhrseitig mit einer Lösung beaufschlagt wird, die eine Substanz oder ein Substanzgemisch enthält, und ausgangsseitig aus einem Gemisch von dem mittels der Biomoleküle veränderten Produkt und ggf. unveränderter Substanz besteht, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Eine Polymermembran dieser Art ist bekannt (DE-OS 196 48 881). Mittels dieser bekannten Membran ist eine steuerbare, kontrollierte Biokatalyse in der Membran grund- sätzlich möglich, und es ist auch eine wenigstens ausreichende Substratzugängl ichkeit zu den in den Poren lokalisierten Enzymen gewährleistet.
Bei weiteren Untersuchungen der bekannten Membran und auch grundsätzlichen Untersuchungen auf diesem Gebiet ist herausgefunden worden, daß die Bildung der im folgenden besonders interessierenden makromolekularen Produktmoleküle nicht nur von der mittleren Porengröße der Membran und ihrer Porengrößenverteil ung, sondern ganz erheblich von den in der Pore vorliegenden Strömungsverhältnissen abhängen. Die Tortuosität des gesamten transmembranen Transportweges beeinflußt den Strömungswiderstand und damit die Prozeßleistung. Bei der Kombination von Stoffwandlung und Stofftrennung innerhalb des Porengefüges der gattungsgemäßen Membran, welche als Ensemble von Mi kroreaktoren betrachtet werden kann, ist herausgefunden worden, daß eine erhebliche Einflußgröße zusätzlich noch die Art der Strömungsverhältnisse 1n den Membranporen ist. Für eine effektive Durchführung von enzymati sehen Polymersynthesen Reaktionen in solchen Mi kroreaktoren ist ein schnellstmöglicher Abtransport des entstandenen Produktes von sehr großer Wichtigkeit.
Es wurde herausgefunden, daß es anderenfalls, wie z.B. bei nur diffusem Stofftransport durch die Poren, schnell zu einer Katalysatorvergiftung durch Produktinhibition kommen kann. Damit einhergehend ist der gravierende Nachteil, daß dadurch auch die mit der mittels der in die Membran eingelagerten Biomolekülen in Form von Enzymen verbundene enzy atische Wachstumsreaktion blockiert wird. Versuche zur enzymatischen Herstellung, beispielsweise zur Herstellung eines Polysaccharids, haben ergeben, daß geometrisch definierte, idealerweise durchgängige ausreichend große Poren, wie sie in Kernspurmembranen ausbildbar sind, vorzusehen sind, um eine Verstopfung zu vermeiden. Dennoch hat sich herausgestellt, daß nach viel zu kurzer Reaktionszeit keine Enzymaktivität mehr meßbar und damit die angestrebte kontinuierliche Prozeßführung in Frage gestellt ist.
Aus Modellversuchen konnte gefolgert werden, daß sich in den zyl inderförmigen Poren eine laminare Strömung ausbildet, so daß an der Porenwand, an der die Enzyme immobilisiert wurden, nur ein rein diffusiver Stofftransport möglich ist, der viel zu langsam ist und dadurch die Enzyme im Produkt "ersticken" läßt.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Membran der eingangs genannten Art derart zu verbessern und weiterzubilden, daß ein erforderlicher konvektiver Stofftransport wenigstens bis in die Nähe der immobilisierten Biomoleküle, beispielsweise in Form von Enzymen, die an den Porenwänden der Membran gebunden sind, ermöglicht wird, wobei die Membran dabei mit einfachen Mitteln, ausgehend von der gattungsgemäßen Membran, hergestellt werden kann und eine Verwendung der so hergestellten Membran für eine kontinuierliche Prozeßführung auch in technischem Maße möglich sein soll.
Diese Aufgabe wird gemäß der erfindungsgemäßen Polymermembran dadurch gelöst, daß in den Poren Mittel zur Erzeugung einer turbulenten Strömung der Substanz und/ oder des Gemisches von Substanzlösung und Produkt vorgesehen sind.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Lösung, betreffend die Polymermembran, ist der, daß eine signifikante Stabilisierung der Aktivität der immobilisierten Biomoleküle möglich ist, d.h., daß die Wechselwirkungskräfte zwischen Permeand und Membranpolymer verstärkt werden bzw. der Kontakt von Substratmolekülen zu aktiven Liganden, d.h. hier den Biomolekülen, erleichtert bzw. überhaupt in nennenswertem Umfang ermöglicht wird. Würde sich, wie im Stand der Technik, beim Durchströmen des Substrats durch die Poren, wie bisher, eine im wesentlichen laminare Strömung ausbilden, so hätte das zur Folge, daß an der Porenwand quasi eine Ruhezone vorhanden sein würde, mit der nachteiligen Folge, daß nur ein diffuser Stofftransport stattfinden könnte. Die erfindungsgemäße Lösung beseitigt diese Ruhezonen in erheblicher Weise, wenn nicht sogar vollständig.
Grundsätzlich ist es möglich, diese Mittel zur Erzeugung einer turbulenten Strömung des Substrats in den Poren auf beliebige, geeignete Weise auszubilden. So ist es beispielsweise denkbar und auch grundsätzlich möglich, die Porenwandung bei der Herstellung der Membran, selbst wenn diese die Membran auf dem kürzesten Weg durchqueren, strukturiert auszubilden, so daß beim Durchfließen des Substrats durch die Poren die Strukturen als Schikanen für die strömende Substratlösung wirken, mit der Folge, daß sich die angestrebte turbulente Strömung in den Poren ausbildet.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Membran ist das Mittel allerdings in Form korpuskularer Elemente ausgebildet, die in der Membran zugeführten Substanzlösung selbst enthalten sind. Dadurch ist es beispielsweise vorteilhafterweise möglich, die mittlere Größe der korpuskularen Elemente unmittelbar an das Substrat, an die Membran selbst und an die Art der in den Poren der Membran gebundenen Biomoleküle anzupassen. Auch ist es bei dieser Ausgestaltung möglich, die Membran beispielsweise nacheinander mit unterschiedlich großen korpuskularen Elementen zu beschicken, beispielsweise alternierend und/oder mit zunehmender bzw. abnehmender Größe.
Bei einer anderen sehr vorteilhaften Ausgestaltung der Membran, bei der die Mittel wiederum korpuskulare Elemente sind, werden diese an die Porenwand der Membran selbst angelagert und verbleiben dort fortwährend.
Vorteilhafterweise sind die Mittel grundsätzlich chemisch inert, d.h. nehmen an der Wechselwirkung zwischen Substanz und den Biomolekülen nicht teil. D.h. mit anderen Worten, daß die chemisch inerten Turbulenzmittel, da sie einen mechanischen Widerstand für die Substanzlösung bilden, ausschließlich physikalisch bedingt für die turbulente Strömung der Substanzlösung bzw. des Gemisches aus Substanzlösung und des in den Poren erzeugten Produkts sorgen.
Es hat sich aber auch als vorteilhaft erwiesen, turbulenzerzeugende Mittel aus einem Gemisch chemisch inerter und chemisch reaktiver korpuskularer Elemente auszubilden, so daß es beispielsweise möglich ist, daß bei geeigneter chemisch reaktiver Anpassung der korpuskularen Elemente an den Membranwerkstoff in den Poren die Anlagerung an die Porenwandungen ermöglicht bzw. verbessert wird.
Dabei ist es vorteilhaft, die reaktiven korpuskularen Elemente aus einem chemisch inerten Kern und einer chemisch reaktiven Umhüllung auszubilden. Mit der zusätzlichen chemisch reaktiven Umhüllung kann die gesamte Oberfläche der Porenwand geschickt vergrößert werden, mit der Folge, daß wesentlich mehr Biomoleküle pro Volumen auf der Oberfläche gebunden werden können, wodurch die Leistungsfähigkeit der Membran wesentlich und gezielt erhöht werden kann.
Die korpuskularen Elemente, die für die turbulente Strömung der Sustanzlösung in den Poren sorgen, können an sich eine beliebige geeignete Struktur aufweisen. Es hat sich dabei aber als vorteilhaft herausgestellt, die korpuskularen Elemente im wesentlichen mit einer kugelförmigen Struktur zu versehen, deren Herstellung im Vergleich zu anderen Strukturen ggf. einfacher ist.
Die korpuskularen Elemente können grundsätzlich aus beliebigen geeigneten Werkstoffen bestehen, wobei sich als vorteilhaft herausgestellt hat, die korpuskularen Elemente beispielsweise aus Polystyren (Latex) auszubilden. Dieser Werkstoff weist für die hier beschriebenen Anwendungszwecke der Polymermembran ein gutes chemisch inertes Verhalten auf.
Die oben beschriebenen chemisch reaktiven korpuskularen Elemente bestehen wenigstens teilweise aus Polyglycerid etachryl at, es sind aber auch andere chemisch reaktive Werkstoffe denkbar.
Der mittlere Durchmesser der korpuskularen Elemente wird weitgehend in Abhängigkeit des membranbildenden Werkstoffs, der Substanzlösung, sowie des Porendurchmessers und ggf. auch in Abhängigkeit der Art der in die Porenwand einzulagernden Biomoleküle gewählt. Es hat sich herausgestellt, den mittleren Durchmesser der korpuskularen Elemente vorzugsweise im Bereich von 50 bis 1000 n je nach vorgegebenem Porendurchmesser auszuwählen, wobei besonders vorteilhafterweise ein Viertel des Durchmessers der mittleren Porengröße ausgewählt wird. Es sei noch darauf hingewiesen, daß der mittlere Durchmesser der korpuskularen Elemente bei den chemisch inerten und chemisch reaktiven korpuskularen Elementen gleich oder unterschiedlich gewählt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Polymermembran ist dadurch gekennzeichnet, daß die der Membran zugeführte Substanzlösung
a. zunächst mit korpuskularen Elementen beladen wird,
b. anschließend in die Poren der Membran geleitet wird,
c. anschließend an den Orten gemäß Merkmal b. eine vorbestimmte Zeit bei vorbestimmter Temperatur belassen und
d. schließlich mit wenigstens einem Lösemittel gewaschen wird.
Der Vorteil der Lösung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß eine derart hergestellte Membran die Voraussetzung dafür schafft, daß kontinuierliche bioaffine, beispielsweise biokatalytische, Herstellungs- prozesse von Produkten sehr viel wirtschaftlicher gestaltet werden können als bisher, d.h. auch in technischem Maßstab durchführbar sind, beispielsweise zur Herstellung von Medikamenten, Lebensmittelzusatzstoffen, die bestimmte Verträglichkeitseigenschaften aufweisen müssen, und anderen Produkten.
Das Verfahren wird vorteilhafterweise dadurch weitergebildet, daß eine Mischung aus chemisch inerten und chemisch reaktiven korpuskularen Elementen verwendet wird, wobei die Dichte der Beladung der Porenwand mit chemisch reaktiven korpuskularen Elementen aufgrund ihrer vorbestimmten, gewollten Wechselwirkung gezielt mit dem Werkstoff der Membranen in den Poren auch eingestellt werden kann.
Die Verweilzeit gemäß Merkmal c. kann in Abhängigkeit des Werkstoffs der Membran, des Werkstoffs der korpuskularen Elemente, des chemisch reaktiven Werkstoffs der korpuskularen Elemente und auch der mechanischen Dimensionen der Membran gewählt werden. Es hat sich aber als vorteilhaft herausgestellt, die Verweilzeit beispielsweise im Bereich von 12 h vorzusehen, wobei die Temperatur dabei vorzugsweise im Bereich der Raumtemperatur liegt, so daß für die Herstellung keine besonderen Maßnahmen in bezug auf Temperierung des Einlagerungsvorganges getroffen werden müssen. Dieses schließt allerdings nicht aus, daß es für bestimmte Anwendungszwecke durchaus denkbar und möglich ist, die Temperierung auch im Bereich höherer Temperatur vorzusehen.
Das Verfahren wird, wie beschrieben, dadurch abgeschlossen, daß die mit den korpuskularen Elementen gefüllte Membran schließlich mit einer wässrigen Lösung ausgewaschen wird, um somit alle nicht fest gebundenen Partikel zu entfernen und wiederum eine hohe Membrandurchlässigkeit zu erreichen, wie sie vor der Beladung bestanden hat. Das Waschvorgang kann vorzugsweise mit einer wässrigen Lösung, beispielsweise nur mit Wasser ohne Zusätzen oder beispielsweise mit Wasser und wenigstens einem Tensid vorgenommen werden. Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden schematischen Zeichnungen anhand eines Ausführungsbeispieles beschrieben. Darin zeigen:
Fig. 1 schematisch ein Ausgangssubstrat in Form von Saccharose, das mittels der Membran in Inulin und Glucose durch eine FTF-gestützte biokata- lytische Umwandlung hergestellt wird,
Fig. 2A einen schematischen Schnitt durch eine Pore der Polymermembran mit dem laminaren Strömungsverlauf der Substratlösung und der Blockierung des Enzymes durch die entstandenen Produktmoleküle als Ausgangssituation,
Fig. 2B eine Erhöhung des Strömungsgradienten an den Enzymmolekülen durch Einbau von Partikeln an der Porenwand, die als Strömungsschikanen wirken und so einen schnellen Produktabtransport bewirken,
Fig. 3 einen Schnitt durch die Membran, aufgenommen mit einem Rasterelektronenmi roskop, die korpuskularen Elemente, die in den Poren in Form von Latexkugeln eingelagert sind,
Fig. 4 eine graphische Darstellung des stark zunehmenden Verstopfungsverhaltens als deutliche Abnahme des Fluxes von nicht mit korpuskularen Elementen beladener Membranen in Form von Kernspurmembranen und darin ausgebildeter zyl inderförmiger Poren in Abhängigkeit ihres Durchmessers, Fig. 5 das Ergebnis einer Untersuchung eines flächigen Modell Systems eines mit Enzym beladenen porenfreien Films, inwieweit sich bei hoher Überströmgeschwindigkeit in einer Cross-Fl ow-Zel 1 e die Aktivität des Systems in Abhängigkeit von der Reaktionszeit verändert,
Fig. 6 das Ergebnis eines Versuches mit der erfindungsgemäßen Membran in Form einer Kernspurmembran mit einem Zylinderkapillardurchmesser von 1000 nm und gleicher Durchströmung von 320 1 1//hhmm mmiitt uunndd oohhnnee zugeführte korpuskulare Elemente (Latexkugeln),
Fig. 7 ein Diagramm, bei dem die Abhängigkeit der Enzymaktivi ät, gemessen für Glucose und Fructo- se, einer Membran in Form einer Kernspurmembran mit Zylinderporendurchmesser von 400 nm, an deren Porenwänden das Enzym direkt gebunden ist, von der Reaktionszeit erkennbar ist. Die Enzymaktivität kann nicht mehr durch höhere DurchStrömungsgeschwindigkeit zurückerhalten werden, während bei der
Fig. 8 erfindungsgemäßen Membran in gleich skaliertem Diagramm gemäß Fig. 7, bei der durch die durch die korpuskularen Elemente erzeugten Strömungswirbel bei gleicher Anfangsgeschwindigkeit von 32 1/h deutlich länger eine höhere Aktivität bei höherer Anfangseffektivität ersichtlich ist, die durch eine stärkere Enzymbeladung bedingt ist. Durch eine höhere Durchströmungsgeschwindigkeit kann sogar die Enzymaktivität wieder erhöht werden. Zunächst wird Bezug genommen auf die Darstellung von Fig. 2A. Eine Polymermembran 10, von der hier beispielsweise lediglich eine Pore 11 bzw. ein Kanal 11 im Querschnitt dargestellt ist, wird beispielsweise auf übliche Weise hergestellt. Es kann sich im vorliegenden Falle bei der Polymermembran 10 um eine sogenannte Kernspurmembran mit sehr einheitlichen Poren 11, beispielsweise in Form von durchgängigen zylindrischen Kanälen, handeln. Bei der bestimmungsgemäßen Funktion der Membran 10 wird eine Substanz bzw. Substanzlösung 15 ei ngangssei tig 16 der Membran 10 zugeführt. In die Poren bzw. Kanäle 11 der Membran 10 sind zuvor Biomoleküle in Form von Enzymen 12 eingelagert worden, vgl. auch dazu die DE-PS 196 48 881. Aus dem in der Darstellung von Fig. 2A unten gezeigten Ausgang 17 tritt nach der biokatalytischen Reaktion das Produkt 21 und die hindurchfließende Substrat- bzw. Substanzlösung 15 in Form eines Gemisches 19 (Permeand) aus.
Bei der hier beispielhaft beschriebenen enzy ati sehen Reaktion mit einer Fructosyl transferase (FTF), vgl. Fig. 1 wird Saccharose als Substanz 15 zunächst in Glucose 21a und einen aktiven Fructosyl rest gespalten. Augenblicklich danach verbinden sich in einer gekoppelten Reaktion diese Fructosyl reste mit ihrer Bindungsenergie zum Polyfructan 21. Wird das Enzym 12 in den Poren 11 der Polymermembran 10 kovalent immobilisiert, so kann bei einer druckgetriebenen transmembranen Passage der Substanz 15 diese Reaktion kontinuierlich betrieben werden. Bei Verwendung z.B. von Inul insucrase (FTF) aus Streptokoccus utans entsteht auf diese Weise Inulin mit hoher Molmasse M, w,: 10...80 Mio Dalton bei einer sehr ger i ngen Po l yd i spers i t ät P : 1 , 1 . ( H i c ke et al . ) Bisher übliche integral-asymmetrische Membranen mit Poren unterschiedlicher Geometrie und Größe verstopfen sehr schnell. Es werden deshalb erfindungsgemäß als Polymermembranen 10 vorzugsweise sogenannte Kernspurmembranen mit sehr einheitlichen Poren in Form von durchgängigen Zylinderkanälen bzw. -kapillaren verwendet. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß erst bei einem Durchmesser der Poren 10 von 3000 nm, d.h. ohne Beladung von korpuskularen Elementen 20, kaum noch eine Verstopfung auftritt. Allerdings wurde schon nach 12 h nur noch eine geringe Enzymaktivität gemessen. Mit Hilfe eines flächigen Modellsyste s eines mit dem Enzym 12 beladenen porenfreien Films, vgl. Fig. 5, wurde untersucht, inwieweit sich bei hoher Überströmgeschwindigkeit in einer Cross-Flow-Zelle die Aktivität in Abhängigkeit von der Reaktionszeit verändert. Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß in jedem Einzelfall, auch bei dem Vergleich mit geringer Überströmung, die anhand der Glukosebildung gemessene Enzymaktivität über längere Zeiträume (insgesamt 440 h) erhalten bleibt. Allerdings ist nach 140 h nur noch wenig Inul inaktivität vorhanden, da sich das Glucose/ Fructose-Verhäl tnis auf nahezu 1 : 1 einstellt. Dieser Sachverhalt stützt die Annahme, daß in den Poren 11 nur deshalb so schnell keine Enzymaktivität mehr gefunden wird, weil sich an der Porenwand 110 eine Diffusionszone ausbildet, vgl. Fig. 2A, in der sich das Produkt 21 schneller bildet, als es herausdiffundieren kann, wodurch das Enzym 12 gleichsam "erstickt", vgl. dazu wiederum Fig. 2.
Gemäß der erfindungsgemäßen Polymermembran Fig. 2B läßt sich der gewünschte konvektive Stofftransport durch Zugabe von korpuskularen Elementen, hier im Beispiel in Form von Polystyren-Latexkugel n (Durchmesser dκ: 100 nm) in die Substratlösung 15 deutlich verbessern. Bei enzy bel adenen Membranen 10 in Form von Kernspurmembranen mit einem Zyl inderkapill ardurchmesser d7 : 1000
2 L nm und gleicher Durchströmung J : 320 1/hm ist bei einem Zusatz von korpuskularen Elementen 20 in Form von Polystyren-Latexkugeln nicht nur deutlich mehr Produkt 21 entstanden, sondern darüber hinaus auch ein sehr günstiges Gl ucose/Fructose-Verhäl tnis festzustellen. Der sehr geringe Fructosegehal t läßt einen hohen Anteil am Zielprodukt Inulin erwarten. Die korpuskularen Elemente 20 in Form von Latexkugeln erhalten vor Eintritt in den Eingang der Poren 11 einen Drall (Dean-Wirbel ) . Durch diese Rotationsgeschwindigkeit werden die korpuskularen Elemente 20 in Form von Latexkugeln aus der Laminarströmung herausbewegt und stoßen dann an die Porenwandung 110. Der Abprall bewirkt die Entstehung weiterer Turbulenzen und damit den gewünschten konvektiven Stofftransport. Gemäß der Erfindung sollte der die Ausbildung einer Laminarströmung störende Effekt ebenfalls dazu genutzt werden, die korpuskularen Elemente 20 an der Porenwandung 110 zu befestigen und gleichsam als in die Strömung des Substrats 15 bzw. der Substratlösung hineinragende Schikanen die Entstehung von Turbulenzen bewirken. Ferner soll durch die mit der Bindung der korpuskularen Elemente 20 größere spezifische Oberfläche eine größere Enzymmenge pro Flächen- bzw. Volumeneinheit immobilisiert werden (s. Fig. 2B).
Mit einem Gemisch z.B. aus 3 RT einer 2 %-igen Latexlösung, deren Kugeln (dκ : 250 nm) chemisch inert sind, d.h. nur aus Polystyren bestehen, und 1 RT eine 2 %-ige Latexlösung ist, deren Kugeln aus einem Polystyrenkern und einem chemisch reaktiven Mantel aus Polyglycidi 1- metachrylat aufgebaut sind, werden die Poren 11 der Polymermembran 10 gefüllt und beispielsweise 12 h bei z.B. Raumtemperatur stehen gelassen. Nach einer Wasch- Prozedur mit Wasser und einer 0,1 %-igen Tensidlösung wurde bei der Bestimmung der Wasserdurchlässigkeit der Polymermembran 10 annähernd wieder der Ausgangswert gemessen .
Die Immobilisierung der Fructosyl transferase FTF (Inu- linsucrase) erfolgt über 20 h bei Raumtemperatur und pH 7,2 an diese kovalent gebundenen korpuskularen Elemente 20 (Latices). Nach mehrmaligem Waschen mit Phosphat-Puffer pH 7,2 und Spülen mit Tensidlösung wurde die enzym- atische Reaktion genau wie oben mit 5 %-iger Saccharoselösung bei pH 7,2 und 28 "C durchgeführt. Das Ergebnis ist in den Fig. 7 und 8 dargestellt.
Aus dem Diagramm gemäß Fig. 7 ist die Abhängigkeit der Enzymaktivität (gemessen für Glucose und Fructose) einer als Kernspurmembran ausgebildeten Polymermembran 10 mit zyl inderförmigen Poren 11 mit einem Durchmesser von Dz : 400 nm, an deren Porenwandungen 110 das Enzym 12 direkt gebunden wurde, von der Reaktionszeit zu erkennen. Diese Polymermembran 10 wurde für den Vergleich ausgewählt, um die Porenverteilung bei der erfindungsgemäßen Membran auf 500 nm durch die gebundenen Latices mit Dz 250 nm annähernd berücksichtigen zu können. Die Polymermembran ist bei einer Durchströmgeschwindigkeit v : 32 1/hm nach einer Reaktionszeit t > 70 min irreversibel verstopft .
Die erfindungsgemäße Polymermembran 10 in gleich skaliertem Diagramm gemäß Fig. 9 zeigt durch die erzeugten Strömungswirbel bei gleicher Anfangsgeschwindigkeit v : 32 1/hm deutlich länger eine höhere Aktivität bei höherer Anfangsaktivität, die aus der stärkeren Enzymbeladung resultiert. Die Verstopfung ist, anders als bei der Vergleichsmembran, reversibel. Das heißt, daß mit zunehmender Über-
2 Strömgeschwindigkeit v : 320 und 1000 1/hm die Polymermembran 10 wieder freigespült wird, wobei die Aktivität gemessen an Glucose dabei dann ebenfalls wieder ansteigt.
Bezugszeichenl iste
10 Polymermembran
11 Pore / Kanal 110 Porenwandung
12 Biomolekül (Enzym)
13 Porenlänge
14 Porenquerschnitt
15 Substanzlösung / Substanz
16 Eingang
17 Ausgang 18
19 Gemisch (Produkt / Substanzlösung bzw. Substanz)
20 Mittel / korpuskulares Element
21 Produkt

Claims

Polymermembran, bei der in den Poren Biomoleküle für biokaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, und Verfahren zu ihrer HerstellungPatentansprüche
1. Polymerme brän, bei der in den Poren Biomoleküle für bioaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, wobei die Poren im wesentlichen in Form von die Membran durchquerenden, offenen Kanälen ausgebildet sind und wobei die Membran zufuhrseitig mit einer Lösung beaufschlagt wird, die eine Substanz oder ein Substanzgemisch enthält, und ausgangsseitig aus einem Gemisch von dem mittels der Biomoleküle veränderten Produkt und ggf. unveränderter Substanz besteht, dadurch gekennzeichnet, daß in den Poren (11) Mittel (20) zur Erzeugung einer turbulenten Strömung der Substanzlösung (15) und/oder des Gemisches (19) von Substanzlösung (15) und Produkt (21) vorgesehen sind.
2. Polymermembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (20) korpuskulare Elemente sind, die in der Membran (10) zugeführten Substanzlösung (15) enthalten sind.
3. Polymermembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (20) korpuskulare Elemente sind, die an die Porenwandungen (110) der Membran (10) angelagert si nd .
4. Polymermembran nach einem oder beiden der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (20) chemisch inert sind.
5. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche
1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (20) aus einem Gemisch chemisch inerter und chemisch reaktiver korpuskularer Elemente bestehen.
6. Polymermembran nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven korpuskularen Elemente aus einem chemisch inerten Kern und einer chemisch reaktiven Umhüllung bestehen.
7. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche
2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die korpuskularen Elemente eine im wesentlichen kugelförmige Struktur aufwei sen .
8. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die korpuskularen Elemente aus Polystyren (Latex) bestehen.
9. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch reaktiven korpuskularen Elemente wenigstens teilweise aus Polyglycidmetacryl at bestehen.
10. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Durchmesser der korpuskularen Elemente im Bereich von 50 bis 1000 nm liegt.
11. Polymermembran nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Durchmesser im Bereich von einem Viertel des Porendurchmessers der Membran liegt.
12. Verfahren zur Herstellung einer Polymermembran, bei der in den Poren Biomoleküle für bioaffine Wechselwirkungen lokalisiert sind, wobei die Poren im wesentlichen in Form von die Membran durchquerenden offenen Kanälen ausgebildet sind und wobei die Membran zufuhrseitig mit einer Lösung beaufschlagt wird, die eine Substanz oder ein Substanzgemisch enthält, und ausgangssei tig aus einem Gemisch von dem mittels der Biomoleküle veränderten Produkt und ggf. unveränderter Substanz besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die der Membran zugeführte Substanzl ösung
a. mit korpuskularen Elementen beladen wird,
b. anschließend in die Poren der Membran geleitet wird,
c. anschließend an den Orten gemäß Merkmal b. eine vorbestimmte Zeit bei vorbestimmter Temperatur belassen und
d. schließlich mit wenigstens einem Lösemittel gewaschen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zugeführte Lösung eine Mischung aus chemisch inerten und chemisch reaktiven korpuskularen Elementen enthält.
14. Verfahren nach einem oder beiden der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Verweilzeit im Bereich von 12 h liegt, wobei die Temperatur im Bereich der Raumtemperatur liegt.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösemittel ein Gemisch aus Wasser und wenigstens einem Tensid ist.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül direkt an die reaktive Oberfläche der korpuskularen Elemente kovalent gebunden wird.
dt
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