DE1816901A1 - Verfahren zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung pyrogenarmer L-AsparaginasenInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
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Description
FARBENFABPJKENBAYERAG 18169ri
LEVERKUSEN-Bayerwerk 23. Dezember 1968
Patent-Abteilung £> ± /h^ g
Verfahren, zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen
L-Asparaginase ist bekannt; sie kann durch Extraktion aus E.coli-Zellen
gewonnen werden Ql.A. Caapbell, L.T. Ivlashburn, S.A. Boyse,
L.J. Old, Biochemistry j5 (1967), Seiten 721 bis 730, dort weitere
Literatur] .
L-Asparaginase hat in letzter Zeit Bedeutung erlangt als Heilmittel
gegen solche Geschwülste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen.
. Es bereitet jedoch Schwierigkeiten, L-Asparaginase von dem ihr anhaftenden Pyrogen zu reinigen.
Gegenstand eines älteren Vorschlages [J)BP . ... ... (Patentanmeldung
P- 17 67 617.4jJ ist ein Verfahren, dem die Erkenntnis
zugrunde liegt, daß L-Asparaginase in Gegenwart von Glycin eine überraschende thermische Stabilität zeigt und deshalb von hitzeempfindlichen
Proteinen getrennt werden kann.
Gegenstand eines weiteren älteren Vorschlages [_DBP . ... ...
(Patentanmeldung P 16 42 615.6)3 ist die fraktionierte Fällung des Enzyms L-Asparaginase mit Polyäthylenglykol. Beide
Methoden - getrennt oder vereint - führen zur Anreicherung der L-Asparaginase, wobei noch mehr oder weniger geringe Mengen
Fremdproteine verbleiben.
Es wurde nun gefunden, daß die fraktionierende Fällung, bei 40 - 60°, vorzugsweise bei 520C vorgenommen, zu einer selektive-
Le A 11 954 - ί -
009827/1869
BAD ORIGINAL
ren Anreicherung der L-Asparaginase führt. Dieses erfindungsgemSß.e
Verfahren bietet .den Vorteil einer erheblichen Verkürzung
des Reinigungsprozesses, wobei hoc&gereinigte und pyrogenarrne !-■Asparaginase
direkt anfällt.
Zur Durchfahrung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden L-Asparaginasen,
welche in einem Reinheitsgrad von ca. 0,5 bis 20 U/mg vorliegen, in eine 0,5 bis 15 1* wässrige Lösung gebracht. iia
werden etwa 3 Gewichtsprozent Glycin hinzugegeben. Der pK-V.ert
wird auf 7 bis 9 eingestellt. Die Lösung wird auf 520C erwärmt.
Das dabei nach 2 3td. ausfallende inerte J.iateriol wird abzentrifugiert
und die klare Lösung nix auf 52 0 erhitzter Lösung von
Polyäthylenglykol fraktioniert gefällt.
1 kg L-Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von ca. 3 U/mg Substanz wird in 10 Ltr. V.asser gelöst. £s werden 300 g
Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,3 eingestellt. Die Lösung wird auf +52 C gebracht und 3 3td. so belasten. Das danach
ausfallende Protein wird abzentrifugiert (6000 U/Min, über 20 Min.). Das klare Zentrifugat wird mit 20 Vol. cß>
Polyäthylenglykol-Löeung versetzt und abzentrifugiert. Danach werden weitere
50 -'/ο Folyäthylenglykol-Lösung hinzugegeben und_ erneut zentrifugiert.
Der nach Zugabe der zweiten Portion Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, erneut ca. 10 folg
im Wasser aufgenommen, wieder 3 f° mit Glycin versetzt, erhitzt
auf 520C und mit 60 $ 520G warmer Polyäthylenglykol-Lösung erneut
ausgefällt, abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Ausbeutes ca. 10g mit 210 bis 240 U/mg Substanz
Ausbeutes ca. 10g mit 210 bis 240 U/mg Substanz
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird nur auf +5O0O
erhitzt und der pH-V«ert auf 8,9 eingestellt.
Ausbeute aus 1 kg Rohasparaginase mit 3t2 U/mg Substanz:
12,0 g mit 185 U/mg Substanz.
'•Le A 11 ?34 - 2 - .
'•Le A 11 ?34 - 2 - .
009827/1669
Es wird ν;ie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird auf 550O erhitzt
und eier .pH-V.crt auf 7,5 eingestellt;.
Ausbeute aus 1 kg Rohasparaginase mit 2,8 U/mg Substanz: 9,5 g mit 193 Ό/mg Substanz.
.Le A 11 934 - 3 -
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BAD
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen» dadurch gekennzeichnet, daß jnan wässrige L-Asparaginaselösungen in Gegen wart von Glycin bei 40 - 600C, vorzugsweise bei 520C, mit PoIy-Äthylenglykol fraktioniert fällt.Le A 11 934 0 0 98 2-7 4 t-6 5 9BAD OBIGlNAU
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