WO1998023734A1 - Polymermembran mit in der membran lokalisierten enzymen sowie verfahren zur herstellung von erzeugnissen mittels in polymermembranen ablaufender reaktionen - Google Patents

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WO1998023734A1
WO1998023734A1 PCT/DE1997/002736 DE9702736W WO9823734A1 WO 1998023734 A1 WO1998023734 A1 WO 1998023734A1 DE 9702736 W DE9702736 W DE 9702736W WO 9823734 A1 WO9823734 A1 WO 9823734A1
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membrane
pores
polymer
substrate
pore
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PCT/DE1997/002736
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Dieter Paul
Margot Becker
Annett Oechel
Alexander Papra
Heinz Nedelmann
Thomas Weigel
Mathias Ulbricht
Hans-Georg Hicke
Lothar Willmitzer
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Gkss-Forschungszentrum Geesthacht Gmbh
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
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    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds

Definitions

  • the invention relates to a polymer membrane in which enzymes for biocatalytic purposes are located in the pores, and to a process for the production of products by means of bioreactions occurring in polymer membranes.
  • Bioreactions in artificial membranes have been known for a long time (DE-OS 44 20 086).
  • Biocatalytic processes are localized in polymer membranes in order to make the enzymes, which are often very costly to produce or isolate, immobilized within the membrane for constant reuse, for example for carrying out continuous processes for the production of certain products.
  • Previous enzyme immobilisers particles, gels are distinguished by the fact that pore diffusion, in particular, is speed-determining there, with the result that there are limits to rapid mass transfer and, in the case of high conversions of a substrate, the removal of potentially inhibiting products, for example by pH shift, there are clear limits.
  • the so-called nuclear trace filter membrane very different pore diameters with a diameter> 30 nm can already be formed.
  • the cylindrical capillary shape formed with this membrane cannot be changed, so that a desired convective mass transfer can only be achieved to a very limited extent in certain processes.
  • the object according to the membrane according to the invention is achieved in that the open pores crossing the membrane have a substantially cylindrical to conical pore shape in cross-section of the membrane, at least the pore length and / or the pore cross-section depending on the type of substrate supplied to the membrane and of the product formed from the substrate by means of the enzymes is adjustable.
  • the advantage of the membrane according to the invention lies essentially in the fact that by forming a predetermined pore shape in relation to the cross section and the length of the pores, i.e. by the geometrically predeterminable pore shape depending on the type of substrate and the product, an optimal convective transme braner mass transfer can be realized, i.e. a so-called tortuosity factor with a small amount is possible, which is decisive for a convective transmembrane mass transfer. Otherwise, as is known from particulate or gel-like enzyme immobilized seeds, the preblend infusion would increase, which would reduce the possibilities of controlled product formation.
  • the pores are produced as such by subsequent chemical and / or physical influence after the actual manufacture of the membrane, i.e. for example, after the formation or curing of the polymer film by contact with appropriate chemical agents.
  • the density of the pores can accordingly be adjusted after the manufacture of the membrane as such by chemical and / or physical influencing, with the time and the means for forming the pores ultimately determining parameters for the pore density in this of the membrane.
  • the pore length and the pore shape determine the behavior of the membrane as a bioreactor. It has been shown that in macromolecular products it is advantageously not the cylindrical pore shape for the low molecular weight substrates that is the optimal pore shape, but such a pore shape in which the opening of the pores facing the substrate is preferably smaller than the opening of the pores on the product side.
  • the polymer membrane itself is advantageously constructed in the manner of a nuclear trace filter membrane, which advantageously ensures a uniform pore size distribution, which is of great importance for a uniform transport of the substrate acting on the membrane to the enzymes located in the pores.
  • the core track filter membrane can advantageously consist of polycarbonate or of polyethylene enterephthalate, which enable a geometrically very uniform, cylindrical formation of the capillaries and also a very narrow pore size distribution.
  • the substrate-loaded side of the membrane with a coating and, if necessary, also to subject it to a surface modification, which can advantageously be done by the surface modification being capable of being formed with monomers by photopolymerization or by photo-initiated graft polymerisation or in the case of one another advantageous embodiment of the polymer membrane by plasma polymerization or by plasma-initiated graft polymerization with monomers.
  • Acrylic acid is preferably used as the monomer, for example.
  • other functional groups which are directly or indirectly suitable for enzyme formation such as e.g. preferably primary amino groups are used.
  • the composition of the aftertreatment medium and the pH either being a sole chemical surface modification without changing the membrane structure or else being reproducible asymmetrical swelling is possible with one-sided and short-term exposure.
  • a process for the production of products by means of bioreactions taking place in polymer membranes of the aforementioned type is characterized in that the density of the enzyme charge in the pores of the membrane is adjusted as a function of the pore diameter and the pore length in such a way that the transverse diffusion of the substrate crossing the pores is increased the enzymes arranged essentially in the side wall region of the pores is an adjustable parameter of the desired chain length of the macromolecular product to be achieved.
  • the rate at which the product is discharged from the pores of the membrane can be adjusted, specifically by means of the pore size and / or pore shape and / or the pore size distribution, the adjustability of the rate also being a further adjustable parameter for the achieving desired chain length and / or branching of the macromolecular product.
  • the rate at which the product is discharged from the pores of the membrane is in turn linked to the residence time of the product in the membrane, which in turn is a parameter influencing the quality of the product.
  • the polymer membrane according to the invention it is not only the shape of the pores in the The cross-section and the pore length are decisive, rather the type of overflow of the polymer membrane is decisive for the formation of an optimal mass transfer. It has been found that an optimal mass transfer is achieved by the substrate flowing tangentially over the polymer membrane (cross-flow process control), with the result that no process-determining concentration polarization can develop when there is a strong tangential flow over the membrane surface.
  • FIG. 1 is a sectional view of a membrane in a greatly enlarged and simplified form for illustration purposes, in which the pores are influenced by the formation of a monomer pl as a to form conical pore shapes,
  • Fig. 4 in section a pore of a membrane, in which a cross flow of the substrate is schematically shown, which interacts with the enzymes localized in the pore in function onel 1 he interaction, wherein in the supply area of the pore (schematically) an oligomer arises and with the formation of intermediate steps in the direction of the substrate-side output of the pore polymers in function onel 1 he interaction with the enzymes, which are then discharged as a defined product, and
  • FIG. 2 a there shows several ideal pores 11 which are cylindrical in the polymer membrane 10, as are known, for example, from known nuclear trace filter membranes.
  • a substrate 15 and a product 16 have approximately the same size molecules 19 (low molecular weight substances).
  • a funnel or conical pore 11 is shown in FIG. 2 b, in which the molecules of the substrate 15 are substantially larger than the molecules of the product 16. In the case of a pore 11 of this type, a substrate jam is fundamentally possible.
  • 2 c shows the structure of a polymer membrane 10 according to the invention in which the pore has a conical structure with which a polymeric product 16 according to the invention can be produced from a monomeric substrate 15.
  • FIG. 3 shows the polymer membrane 10 as it is possible with regard to the pores 11 designed according to the invention to create a functioning bioreactor.
  • the Enzymes 12 are localized on the walls of the pores 11, the enzyme loading density being adjustable in that the pores 11 are equipped either a priori with reactive membrane polymers or with subsequent chemical or physical modification with the desired density of such functionalities which enable covalent enzyme binding.
  • the diameter of the opening 18 of the pores 11 corresponds to the product diameter of the resulting macromolecule.
  • the diameter of the opening 18 on the product outlet side is very much larger than the macromolecule diameter.
  • an emerging substrate cross flow which must be avoided as far as possible, can be reduced by the incorporation of defined molecular associations of enzymes 12.
  • the product diameter of the opening 18 is smaller than the desired macromolecule diameter.
  • pore clogging occurs more or less quickly, so that after a corresponding start-up phase, such macromolecular fractions are mutually exclusive in this way.
  • the pores 11, which have a diameter approximately the same size as the desired macromolecule clogging can also quickly occur with very large amounts of substrate.
  • the distance between the Membranes 10 is defined, for example, by spacers, one can optionally apply a corresponding action to the individual membranes 10 after prior filtration of the filtrate.
  • the polymer membrane 10 according to the invention can in principle be designed in the form of flat membranes but also hollow fiber membranes, wherein the flat membranes and the hollow thread membranes can be constructed as so-called composite membranes.
  • multi-enzyme systems or coenzyme bindings can be realized, it being possible to start from mixtures and to couple the enzymes in a statistically distributed manner, or to use different binding affinities and thus to determine a topochemical sequence or distribution.
  • the polymer membrane 10 according to the invention also includes the possibility of adjusting controllable biocatalysis distribution equilibrium and one can either carry out resynthesis in the aqueous medium or possibly synthesize new products in the organic medium.
  • Argon flow rate from 100 to 1000 sccm, preferably 500 sccm; additionally oxygen flow rate from 50 to 500 sccm, preferably no oxygen;
  • Argon flow rate from 100 to 500 sccm, preferably 500 sccm;
  • Acrylic acid flow rate from 30 to 200 sccm, preferably 50 sccm;
  • Example 1 Pulse frequency of 500 to 10,000 Hz, preferably 10,000 Hz; Duty cycle of 30 to 70%, preferably 50%.
  • a polyester core trace filter membrane with a capillary diameter d 100 nm was coated with an acrylic acid sculpturepolymer layer after 5 min of cleaning in ethanol by means of a non-equilibrium plasma polymerisation system using the remote method.
  • the membrane was exposed for 5 s at a process pressure of 30 Pa, an argon flow rate of 500 sccm and a continuous microwave field with an output of
  • the enzyme inulin insucrase was covalently coupled to the carboxyl group-containing polyester core trace filter membrane coated in this way.
  • the initial water permeability of J Q 2400 1 / hm bar decreased due to the plasma treatment
  • M 10,000 kDa obtained. A continuous process was possible, the membrane did not become blocked.
  • Polypropylene and membrane coatings (MFM) with a sponge structure, symmetrical pore size distribution and average effective pore diameters (dp Q ) of 100, 200 and 450 nm were formed by photoinitiated heterogeneous graft copolymers of carboxyl and ami no-acrylic data on the entire surface functional i si ert.
  • the membranes were first coated from a methanolic solution (0.01 ... 0.2 mol / 1) with the photoinitiator benzophenone (BP) for 1 ... 16 h. Subsequently, the membranes in aqueous, with BP saturated solutions of acrylic acid (AA; 5 ... 100 g / 1) or 2-amino methyl methacrylate (A EMA, 10 ... 50 g / 1) with a UV light Irradiated excitation wavelength of ⁇ > 300 nm or 290 nm> ⁇ > 320 nm between 15 and 120 min. The membranes were then extracted thoroughly with water, possibly also with methanol. In this way, the functional level (DG) between 0 and
  • Polyester core trace filter membrane with capillary diameters (dp Q ) between 30 and 3000 nm were functionalized on the entire surface by photoinitiated heterogeneous graft copolymers of carboxyl or amino acrylates.
  • the membranes were first coated from a methanolic solution (0.1 mol / 1) with the photoinitiator benzophenone. Then the membranes in aqueous solutions saturated with benzophenone from
  • Acrylic acid (AA; 5 ... 100 g / 1) or 2-aminoethyl ethacrylate (AmEMA, 10 ... 50 g / 1) with UV light
  • the functionalization level could be varied between 0 and 100 ⁇ g / cm.
  • graft tentacles particularly significant changes in the effective pore diameter - with consequence for the membrane permeability - 1 i tat - are achieved for medium degrees of functionalization and depending on the pH value .
  • the enzyme inulin sucrase (FTF) was covalently coupled to carboxyl group-containing membranes using the carbodiimide method.
  • the enzyme inulin sucrase was covalently coupled to membranes containing amino groups by means of glutaral dehyde.

Abstract

Es wird eine Polymermembran (10), bei der in den Poren Enzyme für biokatalytische Zwecke lokalisiert sind, vorgeschlagen. Die Polymermembran (10) wird durch die Membran (10) durchquerende offene Poren (11) mit im wesentlichen im Querschnitt der Membran (10) zylindrischen bis konischen Poren (10) gebildet, wobei wenigstens die Porenlänge (13) und/oder der Porenquerschnitt (16) in Abhängigkeit von der Art eines der Membran (10) zugeführten Substrats (15) sowie des aus dem Substrat (15) mittels der Enzyme (12) gebildeten Produkts (16) einstellbar ist auch wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die Dichte der Enzymbeladung in den Poren der Membran in Abhängigkeit des Porendurchmessers und der Porenlänge derart eingesellt wird, daß die dabei erreichte Querdiffusion des die Poren durchquerenden Substrats zu den im wesentlichen ein Seitenwandbereich der Poren angeordneten Enzymen ein einstellbarer Parameter der zur erzielen gewünschten Kettenlänge und/oder Verzweigung des makromolekularen Erzeugnisses ist.

Description

Polymermembran mit in der Membran lokalisierten Enzymen sowie Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen ablaufender Reaktionen
Beschrei bung
Die Erfindung betrifft eine Polymermembran, bei der in den Poren Enzyme für bi okatalyti sehe Zwecke lokalisiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen ablaufender Bioreak- ti onen .
Bioreaktionen in künstlichen Membranen sind schon seit längerer Zeit bekannt (DE-OS 44 20 086). Biokatalyti sehe Prozesse werden in Polymermembranen lokalisiert, um die oftmals sehr kostspielig herzustellenden bzw. zu isolierenden Enzyme durch Immobilisierung innerhalb der Membran zur ständigen Wiederverwendung zum Beispiel zur Durchführung kontinuierlicher Prozesse zur Herstellung bestimmter Produkte verfügbar zu machen. Bisherige Enzymimmobi 1 i satoren (Partikeln, Gele) zeichnen sich dadurch aus, daß vor allem dort die Porendiffusion geschwindigkeitsbestimmend ist mit der Folge, daß einem schnellen Stofftransport Grenzen gesetzt sind und bei hohen Umsätzen eines Substrats der Abtransport von möglicherweise inhibierend wirkenden Produkten, beispielsweise durch pH-Wert-Verschiebung, deutliche Grenzen gesetzt sind.
Bei einer bekannten Polymermembran, der sogenannten S-Schicht-UF-Membran von SLEYTR et. al , scheint es grundsätzlich möglich zu sein, auch große Membranflächen herstellen zu können, mit denen Biokatalysatoren der gattungsgemäßen Art aufgebaut werden können. Nachteilig bei dieser bekannten Membran ist, daß eine Variation des Porendurchmessers außerhalb eines Bereichs von 6 nm oder eine Variation der Porenform nicht möglich ist. Bei einer Immobilisierung von Enzymen innerhalb dieser Poren können die Poren leicht verstopfen mit der Folge, daß eine ausreichende Substratzugängl i chkei t nicht mehr gesichert ist, das heißt, daß die Membran insgesamt unbrauchbar wird.
Bei einem anderen Membrantyp, der sogenannten Kernspurfiltermembran, können zwar inzwischen schon sehr unterschiedliche Porendurchmesser mit einem Durchmesser > 30 nm ausgebildet werden. Die bei dieser Membran ausgebildete zylindrische Kapillarform ist aber nicht veränderbar, so daß damit nur sehr eingeschränkt bei bestimmten Prozessen ein gewünschter konvektiver Stofftransport realisiert werden kann.
Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Polymermembran der eingangs genannten Art zu schaffen, sowie ein Verfahren zu schaffen, mit denen eine steuerbare, kontrollierte Biokatalyse in der Membran ermöglicht wird, wobei eine ausreichende Substratzugängl ich- keit zu den in den Poren lokalisierten Enzymen gewährleistet sein soll und das entstehende Produkt die Membran konvektiv passieren können so, wobei die Verweilzeit für Substrat und Produkt in der Membran einstellbar sein soll, um somit hohe Umsätze des Substrats und einen raschen Abtransport des gebildeten Produkts zu errei chen . Gelöst wird die Aufgabe gemäß der erfindungsgemäßen Membran dadurch, daß die die Membran durchquerenden offenen Poren eine im wesentlichen im Querschnitt der Membran zylindrische bis konische Porenform aufweisen, wobei wenigstens die Porenlänge und/oder der Porenquerschnitt in Abhängigkeit von der Art eines der Membran zugeführten Substrats sowie des aus dem Substrat mittels der Enzyme gebildeten Produkts einstellbar ist.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Membran liegt im wesentlichen darin, daß durch die Ausbildung einer vorbestimmten Porenform in bezug auf den Querschnitt und die Länge der Poren, d.h. durch die geometrisch vorbestimmbare Porenform in Abhängigkeit von der Art des Substrats und des Produkts ein optimaler konvektiver transme braner Stofftransport realisiert werden kann, d.h. ein sogenannter Tortuosi tätsfaktor mit kleinem Betrag möglich ist, der bestimmend für einen konvektiven transmembranen Stofftransport ist. Anderenfalls würde, wie von partikulären oder gelförmigen Enzymimmobi 1 i säten bekannt, die Pcrendi ffusion zunehmen, womit sich die Möglichkeiten einer kontrollierten Produktbildung verringern würden.
Zwar ließe sich die Forderung nach einem möglichst hohen Anteil des konvektiven Stofftransports durch einen zunehmenden mittleren Porendurchmesser erreichen, aber nur mit der nachteiligen Folge, daß immer mehr Substratmoleküle die Membran passieren würden, ohne mit den Enzymen, die an der Porenwand lokalisiert bzw. immobilisiert sind, in Wechselwirkung treten zu können.
Bei der Ausbildung bzw. Herstellung von Polymermembranen sind verschiedene Möglichkeiten der Herstellung der Poren, wenn es sich um ausgesprochene Porenmembranen handelt, bekannt.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Polymermembran werden die Poren nach der eigentlichen Herstellung der Membran als solcher durch nachträgliche chemische und/oder physikalische Beeinflussung hergestellt, d.h. beispielsweise nach der Ausbildung bzw. Aushärtung des Polymerfilms durch Inkontaktbri ngen mit entsprechenden chemischen Mitteln.
Nicht nur die Poren als solche, sondern auch die Dichte der Poren kann dementsprechend nach der Herstellung der Membran als solcher durch chemische und/oder physikalische Beeinflussung eingestellt werden, wobei hierfür letztlich die Zeit und die Mittel zur Ausbildung der Poren bestimmende Parameter für die Porendichte in der Membran sind.
Wie eingangs erwähnt, sind die Porenlänge und die Porenform für das Verhalten der Membran als Bioreaktor bestimmend. Es hat sich gezeigt, daß bei makromolekularen Produkten vorteilhafterweise nicht die zylindrische Porenform für die niedermolekularen Substrate die optimale Porenform ist, sondern eine solche Porenform, bei der vorzugsweise die zum Substrat gerichtete Öffnung der Poren kleiner als die produktausgangssei ti ge Öffnung der Poren ist.
Bei einem hochmolekularen Substrat und einem niedermolekularen Produkt sind optimale Produktergebnisse dadurch erzielt worden, daß die zum Substrat gerichtete Öffnung der Poren größer als die produktausgangssei tige Öffnung der Poren ist. Die Polymermembran selbst ist vorteilhafterweise nach Art einer Kernspurfiltermembran aufgebaut, die vorteilhafter eine einheitliche Porengrößenvertei 1 ung gewährleistet, was für einen gleichmäßigen Transport des die Membran beaufschlagenden Substrats zu den in den Poren lokalisierten Enzymen hin von großer Wichtigkeit ist.
Die Kernspurfiltermembran kann vorteilhafterweise aus Polycarbonat oder aus Polyethyl enterephthal at bestehen, die eine geometrisch sehr einheitliche, zylindrische Ausbildung der Kapillaren ermöglichen und zudem eine sehr enge Porengrößenvertei 1 ung .
Ebenfalls vorteilhaft ist es, die substratbeaufschlagte Seite der Membran mit einer Beschichtung zu versehen und sie ggf. zusätzlich einer Oberflächenmodifizierung zu unterziehen, was vorteilhafterweise dadurch geschehen kann, daß die Oberflächenmodifizierung durch Photopolymerisation oder durch photoinitiierte Pfropfpolymeri sa- tion mit Monomeren ausbildbar ist oder bei einer anderen vorteilhaften Ausgestaltung der Polymermembran durch Plasmapolymerisation oder durch plasmainitiierte Pfropfpolymerisation mit Monomeren auszubilden. Als Monomer dient beispielsweise vorzugsweise Acrylsäure. Anstelle der auf diese Weise erzeugten Carboxylgruppen können auch andere für die Enzymbildung direkt oder indirekt geeignete funktionelle Gruppen wie z.B. vorzugsweise primäre Aminogruppen eingesetzt werden.
Schließlich ist es vorteilhaft, die Polymermembran einer hydrothermi sehen Nachbehandlung zu unterwerfen, wobei dabei die Zusammensetzung des Nachbehandlungsmediums und des pH-Wertes entweder zu einer alleinigen chemischen Oberflächenmodifizierung ohne Veränderung des Membranaufbaus oder aber auch zu reproduzierbarer asymmetrischer Quellung bei einseitiger und kurzfristiger Beaufschlagung möglich ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen der vorgenannten Art ablaufender Bioreaktionen ist dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Enzymbeladung in den Poren der Membran in Abhängigkeit des Porendurchmessers und der Porenlänge derart eingestellt wird, daß die dabei erzielte Querdiffusion des die Poren durchquerenden Substrats zu den im wesentlichen im Seitenwandbereich der Poren angeordneten Enzymen ein einstellbarer Parameter der zu erzielenden gewünschten Kettenlänge des makromolekularen Erzeugnisses ist.
Durch diese vorgeschlagenen Maßnahmen ist die Qualität des verfahrensmäßig hergestellten Erzeugnisses unmittelbar zu beeinflussen.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran einstellbar, und zwar durch die Porengröße und/oder Porenform und/oder die Porengrößen- verteilung, wobei die Einstellbarkeit der Geschwindigkeit ebenfalls ein weiterer einstellbarer Parameter für die zu erzielende gewünschte Kettenlänge und/oder Verzweigung des makromolekularen Erzeugnisses ist. Die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran ist wiederum gekoppelt an die Verweilzeit des Erzeugnisses in der Membran, wobei diese wiederum ein die Qualität des Erzeugnisses beeinflussender Parameter ist.
Für eine optimale Funktion der erfindungsgemäßen Polymermembran sind aber nicht nur die Form der Poren im Querschnitt sowie die Porenlänge maßgebend, vielmehr ist auch die Art der Überströmung der Polymermembran zur Ausbildung eines optimalen Stofftransports maßgebend. Es wurde gefunden, daß ein optimaler Stofftransport dadurch realisiert wird, daß das Substrat die Polymermembran tangential überströmt (Cross-Fl ow-Prozeßführung) mit der Folge, daß bei einer starken tangentialen Überströmung der Membranfläche sich keine prozeßbestimmende Konzentrationspolarisation ausbilden kann.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden schematischen Zeichnungen anhand eines Ausführungsbeispieles im einzelnen beschrieben. Darin zeigen:
Fig. 1 im Schnitt eine Membran in stark vergrößerter und zu Darstellungszwecken vereinfachter Form, bei der die Poren mittels einer Beeinflussung durch ein Monomerpl as a zur Ausbildung konischer Porenformen beeinflußt werden,
Fig. 2 in Abhängigkeit von der Molekülgröße eines Substrats und eines Produkts drei Grundarten der Porenformen zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Prinzips,
Fig. 3 Poren ähnlich wie in Fig. 1, in die definierte Enzymmoleküle eingebaut sind,
Fig. 4 im Schnitt eine Pore einer Membran, in der schematisch eine Querströmung des Substrats dargestellt ist, das mit den in der Pore lokalisierten Enzymen in funkti onel 1 er Wechselwirkung steht, wobei im zufuhrsei ti gen Bereich der Pore (schematisch) ein Oligomer entsteht und unter Bildung von Zwischenschritten in Richtung des substratsei tigen Ausgangs der Pore Polymere in funkti onel 1 er Wechselwirkung mit den Enzymen entstehen, die dann als definiertes Erzeugnis ausgetragen werden, und
Fig. 5 das Intensitätsverhältnis charakteristischer IR-Absorptionsbanden aus ATR-Spektren für die belichtete Oberseite (d = 0) und die nicht direkt belichtete Unterseite (d = 120 μm) von mit Pfropfpolyacryl säure funkti onal i si erten PP-MFM (dpQ = 200 nm) .
Unter Bezugnahme auf die Fig. 2 wird der erfindungsgemäße Zusammenhang dargestellt. Dort zeigt Fig. 2 a mehrere ideale zylindrisch in der Polymermembran 10 ausgebildete Poren 11, wie sie beispielsweise an sich aus bekannten Kernspurfiltermembranen bekannt sind. Ein Substrat 15 und ein Produkt 16 haben annähernd gleichgroße Moleküle 19 (niedermolekulare Substanzen). In Fig. 2 b ist eine trichter- bzw. konische Pore 11 dargestellt, bei der die Moleküle des Substrats 15 wesentlich größer als die Moleküle des Produkts 16 sind. Bei einer derartig ausgebildeten Pore 11 ist grundsätzlich ein Substratstau mögl ich .
Fig. 2 c zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Polymermembran 10, bei der die Pore eine konische Struktur aufweist, mit der aus einem monomeren Substrat 15 ein polymeres Produkt 16 erfindungsgemäße herstellbar i st.
Fig. 3 zeigt die Polymermembran 10, wie sie bezüglich der erfindungsgemäß ausgebildeten Poren 11 zur Schaffung eines funktionierenden Bioreaktors möglich ist. An den Wänden der Poren 11 sind Enzyme 12 lokalisiert, wobei die Enzymbeladungsdichte dadurch einstellbar ist, daß die Poren 11 entweder a priori durch reaktive Membranpolymere oder durch nachträgliche chemische oder physikalische Modifizierung mit der gewünschten Dichte solcher Funktionalitäten ausgestattet sind, die eine kovalente Enzymbindung ermöglichen.
Bei einer Membran 10 gemäß Fig. 3 entspricht der Durchmesser der Öffnung 18 der Poren 11 produktausgangssei i g dem Mol ekül durchmesser des entstehenden Makromoleküls. In Fig. 3 c ist der Durchmesser der Öffnung 18 produktausgangssei tig sehr viel größer als der Makromol ekül - durchmesser. Hier kann beispielsweise eine entstehende Substratquerströmung, die soweit wie möglich vermieden werden muß, durch den Einbau definierter Mol ekül verbände von Enzymen 12 verringert werden.
In Fig. 3 a ist schließlich der produktsei ti ge Durchmesser der Öffnung 18 kleiner als der gewünschte Makromoleküldurchmesser. Es kommt je nach Substratkonzentration und Porenabmessung mehr oder weniger rasch zur Porenverstopfung, so daß nach entsprechender Anlaufphase solche Makromol ekül frakti onen sich auf diese Weise selbst ausschließen. Somit kann es in den Poren 11, die einen etwa gleich großen Durchmesser wie das gewünschte Makromolekül haben, bei sehr hohen Substratmengen ebenfalls rasch zur Verstopfung kommen. Je nach Verteilungsbreite der entstehenden Mol ekül frakti onen kann man entweder die enthaltenen Filtrate nochmals über dieselbe Polymermembran 10 leiten oder man kombiniert mehrere Lagen von Membranen 10 unterschiedlicher erfindungsgemäßer Porendurchmesser in einer entsprechenden Kaskade. In einer derartigen Kaskade von erfindungsgemäßen Membranen, bei denen der Abstand zwischen den Membranen 10 beispielsweise durch Distanzhalter definiert ist, kann man gegebenenfalls nach vorheriger Fraktionierung des Filtrats eine entsprechende Beaufschlagung der einzelnen Membranen 10 vornehmen.
Zur Verhinderung eines sogenannten Foulings kann man entweder alle Substrate 15 unmittelbar vor der ersten bi okatalyti sehen Membran keimfrei machen, z.B. durch den Einsatz einer Mi krofi 1 trati onsme bran , oder durch entsprechende Modifizierung der Membranoberseite wie z.B. durch Ankopplung proteol yti scher Enzyme einen ständigen Abbau von Keimablagerungen erreichen (Anti- foul i ng) .
Die erfindungsgemäße Polymermembran 10 kann grundsätzlich in Form von Flachmembranen aber auch Hohl fadenmem- branen ausgebildet werden, wobei die Flachmembranen und die Hohl fadenmembranen als sogenannte Komposi t-Membranen aufgebaut sein können. Mit der erfi dungsgemäß vorgeschlagenen Lösung sind Mul ti enzy systeme bzw. Koenzym- bindungen realisierbar, wobei man von Gemischen ausgehen kann und die Enzyme statistisch verteilt koppeln kann, oder man kann sich unterschiedliche Bindungsaffinitäten zunutze machen und damit eine topochemi sehe Reihenfolge oder Verteilung festlegen.
Auch schließt die erfindungsgemäße Polymermembran 10 die Möglichkeit der Einstellbarkeit kontrollierter Biokata- lysevertei 1 ungsgl ei chgewi chte ein und man kann entweder im wäßrigen Medium Resynthesen durchführen oder im organischen Medium möglicherweise neue Produkte synthe- ti si eren .
1 ) Pl asmabehandl ung Prozeßdaten :
A. Dauer der Aktivierung durch Argon-Plasmabehandlung von 1 bis 360 s, vorzugsweise 5 s;
Argonflußrate von 100 bis 1000 sccm, vorzugsweise 500 sccm; zusätzlich Sauerstofffl ußrate von 50 bis 500 sccm, vorzugsweise kein Sauerstoff;
Druck von 10 bis 70 Pa, vorzugsweise 30 Pa;
Mikrowellenfeld kontinuierlich;
Mikrowellenleistung von 200 bis 1500 W, vorzugsweise 340
W.
B. Plasmapolymerisation mit Ni chtgl ei chgewi chts-Pl asma- poly eri sat i onsanl age im Remote-Prozeß bei:
2,45 Ghz Mikrowellenfeld zur Plasmaanregung;
Argon als Plasmaträgergas;
Acrylsäure als Monomer, eingelassen strömungsabwärts im
Aftergl ow-Berei ch ;
Polymerisationsdauer von 10 bis 500 min, vorzugsweise 20 min;
Argonflußrate von 100 bis 500 sccm, vorzugsweise 500 sccm;
Acryl säurefl ußrate von 30 bis 200 sccm, vorzugsweise 50 sccm;
Druck von 10 bis 70 Pa, vorzugsweise 35 Pa; Mi krowell enl ei stung von 200 bis 1500 W, vorzugsweise 280 W;
Mikrowellenfeld kontinuierlich oder gepulst, vorzugsweise gepulst mit:
Pulsfrequenz von 500 bis 10000 Hz, vorzugsweise 10000 Hz; Tastgrad von 30 bis 70 %, vorzugsweise 50 % . Beispiel 1 :
Eine Polyester-Kernspurfiltermembran mit einem Kapillardurchmesser d = 100 nm wurde nach 5 min Reinigung in Ethanol durch eine Ni chtgl ei chgewi chts-Pl asmapolymeri sa- tionsanlage im Remote-Verfahren mit einer Acrylsäure- Pl as apolymerschi cht belegt.
Hierzu wurde die Membran 5 s lang bei einem Prozeßdruck von 30 Pa, einer Argonflußrate von 500 sccm und einem kontinuierlichen Mikrowellenfeld mit einer Leistung von
340 W (Mikrowelleneingangsleistung P = 400 W bei einer reflektierten Leistung 3 P_re.tPTI = 60 W) aktiviert.
Anschließend wurde sie 20 min lang bei einem Druck von 35 Pa, mit einer Argonflußrate von 500 sccm und einer Acryl säurefl ußrate von 50 sccm, in den Aftergl ow-Berei ch eingelassen, in einem gepulsten Mikrowellenfeld mit einer Pulsfrequenz von 10 kHz, einem Tastgrad von 50 % und mit einer Leistung von 280 W (Mikrowelleneingangsleistung P = 360 W bei einer reflektierten Leistung P fl = 80 W) plasmabehandelt bzw. beschichtet. Auf der Membran wurden f1 uoreszenzspektroskopi seh 900 pmol/cm Carboxylgruppen gemessen.
Das Enzym Inul insucrase wurde mit Hilfe der Carbodi- imid-Methode an die so beschichtete, carboxyl gruppenhal - tige Polyester-Kernspurfiltermembran kovalent gekoppelt.
Dazu wurden die Membranen zunächst mit einer 1 %-igen, wäßrigen Lösung von N-Ethyl -N'-3-dimethyl -a i nopropyl - carbodiimid bei pH = 4,75 über 0,5 h aktiviert und danach sofort mit dem Enzym aus der 0,1 %-igen Lösung in Phosphatpuffer bei pH = 7 und T = 25 °C über 3 h beladen . Die Ausgangswasserdurchlässigkeit von J Q = 2400 1/ hm bar verringerte sich durch die Plasmabehandlung auf
J = 650 l/hm2bar. w
Aus einer Saccharose-Lösung (600 mM) wurde im transmem- branen Durchfluß bei 40 °C und einer Fi 1 trati onsge-
2 schwi ndigkei t v° = 500 1/hm ein Inulin mit der Molmasse
M = 10 000 kDa erhalten. Ein kontinuierlicher Prozeß war möglich, die Membran verstopfte nicht.
2) Photopfropfpol ymerisation
Beispiel 2 :
Polypropyl en-Mi krof i 1 trati onsmembranen (MFM) mit einer Schwammstruktur, symmetrischer Porengrößenvertei 1 ung und mittleren, effektiven Porendurchmessern (dpQ) von 100, 200 bzw. 450 nm wurden durch photoinitiierte heterogene Propfcopolymeri sati on von Carboxyl- bzw. Ami no-Acryl aten auf der gesamten Oberfläche funkti onal i si ert .
Dazu wurden die Membranen zunächst aus einer methanolischen Lösung (0,01 ... 0,2 mol/1) mit dem Photoinitiator Benzophenon (BP) 1 ... 16 h beschichtet. Anschließend wurden die Membranen in wäßrigen, mit BP gesättigten Lösungen von Acrylsäure (AA; 5 ... 100 g/1 ) oder 2-Ami noethyl methacryl at (A EMA, 10 ... 50 g/1) mit UV-Licht einer Anregungswellenlänge von λ > 300 nm bzw. 290 nm > λ > 320 nm zwischen 15 und 120 min bestrahlt. Danach wurden die Membranen gründlich mit Wasser - ggf. zusätzlich mit Methanol - extrahiert. Auf diese Weise konnte der Funkti onal i si erungsgrad (DG) zwischen 0 und
2 3000 μg/cm variiert werden. Durch Variation von Beschi chtungs-, Belichtungs- und Polymerisationsbedingungen konnten in den funktionali- sierten Membranen unterschiedliche Funkti onal i si erungs- gradienten eingestellt werden, die den Gradienten der mittleren Porengröße entsprechen. Dies wurde aus mittels ATR-IR-Spektroskopi e erhaltenen Werten für lokale Modifizierungsgrade abgeleitet (siehe Fig. 5).
Gemäß Fig. 5 sind folgende Funkti onal i si erungsbedi ngun- gen vorhanden:
1: BP-Beladung 0,05 mol/1, 1 h ; AA 5 g/1, 60 min UV ( λ> 300 nm) ; DG = 100 μg/cm2;
2: BP-Beladung 0,2 mol/1 , 16 h; AA 10 g/1, 30 min UV (λ
> 300 nm) ; DG = 320 μg/cm2;
3: BP-Beladung 0,2 mol/1 , 16 h; AA 100 g/1, 30 min UV (λ
> 300 nm) ; DG = 2100 μg/cm2;
4: BP-Beladung 0,2 mol/1, 16 h; AA 100 g/1, 30 min UV (290 > λ > 320 nm) ; DG = 210 μg/cm2;
Bei spiel 3 :
Polyester-Kernspurfiltermembran (KSM) mit Kapillardurchmessern (dpQ) zwischen 30 und 3000 nm wurden durch photoinitiierte heterogene Pfropfcopolymeri sati on von Carboxyl- bzw. Ami no-Acryl aten auf der gesamten Oberfläche funkti onal i si ert .
Dazu wurden die Membranen zunächst aus einer methanolischen Lösung (0,1 mol/1) mit dem Photoinitiator Benzo- phenon beschichtet. Anschließend wurden die Membranen in wäßrigen, mit Benzophenon gesättigten Lösungen von
Acrylsäure (AA; 5 ... 100 g/1) oder 2-Ami noethyl eth- acrylat (AmEMA, 10 ... 50 g/1) mit UV-Licht einer
Anregungswellenlänge von λ > 300 nm zwischen 15 und 120 min bestrahlt. Danach wurden die Membranen gründlich mit
Wasser - ggf. zusätzlich mit Methanol - extrahiert. Auf diese Weise konnte der Funkti onal i si erungsgrad (DG) zwischen 0 und 100 μg/cm variiert werden.
Bei den Pfropfpolyacryl säure-funkti onal i si erten Membranen ("Pfropf-Tentakeln") werden für mittlere Funktionali si erungsgrade sowie in Abhängigkeit vom pH-Wert besonders deutliche Veränderungen des effektiven Porendurchmessers - mit Konsequenz für die Membranpermeabi - 1 i tat - erziel t .
So hat eine KSM (dpQ = 450 nm) mit DG = 30 μg/cm2
(Membran 1 : 100 g/1 AA; 45 min UV) bei pH = 3 eine
2 Permeabilität von 6300 1/m hbar, bei pH = 7 eine Permea- bilität von 50 1/m hbar (Die Wasserpermeabilität der
2 unmodi fizierten KSM beträgt 45000 1/m hbar).
Eine KSM (dpQ = 3000 nm) mit DG = 18 μg/cm2 (Membran 2 :
100 g/1 AA; 60 min UV) hat bei pH = 3 eine Permeabilität
2 von 195000 1/m hbar, bei pH = 7 eine Permeabilität von
2 3800 1/m hbar (Die Wasserpermeabilität der unmodi fi zi erten KSM beträgt 210000 l/m2hbar).
Bei den Pfropfpoly-(2-aminoethylmethacryl at)- unkti o- nalisierten Membranen (Pfropf-Schicht) sind die Veränderungen des effektiven Porendurchmessers - mit Konsequenz für die Membranpermeabilität - wesentlich geringer und nicht pH-abhängig. So hat eine KSM (dpQ = 450 nm) mit DG = 16,5 μg/cm2 (Membran 3 : 40 g/1 A EMA; 60 min UV) eine Permeabilität von 42000 1/m hbar (Die Wasserpermeabilität der unmodi- fizierten KSM beträgt 45000 l/m2hbar).
Das Enzym Inul i nsucrase (FTF) wurde an carboxyl gruppen- haltige Membranen mit Hilfe der Carbodi imi d-Methode kovalent gekoppelt. Dazu wurden die Membranen zunächst mit einer 15 %igen, wäßrigen Lösung von N-Ethyl -N'-3- dimethyl -ami nopropyl -carbodi i id bei pH = 4,75 über 0,5 h aktiviert und danach sofort mit dem Enzym aus der 0,1 %igen Lösung in Phosphatpuffer bei pH = 7 und T = 25 °C über 4 h beladen.
Das Enzym Inul i nsucrase (FTF) wurde an ami nogruppen-hal- tige Membranen mittels Gl utaral dehyd kovalent gekoppelt. Dazu wurden die Membranen zunächst mit einer 10 igen Lösung von Gl utaral dehyd für 5 Stunden aktiviert, dann mit Wasser bis zur vollständigen Entfernung des Aldehyds gewaschen und anschließend sofort mit dem Enzym aus einer 0,1 %igen Lösung in Phosphatpuffer bei pH = 7 und T = 25 °C für 16 Stunden beladen.
Bei Saccharose als Substrat (600 mM) , einem pH = 7,2 und eeiinneerr ÜÜbbierströmgeschwindigkeit v 1000 l/m2h wurden erhal ten
für FTF-Membran 1:
Inulin mit M = 80000 kD, aber bei schneller Blockierung der Membran (hohe Kapazität für Enzymbeladung, aber zu starke Porenverengung durch Tentakeln);
für FTF-Membran 2:
Inulin mit M = 80000 kD, kontinuierliche Produktgewinnung, da kaum Blockierung aufgrund größerer Matrixporen (hohe Kapazität für Enzymbeladung durch Tentakeln); für FTF-Membran 3:
Inulin mit M = 1000 kD, kontinuierliche Produktgewinnung (hohe Kapazität für Enzymbeladung durch Pfropfschi cht , kaum Blockierung wegen Schichtstruktur, damit Einsatz kleinerer Poren möglich und Beeinflussung der Produktstruktur) .
Bezugszei chenl i ste
10 Polymermembran (Membran)
11 Pore
12 Enzym
13 Porenlänge
14 Porenquerschnitt
15 Substrat
16 Produkt (Polymer)
17 Öffnung (Substrat)
18 Öffnung (Produkt)
19 Molekül
20 Monomerpl asma
21 Beschichtung
22 01 igomer

Claims

Patentansprüche
1. Polymermembran, bei der in den Poren Enzyme für biokatalyti sehe Zwecke lokalisiert sind, gekennzeichnet durch die Membran (10) durchquerende offene Poren (11) mit im wesentlichen im Querschnitt der Membran zylindrischen bis konischen Poren (10) wenigstens die Porenlänge (13) und/oder der Porenquerschnitt (16) in Abhängigkeit von der Art eines der Membran (10) zugeführten Substrats (15) sowie des aus dem Substrat (15) mittels der Enzyme (12) gebildeten Produkts (16) einstellbar i st .
2. Polymermembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren (11) im Zuge der Herstellung der Membran (10) hergestellt werden.
3. Polymermembran nach einem oder beiden der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren (11) nach der Herstellung der Membran (10) als solcher durch chemische und/oder physikalische Beeinflussung hergestellt werden.
4. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Poren (11) nach der Herstellung der Membran (10) als solcher durch chemische und/oder physikalische Beeinflussung eingestellt wird.
5. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Substrat (15) gerichtete Öffnung (17) der Poren (11) kleiner als die produktausgangssei ti ge Öffnung (18) der Poren (11) i st .
6. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran nach Art einer Kernspurfiltermembran aufgebaut ist.
7. Polymermembran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran im wesentlichen aus Polycarbonat besteht .
8. Polymermembran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran im wesentlichen aus Polyethylen- terephthalat besteht.
9. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die substratbeaufschlagte Seite der Membran mit einer Beschichtung versehen oder oberflächenmodifiziert ausgebildet ist.
10. Polymermembran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung durch Photopolymerisation oder auch photoinitiierte Pfropfpolymerisation mit Monomeren.
11. Polymermembran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenmodifizierung durch Plasmapolymerisation oder durch plasmainitiierte Pfropfpolymerisation ausbildbar ist.
12. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Monomer Acrylsäure dient.
13. Polymermembran nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese einer hydrothermi sehen Nachbehandlung unterwerfbar sind.
14. Verfahren zur Herstellung von Erzeugnissen mittels in Polymermembranen ablaufender Bioreaktionen nach einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Enzymbeladung in den Poren der Membran in Abhängigkeit des Porendurchmessers und der Porenlänge derart eingestellt wird, daß die dabei erzielte Querdiffusion des die Poren durchquerenden Substrats zu den im wesentlichen im Seitenwandbereich der Poren angeordneten Enzymen ein einstellbarer Parameter der zu erzielen gewünschten Kettenlänge und/oder Verzweigungen des makromolekularen Erzeugnisses ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit des Austrages des Erzeugnisses aus den Poren der Membran einstellbar.
16. Verfahren nach einem oder beiden der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran zu- fuhrseitig vom Substrat tangential überströmt wird.
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