DE1816901A1 - Verfahren zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen - Google Patents

Description

FARBENFABPJKENBAYERAG ^18169ri

LEVERKUSEN-Bayerwerk 23. Dezember 1968 Patent-Abteilung £> ± /h^ g

Verfahren, zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen

L-Asparaginase ist bekannt; sie kann durch Extraktion aus E.coli-Zellen gewonnen werden Ql.A. Caapbell, L.T. Ivlashburn, S.A. Boyse, L.J. Old, Biochemistry j5 (1967), Seiten 721 bis 730, dort weitere Literatur] .

L-Asparaginase hat in letzter Zeit Bedeutung erlangt als Heilmittel gegen solche Geschwülste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen.

. Es bereitet jedoch Schwierigkeiten, L-Asparaginase von dem ihr anhaftenden Pyrogen zu reinigen.

Gegenstand eines älteren Vorschlages [J)BP . ... ... (Patentanmeldung P- 17 67 617.4jJ ist ein Verfahren, dem die Erkenntnis zugrunde liegt, daß L-Asparaginase in Gegenwart von Glycin eine überraschende thermische Stabilität zeigt und deshalb von hitzeempfindlichen Proteinen getrennt werden kann.

Gegenstand eines weiteren älteren Vorschlages [_DBP . ... ...

(Patentanmeldung P 16 42 615.6)3 ist die fraktionierte Fällung des Enzyms L-Asparaginase mit Polyäthylenglykol. Beide Methoden - getrennt oder vereint - führen zur Anreicherung der L-Asparaginase, wobei noch mehr oder weniger geringe Mengen Fremdproteine verbleiben.

Es wurde nun gefunden, daß die fraktionierende Fällung, bei 40 - 60°, vorzugsweise bei 52⁰C vorgenommen, zu einer selektive-

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ren Anreicherung der L-Asparaginase führt. Dieses erfindungsgemSß.e Verfahren bietet .den Vorteil einer erheblichen Verkürzung des Reinigungsprozesses, wobei hoc&gereinigte und pyrogenarrne !-■Asparaginase direkt anfällt.

Zur Durchfahrung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden L-Asparaginasen, welche in einem Reinheitsgrad von ca. 0,5 bis 20 U/mg vorliegen, in eine 0,5 bis 15 1* wässrige Lösung gebracht. iia werden etwa 3 Gewichtsprozent Glycin hinzugegeben. Der pK-V.ert wird auf 7 bis 9 eingestellt. Die Lösung wird auf 52⁰C erwärmt. Das dabei nach 2 3td. ausfallende inerte J.iateriol wird abzentrifugiert und die klare Lösung nix auf 52 0 erhitzter Lösung von Polyäthylenglykol fraktioniert gefällt.

Beispiel 1 :

1 kg L-Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von ca. 3 U/mg Substanz wird in 10 Ltr. V.asser gelöst. £s werden 300 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,3 eingestellt. Die Lösung wird auf +52 C gebracht und 3 3td. so belasten. Das danach ausfallende Protein wird abzentrifugiert (6000 U/Min, über 20 Min.). Das klare Zentrifugat wird mit 20 Vol. ^cß> Polyäthylenglykol-Löeung versetzt und abzentrifugiert. Danach werden weitere 50 -'/ο Folyäthylenglykol-Lösung hinzugegeben und_ erneut zentrifugiert. Der nach Zugabe der zweiten Portion Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, erneut ca. 10 folg im Wasser aufgenommen, wieder 3 f° mit Glycin versetzt, erhitzt auf 52⁰C und mit 60 $ 52⁰G warmer Polyäthylenglykol-Lösung erneut ausgefällt, abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Ausbeutes ca. 10g mit 210 bis 240 U/mg Substanz

Beispiel 2:

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird nur auf +5O⁰O erhitzt und der pH-V«ert auf 8,9 eingestellt.

Ausbeute aus 1 kg Rohasparaginase mit 3_t2 U/mg Substanz:

12,0 g mit 185 U/mg Substanz.
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Es wird ν;ie in Beispiel 1 verfahren, jedoch wird auf 55⁰O erhitzt und eier .pH-V.crt auf 7,5 eingestellt;. Ausbeute aus 1 kg Rohasparaginase mit 2,8 U/mg Substanz: 9,5 g mit 193 Ό/mg Substanz.

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Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung pyrogenarmer L-Asparaginasen» dadurch gekennzeichnet, daß jnan wässrige L-Asparaginaselösungen in Gegen wart von Glycin bei 40 - 60⁰C, vorzugsweise bei 52⁰C, mit PoIy-Äthylenglykol fraktioniert fällt.

   Le A 11 934 0 0 98 2-7 4 t-6 5 9

   BAD OBIGlNAU