DE19510551A1

DE19510551A1 - Orale Insulinpräparate und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE19510551A1
Application number: DE19510551A
Authority: DE
Inventors: Nikolay Alfredovic Plate; Lev Ivanovic Valuev; Tatyana Aleksandrovna Valueva; Ljudmila Konstan Staroseltseva; Aleksandr Sergeevic Dr Ametov; Vladimir Aleksandrovi Knjazhev
Original assignee: INST NEFTECHIMICHESKOGO SINTEZ
Current assignee: INST NEFTECHIMICHESKOGO SINTEZ
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-23
Publication date: 1995-09-28
Anticipated expiration: 2015-03-24
Also published as: DK28795A; RU2066551C1; DE19510551C2; DK173516B1; US5698515A

Description

Die Erfindung betrifft Insulinpräparate zur oralen Verab reichung, die bei der Behandlung von Diabetes als Arznei mittel anwendbar sind, sowie ihre Herstellung.

Insulin ist ein Polypeptidhormon mit einer Molekülmasse von ca. 6000. Es beeinflußt sämtliche Arten des Stoffwechsels im Organismus: es trägt zur Inkorporation von Glucose in die Gewebe des Organismus und zu ihrer Verwertung durch diese bei, setzt den Gehalt der Leber an Glykogen herab und steigert dessen Menge in den Muskeln, verbessert die Inten sität der Eiweißsynthese usw.

Grundsätzliche Verfahren zur Einführung von Insulin in den Organismus eines Zuckerkranken sind die subcutane und die intramuskuläre Injektion, die allerdings für die Kranken mit physischen und moralischen Leiden verbunden sind. Die Vorteile der physiologischsten und für Diabetiker geeignet sten peroralen Verabreichung von Insulin sind entsprechend groß und offensichtlich, so daß seit vielen Jahren immer wieder Versuche gemacht wurden, Insulinpräparate zu schaf fen, die den Proteasen des Verdauungstrakts widerstehen und durch die Schleimhaut des Darmes in das Blut gelangen kön nen.

Es gibt bereits mehrere Versuche zur Lösung dieses Pro blems, zu denen die Modifizierung des Insulinmoleküls selbst, beispielsweise ein Austausch des terminalen C- Threoninrestes gegen einen beständigeren Glycinrest, die Hydrophobierung des Insulinmoleküls, die Herstellung von Monosaccharid-Derivaten oder die Bindung des Insulins an andere Eiweißstoffe gehören. Abgesehen davon, daß in vielen Fällen durch die Modifizierung eine gewisse Verbesserung der Beständigkeit des Insulins gegen die Proteasen und eine prolongierte Wirkung des Insulins bei Verabreichung durch Injektion erreicht werden konnte, gelang es nicht, auf diese Weise perorale Insulinpräparate zu realisieren.

Ein möglicher Zugang zu einer Lösung dieses Problems be steht in der gemeinsamen Verwendung von Insulin und Ver bindungen, welche die Permeabilität der Darmwände ver bessern und den Übertritt des Hormons in den Blutkreislauf erleichtern, wie z. B. von Fettsäuresalzen, Tensiden, chelatbildenden Verbindungen und Gallensäuresalzen. Eine höhere Permeabilität der Darmwände führt zu einem größeren Anteil des Hormons, das unter Beibehaltung seines aktiven Zustandes in den Blutstrom gelangt, allerdings nur dann, wenn die Zusammensetzung direkt, also unter Umgehung der Speiseröhre, in den Darm eingeführt wird. Die perorale An wendung derartiger Zusammensetzungen führt entsprechend selbst bei hohen Insulindosen nicht zu einem Therapieer folg.

Es wurde daher versucht, Insulin im Gemisch mit Protease inhibitoren anzuwenden, die Insulin auch bei der Darm passage vor hydrolytischem Abbau schützen. Einen ähnlichen Effekt beobachtet man bei Anwendung von Zusammensetzungen, die Insulin, Inhibitoren der Proteasen sowie die Permeabi lität der Darmwände verbessernde Verbindungen enthalten.

Derzeit ist die verbreitetste Vorgehensweise bei der Schaf fung von peroralen Insulinformen die Immobilisierung des Hormons in einer Hülle oder Matrix, durch die das Insulin bei seiner Passage durch den Verdauungstrakt geschützt wird und die im Dünndarm unter Freisetzung des aktiven Insulins zerstört wird. Solche Hüllen oder Matrices können Lipo somen, Hydrogele, Nanokapseln oder biologisch abbaubare Polymere sein.

Aus US 50 49 545 sind bereits insulinhaltige Zusammenset zungen zur Injektion bekannt, die ein auf oder in einem Polymer (einschließlich Polymer-Hydrogelen) immobilisiertes Insulin enthalten. Als Polymere werden bei diesen Zusammen setzungen Dextran, Stärke, Polyoxyethylen, Polyvinylpyrro lidon, vernetztes Kollagen oder Eiweißstoffe und deren Derivate, darunter auch Inhibitoren der Proteasen, einge setzt. Dabei werden insulinhaltige Polymere mit höherer Beständigkeit gegen die Proteasen des Blutes hergestellt, wodurch sich die Wirkungsdauer des Insulins im Blut ver längert. Diese vorbekannten insulinhaltigen Polymer zusammensetzungen sind jedoch nicht in ausreichendem Maße gegenüber den Enzymen des Verdauungstraktes beständig, so daß sie nicht peroral anwendbar sind.

Ferner sind insulinhaltige Polymerzusammensetzungen bekannt (Saffran, M., Kumar, G.S., et al., Biochem. Soc. Trans. 18, Nr. 5 (1990) S. 752), die aus einem Hydroxyethylmeth acrylat-Styrol-Copolymerisat bestehen, in dessen Innerem Insulin enthaltende Gelatinekapseln immobilisiert sind, wo bei das Copolymer nach dem Einbringen der Gelatinekapseln dann mit einem azohaltigen Divinylbenzol-Derivat vernetzt wurde. Bei peroraler Anwendung wird das vernetzte Copoly merisat unter Einwirkung der Mikroorganismen des Darmes unter Freisetzung des Insulins zerstört, das dann durch die Darmwände in das Blut gelangt. Nachteilig wirkt sich bei diesen Zusammensetzungen aus, daß die Polymeren keine gute Beständigkeit gegenüber den Verdauungsenzymen aufweisen, so daß die Aktivität an in das Blut übergetretenem Insulin niedrig bleibt. Bei peroraler Verarbeitung des oben erwähn ten vernetzten Copolymers an Ratten in einer Menge von 1 bis 40 mg Insulin pro Ratte betrug die maximale Absenkung der Glucose im Blut der Tiere im Durchschnitt 25% (von 384 mg/100 ml bis auf 287 mg/100 ml) und wurde 3 bis 4 h nach Verabreichung des Präparats beobachtet.

Aus der Publikation von Damge, C., Michel, C., J. Controlled Release 13 (1990) S. 233 sind ferner sphärische Nanokapseln von 250 bis 350 nm Durchmesser auf der Basis eines biologisch abbaubaren Polyisobutyl-2-cyanoacrylats bekannt, die in ihrem Inneren in einer Lipidphase disper giertes Insulin enthalten. Bei peroraler Verabreichung der Nanokapseln wurde eine deutliche Senkung der Glucosekon zentration (um 25%) allerdings lediglich bei extrem hohen Insulindosen (von größenordnungsmäßig 100 Einheiten/kg) festgestellt, wobei der Wirkstoff zudem erst nach Ablauf von 6 Tagen nach der Einführung der Kapseln in den Organis mus zu wirken beginnt.

Aus der Publikation von Greenley, R.Z., Broun, T.M., et al., Polymer Prep. 31. Nr. 2 (1990) S. 182 sind ferner In sulinpräparate bekannt, bei denen Insulin im Inneren eines vernetzten, mit einem Inhibitor der proteolytischen Enzyme modifizierten Polymers immobilisiert ist. Dieses vernetzte Polymer ist eine Polyacrylsäure oder eine Polymethacrylsäu re, die mit Triethylenglykoldi(meth)acrylat vernetzt ist, wobei als Inhibitor ein Aprotenin-Pankreasinhibitor des Trypsins verwendet ist. Nachteilig ist bei diesen Zusammen setzungen, daß die synthetischen polymeren Hydrogele gegen über den Verdauungsenzymen nur wenig beständig sind, so daß nur eine niedrige Insulinaktivität im Blut erzielt werden kann. So fällt z. B. nach peroraler Anwendung einer solchen modifizierten Insulin-Zusammensetzung bei Kaninchen in einer 50 Insulin-Einheiten entsprechenden Menge die Glu cosekonzentration im Blut innerhalb von 30 min von 380 auf 360 mg/100 ml und erhöht sich dann 300 min nach der Verab reichung des Präparats auf 460 mg/100 ml. Die perorale Ver abreichung eines nichtmodifizierten Hydrogels ohne Inhibi tor (50 Insulin-Einheiten) geht mit einer Senkung der Glu cosekonzentration von etwa 23% (von 310 auf 240 mg/100 ml innerhalb von 300 min) einher. Auf der anderen Seite fällt beim Kaninchen nach subcutaner Injektion von nur 0,23 In sulin-Einheiten die Glucosekonzentration im Blut 150 min nach der Injektion von 330 auf 120 mg/100 ml (um 74%).

Es ist Aufgabe der Erfindung, neuartige Insulinpräparate auf der Basis insulinhaltiger polymerer Hydrogele mit Be ständigkeit gegenüber den proteolytischen Enzymen des Ver dauungstrakts, die peroral angewandt werden können, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung anzugeben.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindungskon zeption.

Die erfindungsgemäßen Insulinpräparate zur oralen Verabrei chung sind mit einem Inhibitor der proteolytischen Enzyme versetzte bzw. modifizierte vernetzte hydrophile Polymere und insbesondere Hydrogele, in deren Innerem Insulin immo bilisiert ist, wobei als Inhibitoren Ovomucoide eingesetzt sind, also Enzyme, die aus dem Eiweiß von Enten- oder Pu teneiern gewonnen sind (SU-Urheberschein 14 04 513, 1988).

Die Ovomucoide zählen zur Klasse der Glykoproteinen. Die Molekülmasse der Ovomucoide beträgt 31 000. Die Aminosäure zusammensetzung des Proteinanteils der Ovomucoide ist der Tabelle 1 zu entnehmen. In einem Ovomucoid-Molekül sind 12,5 Masse-% Glucosamin und 7,8 Masse-% andere Zucker ent halten.

Tabelle 1

Aminosäurezusammensetzung des Ovomucoids aus dem Eiweiß von Enteneiern

Um Ovomucoid zu gewinnen, werden in einem Kolben mit Rührer 100 g Eiklar vorgelegt; dann werden unter Rühren 100 g eines Gemisches aus Ethanol (70 g) und 30 g einer Lösung aus 2,7 g Trichloressigsäure und 27,3 g destilliertem Was ser mit einer Geschwindigkeit von 3 bis 5 ml/min zugegeben. Nach der Zugabe der gesamten Menge der Reaktionsmasse wird 40 min bei 15 bis 25°C weiter gerührt. Das Fällungsprodukt wird abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wird in den Kolben gebracht, wonach dann 550 g Ethanol zugegeben wer den. Das Fällungsprodukt wird gegen destilliertes Wasser dialysiert; die nach der Dialyse erhaltene Lösung wird lyophilisiert. Es fallen 0,8 g Ovomucoid an.

Die polymeren Hydrogele sind vorzugsweise in Wasser ge quollene Homo- und Copolymerisate auf der Basis von Acryl säure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxy ethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat und/oder Vinyl pyrrolidon.

Als Insulin sind beliebige natürliche oder synthetische Insuline und entsprechende Derivate und Analoga geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Insulin präparate beruht auf dem Quellenlassen eines einen Inhibi tor für proteolytische Enzyme enthaltenden vernetzten hydrophilen Polymers bzw. Xerogels in einer wässerigen In sulinlösung; es ist dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibi tor ein Ovomucoid eingesetzt wird.

Vorzugsweise werden als vernetzte Polymere vernetzte Homo- oder Copolymere von Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat und/oder Vinylpyrrolidon eingesetzt.

Die Erfindung betrifft ferner als Zwischenprodukte mit Ovomucoid modifizierte vernetzte hydrophile Polymere bzw. Xerogele.

Die erfindungsgemäßen Insulinpräparate können in Form einer Flüssigkeit oder in Form eines Feststoffs vorliegen. Sie befinden sich nach einer vorteilhaften Ausführungsform in Gelatinekapseln.

Die erfindungsgemäßen Insulinpräparate werden vorzugsweise wie folgt hergestellt: 0,01 bis 1,0 g vorgetrocknetes ver netztes, mit 0,2 bis 25 mg Ovomucoid modifiziertes Polymer wird in 1 ml wässerige Insulinlösung einer Konzentration von 0,01 bis 3 mg/ml (Insulinaktivität 25 Einheiten/ml) eingebracht und 1 h lang bei Raumtemperatur gehalten. Innerhalb dieser Zeit ist das Polymer voll gequollen und gebrauchsfertig.

Die Untergrenze der Ovomucoidmenge im polymeren Hydrogel hängt damit zusammen, daß bei Einsatz des Ovomucoids in einer Menge unter 0,2 mg pro 1 ml Gel das Ovomucoid keine Schutzfunktion mehr ausübt und das Insulin durch die proteolytischen Enzyme zerstört wird. Der Einsatz des Ovomucoids in einer Menge von über 25 mg pro 1 ml hingegen ist unzweckmäßig, weil diese Menge selbst für den Schutz beliebiger therapeutisch angewandter Insulindosen aus reicht.

Beispiel 1

0,1 g vorgetrocknetes vernetztes, mit Ovomucoid versetztes, modifiziertes Polyacrylamid wird in 1 ml wässeriger Insu linlösung einer Konzentration von 1,0 mg/ml (Insulinakti vität 25 Einheiten/mg) eingebracht und 1 h lang bei Raum temperatur gehalten. Innerhalb dieser Zeit ist das Polymer im Wasser vollständig gequollen und gebrauchsfertig. Das hergestellte Hydrogel wird Kaninchen peroral mit Hilfe eines Katheters in einer Menge verabreicht, die 5 Insulin- Einheiten pro 1 kg Tiermasse entspricht. Blutproben werden nach 30, 60, 90 und 120 min entnommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Beispiele 2 bis 10

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, wobei verschiedene vernetzte modifizierte Polymere, verschiedene Konzentra tionen der Insulinlösung, verschiedene Mengen an vernetztem modifiziertem Polymer und verschiedene Ovomucoidmengen ein gesetzt werden. Die Zusammensetzung und die Eigenschaften der hergestellten Hydrogele sind in Tabelle 2 zusammenge faßt.

Beispiel 11 (Vergleichsbeispiel)

Der Prozeß wird ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt, indem ein nichtmodifiziertes Polyacrylamid-Hydrogel benutzt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Beispiele 12 und 13

Ein experimenteller Diabetes wird bei weißen Ratten der Wistar-Linie mit einer Körpermasse von je 100 g durch intraabdominale Einführung von Streptosotozin in einer Menge von 70 mg/kg hervorgerufen. Die entsprechenden In sulinpräparate werden erst dann verabreicht, wenn der Glucosespiegel über 400 mg/100 ml liegt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Beispiele 14 (Vergleichsbeispiel)

Es wird wie in Beispiel 12 verfahren, wobei aber den Tieren die gleiche Insulinmenge als Lösung subcutan injiziert wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Beispiele 15 bis 17 (Vergleichsbeispiele)

Den Kaninchen wird eine Insulinlösung in einer Menge von 7 Einheiten/kg Körpermasse, ein Gemisch aus Ovomucoid (2,5 mg/kg Körpermasse) und Insulin (8 Einheiten/kg Körper masse) oder ein modifiziertes Hydrogel (200 mg/kg Körper masse) peroral verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

PAA - Polyacrylamid;
PAS - Polyacrylsäure;
PMA - Polymethacrylamid;
PVP - Polyvinylpyrrolidon;
PHEMA - Polyhydroxyethylmethacrylat;
NM - nicht modifiziert;
p.o. - peroral;
s.c. - subcutan;
* Zeit nach der Verabreichung des Präparats;
** Bei diesem Versuch handelt es sich um aus Puteneiern gewonnenes Ovomucoid, bei den anderen Versuchen um Ovomucoid aus Enteneiern.
V Vergleichsbeispiel.

In den Beispielen 1, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15 und 16 wurde Schweineinsulin, in den Beispielen 2 und 3 Rinderinsulin eingesetzt.

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Insulin präparate, die sich vom Stand der Technik durch den einge setzten Inhibitor der proteolytischen Enzyme unterscheiden, befähigt sind, die Hydrolyse des Insulins im Verdauungs trakt zu verhindern und die Erzielung eines hohen Insulin spiegels im Blut sicherzustellen. Die Aktivität des In sulins bei der peroralen Anwendung der anmeldungsgemäßen Zusammensetzungen beträgt im Mittel 60 bis 70% der Aktivi tät des Ausgangsinsulins nach Injektion.

Claims

1. Insulinpräparate zur oralen Verabreichung auf der Basis eines vernetzten hydrophilen Polymers, das Insulin, einen Inhibitor für proteolytische Enzyme sowie Wasser enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Ovomucoid ist.

2. Insulinpräparate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß das vernetzte hydrophile Polymer ein Hydrogel ist.

3. Insulinpräparate nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymer unter Homo polymeren und Copolymeren von Acrylsäure, Methacryl säure, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat und/oder Vinylpyrrolidon aus gewählt ist.

4. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ovomucoidkon zentration im vernetzten hydrophilen Polymer 0,2 bis 25 mg pro Gramm Polymer bzw. Hydrogel beträgt.

5. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinkonzen tration 0,01 bis 3 mg/ml, bezogen auf die zur Herstel lung des gequollenen Polymers bzw. des Hydrogels einge setzte Wassermenge, beträgt.

6. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insulinaktivi tät etwa 25 Einheiten/ml beträgt, bezogen auf die zur Herstellung des gequollenen Polymers bzw. des Hydrogels eingesetzte Wassermenge.

7. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Ovomucoid aus dem Eiklar von Enteneiern oder von Puteneiern gewonnen ist.

8. Verwendung von Ovomucoiden als Inhibitoren von proteo lytischen Enzymen zum Schutz von in Hydrogelen vorlie gendem Insulin gegen Proteolyse im Verdauungstrakt von Säugern.

9. Verfahren zur Herstellung der Insulinpräparate nach den Ansprüchen 1 bis 7 durch Quellen eines einen Inhibitor für proteolytische Enzyme enthaltenden vernetzten hydrophilen Polymers bzw. Xerogels in einer wässerigen Insulinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor ein Ovomucoid eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als vernetztes Polymer ein vernetztes Homo- oder Co polymer von Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmeth acrylat und/oder Vinylpyrrolidon eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 und/oder 10, dadurch gekenn zeichnet, daß das Ovomucoid in einer solchen Konzen tration eingesetzt wird, daß seine Endkonzentration 0,2 bis 25 mg pro Gramm Polymer bzw. Hydrogel beträgt.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Insulin in der wäs serigen Insulinlösung in einer Konzentration von 0,01 bis 3 mg/ml eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Insulin in einer Menge eingesetzt wird, die einer Insulinaktivität von etwa 25 Einheiten/ml entspricht.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus dem Eiklar von Enteneiern oder von Puteneiern gewonnenes Ovomucoid eingesetzt wird.

15. Mit Ovomucoid modifizierte vernetzte hydrophile Poly mere bzw. Xerogele.

16. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Flüssigkeit oder in Form eines Feststoffs vorliegen.

17. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 und/oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Gelatinekapseln vorliegen.

18. Insulinpräparate nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Dosierein heiten vorliegen, deren Insulingehalt einer herkömmli chen Insulin-Dosiereinheit entspricht.