DE1792043A1 - Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase - Google Patents

Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase

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asparaginase
pyrogen
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Klaus Dr Bauer
Eckart Dr Irion
Wilfried Dr Kaufmann
Erich Dr Rauenbusch
Otto Dr Wagner
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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Description

  • Verfahren zur Herstellung p##rogenfreier L-Asparaginase L-Asparaginase ist bekannt; sie kann durch Extraktion aus E. coli-Zellen gewonnen werden #f1.A. Campbell, L.T. Mashburn, E.A. Boyse, L.J. Old, Biochemistry ## (1967), Seiten 721 bis 730, dort weitere Literatur7.
  • L-Asparaginase hat in letzter Zeit Bedeutung erlangt als Heilmittel gegen solche Geschwülste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen-. Es bereitet Schwierigkeiten, L-Asparaginase von dem ihm anhaftenden Pyrogen zu reinigen. Gegenstand eines älteren Vorschlages /DBP . ... ... (Patentanmeldung P 17 67 617.427 ist ein Verfahren, dem die Erkenntnis.zugrunde liegt, daß L-Asparaginase in Gegenwart von Glykokoll eine Überraschende thermische Stabilität zeigt und deshalb von hitzeempfindlichen Proteinen getrennt werden kann.
  • In einem weiteren Vorschlag ZDBP . ... ... (Patentannieldung P 17 67 157.727 wird die isoelektrische Fällung des Enzyms L-Asparaginase in Gegenwart von Polyäthylenglykol vorge-_ schlagen. Beide Methoden der Reinigung für sich getrennt angewendet,'führen zu keiner zuverlässigen Beseitigung der in dbr L-Asparaginase vorhandenen Pyroge'ne.
  • Auch das Verfahren des deutschen Patentes . ... ... (Patentarimeldung P 17 67 389.1) erlaubt noch keine befriedigende Entfernung von Pyrogenen.
  • Es wurde nun gefunden, daß die Kombination der beiden erstgenannten Methoden und deren Modifizierung zu einer weitgehenden Befreiung der L-Asparaginase von Pyrogenen führt. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet folgende Vorteile: 1.,- Die Pyrogene lassen sich zuverlässiger als nach den bisher bekannten Methoden entfernen, 2. gleichzeitig mit der Entfernung der Pyrogene wird die spezifische Aktivität des Enzyms L-Asparaginase erheblich erhöht.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu den 0,5- bis 15 %igen Lösungen der L-Asparaginase eine Aminosäure, vorzugsweise Glycin, in Mengen von 1 bis 10 % bei Temperaturen von -10 bis +65 0 C zugesetzt. Der pH-Wert-dieser Lösung wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweck mäßig wird die Lösung sodann bei +500C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH r-,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt. Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogenfreier bzw. py.rogenarmer L-Asparaginase. BeisEiel 1 100 g Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von 100 U/mg.werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden etwa 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500C gehaltenp-das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Minute 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2 n HO1 auf pH 5,2 eingestellt und mit 50 %iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt. Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Acet6n gewaschen und getrocknet.
  • Ausbeute: etwa 35 g mit 200 bis 220 U/mg Substanz.
  • Aus der Abbildung geht der minimale Pyrogengehalt des Produktes hervor.
  • Beispiel 2 Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird die Lösung der L-Asparaginase 24 Stunden auf 60 0 C erhitzt.
  • Beis2iel Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, der pH-Wert der Lösung jedoch auf etwa 8,2 eingestellt..
  • Beispiel 4 Es wird wie in Beispiel 2 verfahren, jedoch worden nur 20 g Glycin zu der Lösung der L-Asparaginase gegeben,

Claims (1)

  1. Patentanspruch Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym in Gegenwart einer Aminosäure, vorzugsweise Glycin, bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,2 auf 40 bis 61 0 C erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschließend eine Fällung bei pH 4s5 bis 5,5 mit Polyäthylenglykol-Lösung durchführt.
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