DE1808042A1 - Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase - Google Patents

Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase

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DE1808042A1
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asparaginase
crude
soln
pyrogen
asparagina
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Dr Alfred Arens
Dr Klaus Bauer
Dr Eckart Irion
Dr Wilfried Kaufmann
Dr Erich Rauenbusch
Dr Otto Wagner
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Bayer AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)

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Description

  • Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase L-Asparaginase ist bekannt; sie kann durch Extraktion aus E. coli-Zellen gewonnen werden /H. A. Campbell, L. T. Mashburn, E. A. Boyse, L. J. Old, Biochemistry 6 (1967), Seiten 721 bis 730, dort weitere Literatur7.
  • L-Asparaginase hat in letzter Zeit Bedeutung erlangt als Heilmittel gegen solche Geschwiliste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen. Es bereitet Schwierigkeiten, L-Asparaginase von dem ihm anhaftenden Pyrogen zu reinigen. Gegenstand eines älteren Vorschlages t§BP . ... ... (Patentanmeldung P 17 67 617.4l7 ist ein Verfahren, dem die Erkenntnis zugrunde liegt, daß L-Asparaginase in Gegenwart von Glykokoll eine überraschende thermische Stabilität zeigt und deshalb von hitzeempfindlichen Proteinen getrennt werden kann.
  • In einem weiteren Vorschlag /§EP . ... ... (Patentanmeldung P 17 67 157.7)7 wird die isoelektrische Fällung des Enzyms L-Asparaginase in Gegenwart von Polyäthylenglykol vorgeschlagen. Beide Methoden getrennt oder vereint fuhren zu keiner zuverlässigen Beseitigung der in der L-Asparaginase noch restlich vorhandenen Fremdproteine.
  • Es wurde nun gefunden, daß die Kombination der beiden erstgenannten Methoden unter Zusatz von 4 bis 40 %, vorzugsweise 10 %, eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, zu einer weitgehenden Denaturierung der Fremdproteine führt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren bietet folgenden Vorteil: Beseitigung schwer zu entfernender inerter Begleitproteine der L-Asparaginase, welchen eine hohe antigene Wirkung zugeschrieben wird.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden L-Asparaginasen, vorzugsweise solche, die mit Polyäthylenglykol bis zu einem Reinheitsgrad von etwa 160 bis 220 U/mg gebracht worden sind, in eine 0,5- bis 15die wäßrige Lösung gebracht. Es werden z. B. 10 Vol.- Methanol und etwa 3 GewO< Glycin hinzugegeben. Der pH-Wert wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweckmäßig wird die Lösung dann bei +50°C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt, Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogen freier bzw. pyrogenarmer L-Asparaginase.
  • Beispiel 1 100 g L-Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von 100 U/mg werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden 100 ml Methanol und 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500C gehalten, das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Minute 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2 n HCl auf pH 5,2 eingestellt und mit 50-%iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt. Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet.
  • Ausbeute: etwa 33 g mit 200 bis 235 U/mg Substanz.
  • Beispiel 2 Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch werden 200 ml Methanol zugesetzt.
  • Beispiel 3 Es wird wie in Beispiel 1 verfahren, jedoch werden der Lösung 100 ml Ethanol zugesetzt.

Claims (1)

  1. Patentanspruch
    Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzym in Gegenwart eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,2 auf 40 bis 610c erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschließend eine Fällung bei pH 4,5 bis 5,5 mit Polyäthylenglykol-Lösung durchfUhrt.
DE19681808042 1967-12-27 1968-11-09 Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase Pending DE1808042A1 (de)

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