DK173516B1 - Insulinholdigt polymerpræparat til oral administrering af insulin - Google Patents

Description

i DK 173516 B1

Opfindelsen er knyttet til området polymerkemi, medicin og biokemi og nærmere bestemt til frembringelse af insulinholdige polymerpræparater til anvendelse som medicinske præparater ved behandling af diabetes.

5 Insulin er et po lypep tidhormon med en molekylmasse på ca. 6000. Det påvirker alle typer af stofskifte i organismen: øger penetrationen af glucose i levende væv og dens udnyttelse, reducerer glucogenindholdet i leveren og øger mængden af det i musklerne, øger proteinsynteseintensiteten 10 etc.

Den primære metode til administrering af insulin i en diabetes-patients organisme er systematiske subkutane og intramuskulære injektioner af et præparat. Ved at blive gentaget hundredvis og tusindvis af gange er denne pro-15 cedure årsag til fysisk og psykisk ubehag for patienten. Fordelene ved den mest psykologiske og bekvemme (hvis den foreligger som praktisk mulighed) orale (via munden) administrering er så store og åbenlyse, at man gennem mange år har fortsat bestræbelserne på at frembringe insulinpræ-20 parater, som er resistente over for virkningen af fordøjelsesproteinaser og i stand til at trænge ind i blodet via tarmslimhinden.

Der har været adskillige forslag fremme om at løse dette problem, herunder modifikation af selve insulin-25 molekylet, såsom erstatning af C-terminalresten af threonin med en mere stabil glycinrest, hydrofob!sering af insulinmolekylet, fremstilling af monosaccharidderivater eller binding af insulin til andre proteiner. Men til trods for at modifikation i sig selv i mange tilfælde frembringer en 30 forøgelse i insulins resistens over for indvirkningen af proteinaser og forlængelse af insulinets virkning ved injektionsadministrering, er det ikke lykkedes at syntetisere de orale former af hormoner på denne måde.

En af de mulige måder at løse dette problem på består 35 i samtidig anvendelse af insulinet og forbindelser, der øger evnen til at penetrere tarmvægge og letter penetrationen af hormoner i blodstrømmen, f.eks. fedtsyresalte, over- 2 DK 173516 B1 fladeaktive midler, galdesalte og chelatdannende forbindelser. Den øgede permeabilitet af tarmvægge bidrager til at en øget hormonandel når blodstrømmen i aktiv tilstand, men kun med et præparat, der administreres 5 direkte i tarmsystemet og passerer forbi spiserøret og maven. Den perorale applikation af sådanne præparater giver ikke en terapeutisk virkning, selv med høje doser af insulin.

Det synes helt naturligt at forsøge at anvende insulin 10 i blanding med proteinaseinhibitorer, som også beskytter insulinet, når det administreres i indvoldene. En lignende effekt iagttages ved anvendelse af præparater indeholdende proteinaseinhibitorerne, insulin og forbindelser, der øger · evnen til at penetrere tarmvægge.

15 For nærværende er en af de mest populære metoder til frembringelse af orale former af insulin at anbringe hormonet i en skal, som beskytter det ved passage gennem fordøjelseskanalen, men disintegreres i tyndtarmen, hvor aktiv insulin frigøres. Som sådanne skaller kan anvendes 20 liposomer, hydrogeler, nanokapsler eller bionedbrydelige polymerer.

Der kendes (US patentskrift 5049545, cl. 514/3, publiceret 17/9/1991) insulinholdige præparater til injektion, hvor insulinet er immobiliseret på en polymer 25 (indbefattende en polymerhydrogel).

Den i sådanne præparater anvendte polymer er repræsenteret ved stivelse, dextran, polyoxyethylen, polyvinylpyr-rolidon, tværbundet collagen, proteiner og derivater deraf inklusive inhibitorer for proteolytiske enzymer. Dette 30 resulterer i, at de insulinholdige polymerer udviser en øget resistens over for virkningen af proteolytiske enzymer i blod, en faktor, der giver en øget varighed af insulinets funktion i blodstrømmen. Ifølge dette skift syntetiserede insulinholdige polymerpræparater udviser imidlertid ikke 35 tilstrækkelig stabilitet over for fordøjelsesenzymernes angreb, af hvilken grund det er umuligt at anvende dem peroralt.

3 DK 173516 B1

Der kendes (Saffran M. , Kumar G.S. et al. Biochem.

Soc. Trans. 1990, v.18, N. 5, p. 752) insul inholdige polymerpræratater i form af en insulinholdig gelatinekapsel overtrukket med en copolymer af styren og hydroxyethyl-5 methacrylat, som derefter er tværbundet med et azoholdigt divinylbenzenderivat. Ved oral brug nedbrydes den tvær-bundne copolymer under indvirkning af mikroorganismerne i tarmen, og der frigøres insulin, som trænger ind i blodet gennem tarmvæggene. En ulempe ved disse præparater er en 10 lav modstandsdygtighed af det syntetiserede præparat over for indvirkning af fordøjelsesenzymer og dermed en lav aktivitet af insulinet, som trænger ind i blodet. Ved oral administrering af den ovenfor nævnte tværbundne polymer i rotter i en mængde fra 1 til 40 mg pr. rotte (som beregnet 15 for insulin) var den maksimale reduktion af glucosekon-centration i dyrets blod 25% i gennemsnit (fra 384 mg/100 ml til 287 mg/l00ml), og iagttoges 3 til 4 timer efter administrering af præparatet.

Der kendes (Damge C., J Controlled Release, 1990, V.

20 13. p. 233) sfæriske nanokapsler med en diameter på 250 til 350 nm på grundlag af bionedbrydeligt polyisobutyl-2-cyanoacrylat indeholdende insulin dispergeret i en lipid-fase. Ved oral administrering af nanokapsler iagttages kendelig reduktion i glucosekoncentration (med 25%) kun i 25 tilfælde af meget høje insulindoser (ved en faktor på 100 U/kg), og tilmed begynder medikamentet først at virke 6 dage efter, at kapslerne er administreret i organismen.

Tættest på den foreliggende opfindelse er et præparat (Greenley R.Z., Broun T. M. et al. Polymer Prepr. 1990, v.

3 0 31, N 2. p.182) i form af et insulin immobiliseret i volumenet af en tværbundet polymer modificeret med en inhibitor for proteolytiske enzymer. Den tværbundne polymer er i hovedsagen en polyacryl- eller polymethacrylsyre, som er tværbundet med triethylglycoldi(meth)acrylat, og 35 inhibitoren er repræsenteret ved aprotinin-proteasein-hibitor. En ulempe ved dette præparat er lav resistens af syntetiserede polymerhydrogeler over for virkningen af 4 DK 173516 B1 fordøjelsesenzymer, hvilket giver anledning til lav aktivitet af blodpenetrerende insulin. Ved oral administrering af et sådant modificeret insulinpræparat til kaniner i mængder svarende til 50 enheder insulin reduceres koncentrationen 5 af glucose i blodet således i løbet af 30 minutter fra 380 til 360 mg/100 ml og når så 300 minutter efter administrering af præparatet op på 460 mg/100 ml. Den perorale administrering af en ikke modificeret hydrogel uden inhibitor (50 enheder insulin) ledsages af en reduktion i 10 glucosekoncentrationen på ca. 23% (fra 310 til 240 mg/100 ml efter 300 minutter) . Til sammenligning fører den subkutane injektion af kaninerne med kun 0,23 enheder insulin til en reduktion af glucosekoncentrationen i blodet fra 330 til 120 mg/100 ml (med 74%) 150 minutter efter 15 injektionen.

Morishita et al., International Journal of Pharmaceutics, 78, 1992, pp. 9-16, beskriver resultater opnået ved oral administrering af mikrokugler indeholdende insulin og en proteaseinhibitor i form af trypsininhibitor (TI) , 20 chymostatin (CS), aprotinin (AP) eller Bowman-Birk-inhibitor (BBI) . I alle tilfælde indkapsles mikrokuglerne for at beskytte insulinet mod nedbrydning og gøre det tilgængeligt for absorption i tarmen. Insulinabsorptionen vurderes ved hjælp af den hypoglykæmiske virkning. Kun med 25 AP og BBI opnåedes en signifikant kontinuert hypoglykæmisk effekt efter oral administrering af de indkapslede mikrokugler, mens indkapslede mikrokugler uden proteaseinhibitor eller med TI eller CS ikke gav nogen signifikant virkning.

Den foreliggende opfindelse gør ikke brug af ind-30 kapslede mikrokugler. Præparatet ifølge opfndelsen er baseret på brugen af en tværbundet hydrofil polymer modificeret med en speciel inhibitor for proteolytiske enzymer, insulin og vand.

Den specielle inhibitor for proteolytiske enzymer er 3 5 et ovomucoidenzym, som kan isoleres fra hviden fra andeel ler kalkunæg (cf. USSR opfindercert if ikat N 1404513 , IOC4 C07 K 3/02.B.I.I 23 1988).

5 DK 173516 B1

Fra Plate et al., Biomaterials, 14, 1993, pp. 51-56, er det kendt at modificere polymere hydrogeler med ovomucoid og anvende de modificerede hydrogeler som sorbenter til fjernelse af proteolytiske enzymer fra biologiske 5 fluider. Denne anvendelse er imidlertid fuldstændig uden relation til anvendelsen af sådanne modificerede polymere hydrogeler til oral administrering af insulin, og det kunne ikke på baggrund heraf udledes, at man med en tværbundet hydrofil polymer modificeret med ovomucoid, insulin og vand 10 ville kunne opnå et insulinpræparat til oral administrering med en betydelig grad af stabilitet mod såvel enzymer i maven som i tarmen, jf. de senere i Tabel 2 anførte resultater.

Opfindelsen angår således et insulinholdigt polymer-15 præparat til oral administrering af insulin omfattende en tværbundet hydrofil polymer modificeret med en inhibitor for proteolytiske enzymer, insulin og vand, hvor inhibitoren for proteolytiske enzymer er i form ovomucoid.

Endvidere angår opfindelsen anvendelsen af ovomucoid-20 modificerede hydrogeler til beskyttelse af deri foreliggende insulin mod proteolyse i den gastrointestinale kanal.

Opfindelsen tilvejebringer et insulinholdigt præparat, der i det væsentlige er en tværbundet polymerhydrogel, som 25 er modificeret med en inhibitor for proteolytiske enzymer i form af ovomucoid, og i hvis volumen insulinet er immobiliseret.

Ovomucoid hører til klassen af glucoproteiner med en molekylmasse på 31.000. Aminosyresammensætningen af 30 ovomucoidets proteindel er anført i tabel I. Et molekyle ovomucoid indeholder 12,5 vægt% glucosamin og 7,8 vægt% andre sukkerarter.

35 6 DK 173516 B1

Tabel I

Aminosyreindhold i ovomucoid fra andeæggehvide Aminosyre Rester pr. Aminosyre Rester pr.

molekyle* molekyle 5 _

Asp 30,14(30) Leu 12,76(13)

Thr 17,98(18) Tyr 9,53(10)

Ser 12,98(13) Phe 5,00(5)

Glu 23,63(24) Lys 16,36(16) 10 Pro 10,24(10) His 4,23(4)

Gly 19,75 (20) Arg 1,95(2)

Ala 10,45(10) Trp 0 1/2 Cys 13,56(14)

Val 14,77(15) 15 Met 6,32(6)

Ile 3,59(2)

Salt, 212

Mrrester 25,178,0 20 Til isolering af et ovomucoid sættes 100 g æggehvide til en kolbe forsynet med omrører, og 100 g af en blanding af ethylalkohol (70 g) med 30 g opløsning af 2,7 g tri-chloreddikesyre i 27,3 g destilleret vand hældes deri under omrøring med en hastighed fra 3 til 5 ml/min. Efter 25 tilsætning af hele mængden af blanding omrøres reaktionsmassen yderligere i 40 minutter ved en temperatur mellem 15 og 25°C. Præcipitatet frafiltreres og kasseres. Filtratet overføres til kolben med 550 g ethylalkohol tilsat dertil. Præcipitatet dialyseres som det destillerede vand, og den 30 resulterende opløsning tørres lyofilt. Udbytte: 0,8 g ovomucoid.

Polymerhydrogeler repræsenterer vandkvældende homo- og copolymerer baseret på acryl- og methacrylsyre, acrylamid, methacrylamid, hydroxyethylmethacrylat, vinylpyrrolidon.

35 Insulinet kan være repræsenteret af vilkårlige naturlige eller syntetiske insuliner.

Præparatet fremstilles på følgende måde: 0,01-1,0 g af 7 DK 173516 B1 en fortørret, tværbundet polymer modificeret med 0,2-25 mg ovomucoid anbringes i en 1 ml vandig opløsning af insulin med en koncentration på 0,01 til 3 mg/ml (insulinaktiviteten er 25 U/ml) i 1 time ved stuetemperatur, i løbet af 5 hvilket tidsrum polymeren kvælder fuldstændigt og er klar til brug.

Grænsen for mængden af ovomucoider i en polymer-hydrogel bestemmes af, at hvis ovomucoidet anvendes i en mængde på mindre end 0,2 mg for 1 ml gel, udøver ovomucoi-10 det ikke nogen beskyttende funktion, og insulinet ødelægges af proteolytiske enzymer. Anvendelsen af ovomucoid i en mængde over 25 mg til 1 ml gel kan ikke tilrådes, da denne mængde allerede er tilstrækkelig til beskyttelse af enhver anvendelig terapeutisk insulindosis.

15 Eksempel 1 0,1 g af et fortørret tværbundet polyacrylamid modificeret med ovomucoid anbringes i 1 ml vandig opløsning af insulin (insulinaktivitet: 25 U/mg) med en koncentration på 1,0 mg/ml i 1 time ved stuetemperatur. Inden for dette 2 0 tidsrum kvælder polymeren fuldstændigt og er klar til brug.

Under anvendelse af et kateter administreres den syntetiserede hydrogel oralt til kaniner i en mængde svarende til 5 enheder insulin pr. kg dyrevægt. Blodprøver udtages efter 30, 60, 90 og 120 minutter. Resultaterne er anført i tabel 25 2.

Eksempel 2-10

Fremgangsmåden udføres i overensstemmelse med eksempel 1 under anvendelse af forskellige tværbundne modificerede polymerer, forskellige koncentrationer af insulinopløsning, 30 forskellige mængder af tværbundet modificeret polymer og forskellige mængder af ovomucoid. Sammensætningen og egenskaberne af de herved opnåede hydrogeler er anført i tabel 2.

Eksempel 11 (kontrol) 35 Fremgangsmåden udføres i overensstemmelse med eksempel 1, men under anvendelse af en ikke-modificeret polyacryla-midhydrogel. Resultaterne er anført i tabel 2.

8 DK 173516 B1

Eksempel 12-13

Eksperimentel diabetes opnås på hvide rotter af Wistar linie med en vægt på 180 g ved hjælp af intraperitonealt administreret streptozotocin i en mængde på 70 mg pr. 1 5 kilogram vægt. Introduktion af syntetiserede polymerer påbegyndtes, efter at glucoseniveauet havde oversteget 400 mg%. Resultaterne er anført i tabel 2.

Eksempel 14 (kontrol)

Fremgangsmåden udføres i overensstemmelse med eksempel 10 12 med en lige så stor mængde insulin administreret sub kutant i form af opløsning. Resultaterne er anført i tabel 2 .

Eksempel 15-17 (kontrol)

Kaniner behandles oralt med en insulinopløsning i en 15 mængde på 7 U/kg dyrevægt, en blanding af ovomucoid (2,5 m9/kg vægt) og insulin (8 U/kg) eller en modificeret hydrogel (200 mg/kg vægt). Resultaterne er anført i tabel 2 .

20 25 30 35 DK 173516 B1 Ό * O i Τ’ o oooooooooo Ή (N COOOCOlTi(NrH<TlOH<Tl

Η rH iH H rH

-H

c 5 Α» o ooooooooooooo h oo σ\ (ooimtooioioiaimcomino t; +l ri o in H g ti o ominoinooooocooo η o vc Hoioicomoihomtoininiii ~ O Η Ή ri Π ^ « c

9 Dl O CNOOOLDOOLnOOOOO

•H; B n OrHOOlCSrHOl’tf'rHOlVDOLn * rlrHri Hrl Hrl ΗΠ^* w o o 2 o ooooooooooooo

IDlD^NlOMHlO'iNlllOO

'-l HHHHHHHHrlHHincO

01 to D) C 0 O o •HH · · <D 4-> <D O 0 ft <« ft · K Λ! sssscrccscaa 4J -H *.

d) rH 0) β 0)0)

H ft Ό -H U -U

CN 0) >, ft -¾ β -U

,η g q <ti ε λ op

·-* 0) S X HH

O' ® tt Λ Λ o 01 (0 n

E-t Ti H-ι TJ H

N iti -Η B

Λ 0 0) Ο ΟΓ^ΜΟιΗΟΟΗ^·^*«^ C ta β H - o; i—i B ft cor'OLnmnoor^r-r' t" Γ"

0) 0 Ή Γ0 rH

ih Ό j> m οι rd t=! O B Di 0) <u > · m a (h rH (ti w

Q) U S H

•(ti i—I 0) rH O ** C HH ft in h - o

(1, 4_) <u «-Ι-ΗΟ ιΗΟΟιΗιΗτΗΓΤτΗΓΗΓΟ iH rH

O O H £ C - -^-2 *»

(D -H 0) -H OOOOOOOOOOOOO

li i 3 f· å. 1 η oo β Qjdiftftaiftftftftftftftft h tn 2 ft tn ή (!) β

Dl (ti rH O)

(!) B

cn a) β H i

•H M-l β J

4J -Η β

C) tn ri 10 · H ri Kl O

CO o 2806 ooooooooooooo CO fH C3 SXNV«.V^NVSSS*»

β ft o Dl rHfOHinOOOrOr-i(NHr-fCO

μ O Μ B

* * * ..........M · · H HC'JfOH,mVDr-'COO\OH<Nm

5¾ (H i—1 t—I rH

in o m o rH rH O) DK 173516 B1

TS

o

ί-i -K

Xi * o _ •ri <M °

H S

G ** 0 <*> •H CO O ΟΟΓΟΜ* 4J+1 ch m vn in in ° Π3 i—I <—I t—I r-l t—i G H ^ 4->

Go o in o in ·ψ Φ o o ^ m m in “ UH Η Η Η H ]2 G \ ^ 0 tn X E O OH^<N,~ 0) n id in in in ^ to Η Η Η H ~ 0 n u G o O CN ^ o η o in in in ' O ^ί* Η Η H ^ i tn tn g o o Ή · ·

O) 4-) (DO

^ S J* a a

Γΰ 4J -H

co <DH0) φ G = = -

4J Gi ft TI 4_> -H

G >, ft *G 4-J G

0 Q Π3 6 O ro o ^ G A!

1-1 HH

CN φ E

tn Φ tJ h

H 0 to -Η H

Φ M O

rQ Ti 4-4 U· <« >, g g g g

Η XI S ft Η H

(D O <D H

G to > tn σι gi <d h o & tn

(D G

H U · -H

(ti G G

Φ tn tn o > 4J s tn tn o tn g <d h G G <d H 03 G ft Ή -Η x} rtj 0) φ ~ H O GG-rl&l •G h u G H G cntno ~ G Η -Η φ H ® § U 4-> φ ft 4-) 4-4 p · i—I i—li—I G (D ft 0 H S G G ft ft E G £ φ TiHfttn ooooij G Ti O O, G G G > U o

0 *G S ft tn -Η -H -r-l O Ή 4J

4-1 Η Η H 4-4 0

t0 G G 4-1 Η U

G tn tn tn φ ti ft (DG G G 0 - CO G -H H tn É

h rn i - G

<U E G -ri tn <D -ri G Ti

G G h tn · rH G

•η 4-i G S U H G

4J tn H G ^ H

<D tn g ft o tn λ to o η o a e

At x x x · G ^ in o r- co

1¾ Η Η Η Η H

i_n o in o

Η H CN

11 DK 173516 B1 PAA - polyacrylamid. PAAC - polyacrylsyre, PMA - polymethacrylamid, PVP - polyvinylpyrrolidon, PHEMA - polyhydroxyethylmethacrylat, NM ikke-modificeret, peros- peroralt, p.e. - subkutant; * * 5 - tid efter administrering af et præparat - ved dette forsøg er ovomucoidet opnået fra kalkunæg; i resten fra andeæg.

Eksempel 1, 4, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16: der anvendes porcininsulin; 10 Eksempel 2, 3: bovininsulin;

Eksempel 5, 9: humaninsulin.

Det ses klart af de anførte data, at den omhandlede opfindelse, der afviger fra det tidligere kendte ved den kemiske natur af den anvendte inhibitor for proteolytiske 15 enzymer, udviser evne til at forebygge insulinhydrolyse i den gastrointestitinale kanal og tilvejebringer penetration af insulinet i blodstrømmen. Med de omhandlede præparater, der anvendes oralt, er insulinaktiviteten i gennemsnit 60 til 70% af aktiviteten af oprindeligt insulin ved in-20 jektion.

Claims (6)

1. Insulinholdigt polymerpræparat til oral administrering af insulin omfattende en tværbundet hydrofil polymer modificeret med en inhibitor for proteolytiske 5 enzymer, insulin og vand, hvor inhibitoren for proteolyti-ske enzymer er i form ovomucoid.

2. Insulinholdigt polymerpræparat ifølge krav 1, hvori den tværbundne hydrofile polymer er udvalgt blandt homo- og copolymerer baseret på acrylsyre, methacrylsyre, acrylamid, 10 methacrylamid, hydroxyethylmethacrylat og vinylpyrrolidon.

3. Insulinholdigt polymerpræparat ifølge krav 1 eller 2, hvori koncentrationen af ovomucoid i den tværbundne . polymer er 0,2 - 25 mg/g hydrogel.

4. Insulinindholdigt polymerpræparat ifølge et eller 15 flere af kravene 1-3, der indeholder 0,01 til 3 mg insu- lin/ml vand.

5. Insulinholdigt polymerpræparat ifølge et eller flere af kravene 1-4, hvori ovomucoidet er isoleret fra hviden fra ånde- eller kalkunæg.

6. Anvendelse af ovomucoidmodificerede hydrogeler til beskyttelse af deri foreliggende insulin mod proteolyse i den gastrointestinale kanal.