DE1767654A1 - Verfahren zur Gewinnung von Isoamylase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Isoamylase

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DE1767654A1 DE19681767654 DE1767654A DE1767654A1 DE 1767654 A1 DE1767654 A1 DE 1767654A1 DE 19681767654 DE19681767654 DE 19681767654 DE 1767654 A DE1767654 A DE 1767654A DE 1767654 A1 DE1767654 A1 DE 1767654A1
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Yoshinori Sato
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description

Patentanwälte
8000 Mönchen 22
Hayashibara AG 29. Mai 1968
Okayama / Japan SJ/Hu
hao 7013
Verfahren zur Gewinnung von Isoamylase
Gegenstand der Erfindung ist die Gewinnung hochaktiver Isoamylase im technischen Maßstabe.
Isoamylase (auch Pullulanase genannt), das bekanntlich eine spezifische Hydrolyse der Alpha-1,6-Bindung an der verzweigten Stellung von Stärke katalysiert, kann nach Bender u. Mitarb, in Form einer hochaktiven Enzymlösung aus der Kultur eines Stammes von Aerobacter aerogenes unter Verwendung von anorganischen oder organischen Stickstoffverbindungen als
*) Stickstoffquelle gewonnen und insbesondere aktiviert werden.
Gemäß dem bekannten Verfahren impft man Kulturmedien der in der Tabelle I angegebenen Zusammensetzung mit Aerobacter aerogene* und erhält einen Kulturstamm, der 10 bis 20 Einheiten/ml Isoamylase erzeugt. Aber diese Methode ist für technische Zwecke, d.h. zur Gewinnung größerer Mengen Isoamylase nicht anwendbar.
*) alt Maltose, Maltotriose und Pullulan
109839/1317 "*"2
Tabelle I
K2HPO4 MgSO4.7H2O KOl
0,3 % 0,5
0,1 0,1
0,05 0,05
0,05 0,05
0,001 0,001
0,8 0,5
- 0,8.
Maltose Pepton
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende-Auf gäbe besteht in der Entwicklung eines vereinfachten Verfahrens zur Gewinnung hochaktiver Isoamylase aus einer ergiebigen Kultur von Aerobacter aerogenes in einer weit höheren Ausbeute und Menge als bisher möglich.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, wenn erfindungsgemäß in der Kultur
(a) als Kohlenhydratquelie verflüssigte Stärke und als Stiokstoffquelle Ammoniumsalze verwendet werden und
(b) ein pH-Wert zwischen 5 und 8 eingehalten wird.
Als Ammoniumsalze verwendet man vorzugsweise Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumohlorid und Ammonium acetat, als verflüssigte Stärke insbesondere eine solche mit 5 bis 20 D.E. (Verflüssigungsgrad in #) in Mengen Von 1 bis des Kulturmediums. Unter "verflüssigte Stärke" wird eijie
109839/1317
Lösung verstanden, die durch kontinuierliche Verflüssigung einer Kartoffelstärke-Emulsion mit einem pH von etwa 6 bei 88°0 mit Alpha-Amylase erhalten war.
Der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wird während der Kultivierung durch die Vergrößerung der Phosphatkonzentration im Kulturmedium oder noch mehr durch die Beigabe von Alkali stoffen, z.B. von NaOH1- (NH^)2CO5, Na2OS5 oder OaCO5, zur Kulturflüssigkeit zu Beginn der Kultur oder während ihres Verlaufs oberhalb 5 gehalten.
Erfindungsgemäß wird ein Stamm Aerobacter aerogenes primär auf einer Streifenkultur gezüchtet und dann mit der erhaltenen Kultur mittels einer Platinöse ein üblicherweise sterilisiertes Medium geimpft.
Die Bestimmung der Enzymaktivität wurde in den nachstehenden Beispielen wie folgt durchgeführt:
Eine Reaktionsmischung mit einem pH 6,0, bestehend aus Enzymlösung 1 ml
1# klebrige Reisstärkelösung 5 ml O,5M-Acetatpufferlösung 1 ml
wurde bei 4O0O 30 min inkubiert. 0,5 ml des Reaktionsgemisches vermischte man mit 0,5 ml einer 0,01 M-Jodlösung und
bei 15 ml Wasser und bestimmte nach 15 min die Absorption/einer
109839/1317
Wellenlänge von 610M, wobei die Enzymaktivität ssur Änderung der Absorption um 0,1 mit 10 Einheiten angenommen würde.
Beispiel 1 t
Eine Streifenkultur der Zusammensetzung:
Pepton 1,0 %
Hefeextrakt 0,5
MgS04*7H20 0,05
KOl 0,05
FeSO4.7H2O 0,001
Maltose 1,0
wird mit Aerobacter aerogenes geimpft und der erhaltene Stamm h kultiviert; diese Kultur wird auch in den folgenden Beispielen verwendet.
Ein in einen 500 ml fassenden konischen Kolben üblicherweise sterilisiertes Medium der Zusammensetzung
K2HPO4 0,7 %
(NH4)2S04 0,4
KH2PO4 0,3
MgSO4.7H2O 0,05
KOl 0,05
PeSO4.7H2O 0,001
Maltose, lösliche oder verflüssigte Stärke 1,4
109839/131 7
wird mittels einer Platinschlinge mit der oben erhaltenen Keimkultur geimpft und das Gemisch bei 300O 40 h kultiviert, Danach warden der pH-Wert, die Absorption und die Enzymaktivität der Lösung bestimmt. Die in Abhängigkeit von der als Substrat angewandten Kohlenhydratquelle erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengestellt.
Tabelle II P1H Absorption Enzymaktivität
Einheiten/ml
7,80 0,500 I
35
Kohlehydrat-öubstrat 6,90 0,570 39
lösliche Stärke 7,70 0,520 138
Maltose
verflüssigte Stärke
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die Verwendung vefflüssigter Stärke im Kulturmedium zur Gewinnung einer Amylase besonders gute Ergebnisse bringt.
Beispiel
Die folgerjden Kulturmedien A, B und 0, von denen jedes eine
andere Stickstoffquelle enthält, wird gemäß Beispiel 1 kuljiti-
viert (dtjf pH-Wert des Kulturmediums 0 ist mit Alkali auf 3
eingestellt.
109839/1317
Kulturmedium A B % 0
Pepton t,o % - -
flüssige Maisaufquellung - 3 05 -
Hefeextrakt 0,5 - 05 -
MgSO4.7H2O 0,05 ο, 001 0,05 %
KOl 0,05 ο, 0,05
FeSO4.7H2O 0,001 ο, 0,001
NH4NO3 - - 0,48
K2HPO4 - - 0 0,7
KHpPO^, - - 0,3
verflüssigte Stärke 1,0 1,0
Die Ergebnisse zeigt die Tabelle III.
Tabelle III
Kulturmedium pH Absorption * Enzymaktivität
Einheiten/ml
A
B
σ 		7,65
8,40
7,00		 0,440-
0,400
0,365		 40
25
70
Beispiel 3:
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch unter Änderung der Stickstoffquelle sowie deren Mengen und Anwendung von 1,4% verflüssigter Stärke als Kohlenstoffquelle und kultivieret
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25 h bei 30 0. Die Ergebnisse sind aus Tabelle IV zu entnehmen.
Tabelle IV
Stickstoffquelle Menge pH Absorption Enzymaktivität
Einheiten/ml
Harnstoff 0,172 7,40 0,015 0
Harnstoff 0,344 7Λ5 0,017 0
Mai saufquellung 3,0 6,45 0,325 5
NaNOx
5		 0,485 7,20 0,015 0
NaNO, 0,970 6,98 0,120 2
NH,, NO,
4 5		 0,230 6,82 0,400 5
NH,, NO,
4 5		 0,460 6,75 0,420 20
NH.NO,
4 5		 0,920 6,48 0,530 20
(NH^)2HPO4 * 0,40 6,0 0,210 30
NH,, OCOCH, *
4 0 		0,60 8,8 0,222 80
♦) Kulturdauer 72 h.
Die Tabellen III und IV zeigen, daß die Anwendung von Ammoniumsalzen als Stickstoffquelle, und zwar in Mengen von über etwa 0,2%,besonders günstig ist.
Beispiel 4i
Es wird gemäß Beispiel 1 gearbeitet, jedoch 0,48% NH^NO,
statt (BH
1,4·% verflüssigte Stärke verschiedenen
', 109839/1317
• · .8
Verflüssigungsgrades (D.E.-Wertes) verwendet und 55 h 3O0G kultiviert. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle V.
Tabelle V.
verflüssigte Stärke
D.E.		 pH Absorption Enzymaktivität
Einheiten/ml
3,5 7,70 0,380 25
5,7 7,90 0,400 100
7,2 8,40 0,410 100
12,0 8,01 0,555 50
16,0 7,60 0,560 40
Aus der Tabelle V ergibt sich, daß verflüssigte Stärke mit einem D.E.-Wert von etwa 5 bis etwa 10 als Kohlenstoff quelle im Kulturmedium die günstigsten Ergebnisse bringt.
Beispiel 5:
Unter den Bedingungen gemäß Beispiel 1 wird die Beziehung zwischen der<als Kohlenhydratquelle benutzte»Menge anVverflüssigter Stärke und der Isoamylase-Aktivität geprüft. Die Ergebnisse zeigt Tabelle VI.
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Tabelle VI
Menge
Stärke		 an verflüssigter Absorption Enzymaktivität
Einheiten/ml
1,0 0,356 71-
1.2 0,502 87
1,4 0,610 138
1,6 0,610 130
2,0 0,620 130
Bender u. Mitarb, hatten festgestellt, daß "bei Verwendung von Maltose als Kohlenstoffquelle die Isoamylase-Aktivität Ms 0,8% der verwendeten Maltosenmenge anwächst. Aus dem Beispiel 5 läßt sich ersehen, daß bei Anwendung verflüssigter Stärke als Kohlenstoff quelle die Isoamylase-Aktivität bis zu 1,4·% der Menge an verflüssigter Stärke ansteigt.
Beispiel 6i
Man arbeitet nach Beispiel 1 und benutzt an Alkalistoff in der Kulturflüssigkeit einerseits JaaAagmg■■ Ίιas ■rnlki 0,5% Oalciumcarfaonat im Anfangsabschnitt der Kultivierung, andrer- eeits Natriumhydroxid während der Kultivierung und vergleicht nach 48 h seit Beginn der Kultivierung die Enzymaktivitäten. Pie Ergebnlese sind in der Tabelle VII wiedergegeben.
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...10
- ίο -
Tabelle VII
Alkali Absorption pH Enzymaktivität
Einheiten/ml
OaCO,
NaOH		 0,520
0,480		 7,^0
7,20		 79
190
Ferner wurde die zu kultivierende Kulturflüssigkeit in einem FlaschenfermeBltor einem Kultivierungstest unterzogen, wobei sich ergab, daß die Isoamylase erzeugende Kultur so stark durch Lüftung beeinträchtigt wird, daß zur Lüftung Luft volumenmäßig höchstens zu einem Viertel der benutzten Kulturflüssigkeit angewandt werden darf.
Beispiel 7:
Eine Streifenkultur der Zusammensetzung
Pepton 1,0%
Hefeextrakt 0,5
MgSO4.7H2O 0,05
KOl 0,05
FeSO^. 7H2O 0,001
Haitose 1,0
wird mit Aerobacter aerogenes geimpft und der Stamm in einer Primärkultur bei 500C 20 h kultiviert. Dann wird die Kultur mittels einer Platinöse einem wie gewöhnlich sterilisierten flüssigen Medium eingeimpft, wobei dieses Medium wie folgt
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zusammengesetzt ist:
(NH4)2S04 0,4%
K2HPO4
KH2PO4
MgSO4.7H2O		 0,7
0,3
0,05
KCl 0,05
Fe2SO4.7H2O 0,001
verflüssigte Stärke
(D.E. - 7,2)		 . 1,4
Die Kultivierung erfolgte bei einem pH von 5 bis 7 bei 30°C im Laufe von 48 h. Die erzielte Aktivität der erhaltenen Isoamylase betrug 138 Einheiten/ml.
Beispiel 8t
Unter Benutzung der Arbeitsweise nach. Beispiel 7 wird Natriumhydroxid während der Kultivierung zugegeben und bei einem pH zwischen 5 his 7 48 h kultiviert. Die erzielte Aktivität der Isoamylase betrug 190 Einheiten/ml.
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Claims (3)

ll^.'T.N u. LUYKEN &;;.; !■- - v-e-. 2 2 /& 29. Hai 1963 SJ/Hu hao 7013 Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Isomylase aus der Kultur eines ergiebigen Stammes von Aerobacter aerogenes, dadurch gekennzeichnet, daß in der Kultur
(a) als Kohlenhydratquelle verflüssigte Stärke und
als Stickstoffquelle Ammoniumsalze angewandt werden und
(b) ein pH-Wert zwischen 5 undß eingehalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Ammoniumsalze Ammoniumnitrat, -sulfat, -phosphat, -Chlorid und -acetat angewandt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine verflüssigte Stärke mit 5 bis 10 D.E.angewandt wird.
109839/1317
DE19681767654 1967-06-01 1968-05-31 Verfahren zur Herstellung hochaktiver Isoamylase Expired DE1767654C3 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3446867 1967-06-01
JP3446867 1967-06-01

Publications (3)

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DE1767654A1 true DE1767654A1 (de) 1971-09-23
DE1767654B2 DE1767654B2 (de) 1976-01-29
DE1767654C3 DE1767654C3 (de) 1976-09-09

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GB1233743A (de) 1971-05-26
US3622460A (en) 1971-11-23
DE1767654B2 (de) 1976-01-29

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