DE1642598B2

DE1642598B2 - Züchten von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1642598B2
Application number: DE1968B0096575
Authority: DE
Inventors: Frederic Barat; Aime Belot
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1967-02-15
Filing date: 1968-02-09
Publication date: 1979-04-19
Also published as: NL6802050A; DE1642598C3; FR1554353A; BE710814A; DE1642598A1

Description

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf Kohlenwasserstoffmaterialien in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und Sauerstoff, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Kohlenwasserstoffmaterial Methan und ein Gemisch von Methan verzehrenden Bakterien einsetzt, wobei in dieser Mischung wenigstens ein Bakterienstamm vorliegt, dessen Zellen kleiner als die Zellgröße eines zweiten Bakterienstammes im Mikroorganismengemisch sind, daß man das Produkt der so Kultivierung kontinuierlich aus der Kultivierungsstufe abzieht und mit oder ohne Zwischenbehandlung eine den großen Mikroorganismus und den kleinen Mikroorganismus enthakende Fraktion zentrifugiert und dabei eine Zentrifugierfraktion erhält, in der das Zahlenverhältnis des Bakterienstammes mit den größeren Zellen zum Bakterienstamm mit den kleineren Zellen größer als das entsprechende Zahlenverhältnis in der Kultivierungsstufe ist, und wobei weiterhin aus der Zentrifugierungsstufe eine Zentrifugierkreislauffrak- t>o tion gewonnen wird, die den Bakterienstamm mit den kleineren Zellen enthält, wobei wenigstens ein Teil dieser zentrifugierten Kreislauf fraktion mit oder ohne Zwischenbehandlung in die Kultivierungsstufe zurückgeführt wird.

Durch die erfindungsgemäße Arbeitsweise ist es möglich, die Vorteile zu erzielen, die in der Symbiose von zwei Stämmen von Mikroorganismen liegen, wobei jedoch nur ein Mikroorganismus gewonnen wird, der sich durch Zentrifugieren abscheiden läßt. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen insbesondere darin, daß es gelingt, das Wachstum des Bakterienstammes mit größeren Zellen optimal zu fördern Und damit diesen Bakterienstamm als Ernteprodukt zu gewinnen. Der in Symbiose mitwachsende und im Kreislauf rückgeführte Bakterienstamm mit. kleineren Zellen begünstigt das Wachstum des größeren Stammes in vielfacher Weise. Die Wachstumsgeschwindigkeit und die Ausbeute des größeren Stammes werden erhöht bzw. verbessert. Es zeigt sich, daß das Kulturmedium eine erhöhte Resistenz gegen Infektionen aufweist. Die Schaumbildung bei der Wachstumsstufe wird herabgesetzt. Offenbar verzehren die kleineren Stämme schaumbildende Stoffwechselprodukte aus dem Wachstum des größeren Mikroorganismus. Für die praktische Durchführung eines Verfahrens, bei dem zwei Gasströme — nämlich Methan und sauerstoffhaltiges Gas - eingesetzt werden, ist dieses von besonderer Bedeutung.

Der Bakterienstamm mit den größeren Zellen hat vorzugsweise einen mittleren Zellendurchmesser im Bereich von 1 bis 3 μ, während der mittlere Zellendurchmesser des Bakterienstammes mit den kleineren Zellen vorzugsweise geringer ist als 1 μ.

Natürlich können Gemische von Mikroorganismen verwendet werden, die mehrere Bakterienstämme der einen Art und/oder mehrere Stämme der anderen Art enthalten.

Das Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial ist Methan.

Die hier genannten Bakterien sind nach dem Klassifizierungssystem eingeteilt, das in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« von R.S.Breed, E.G.D. Murray und N.R. Smith, herausgegeben von Williams und Wilkins (Baltimore, USA), 7. Auflage 1957, beschrieben ist.

Zu den vorstehend genannten Bakterien mit größeren Zellen, die sich zur Symbiosekultür auf Methan eignen, gehören Mikroorganismen der Ordnung Pseudomonadales. Zweckmäßig hiervon sind Mikroorganismen der Familie Pseudomonadaceae, insbesondere der Gattung Pseudomonas. Eine sehr gute Spezies ist Pseudomonas methanica.

Zu den vorstehend genannten Bakterienstämmen mit kleineren Zellen, die sich für die Symbiosekultur auf Methan eignen, gehören Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales. Zweckmäßig hiervon sind Mikroorganismen der Familie Mycobacteriaceae, insbesondere der Gattung Mycobacterium. Sehr gute Spezies sind Mycobaterium sp. und M. methanicum.

Für das Wachstum der Mikroorganismen sind außer dem Einsatzmaterial ein wäßriges Nährmedium und Sauerstoff, am besten in Form von Luft, erforderlich.

Ein typisches Nährmedium für das Wachstum von Nocardia hat die folgende Zusammensetzung:

-7H₂O

(NHJ₂SO₄
MgSO₅"
FeSO₄ 7H₂O
MnSO₄ H₂O
KH₂PO₄

NaHPO₄ 12H₂O
CaCl₂
Na₂CO₃
Hefeextrakt

Ig

0,20 g
0,05 g
0,002 g
2g
3g
0,1g
0,1g
0,008 g

Destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml).

Für andere Bakterien kann ein Medium der folgenden Zusammensetzung verwendet werden:

KH₁PO₄	7g
MgSO₄-7H₂O	0,2 g
NaCI	0,1g
NH₄Cl	2,5 g
Leitungswasser (Spurenelemente)	100 ml
Hefeextrakt	0,025 g

Destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml).

Ein weiteres geeignetes Nährmedium für die Kultivierung von Bakterien hat die folgende Zusammensetzung:

NH₄Cl 0,5 g

NaCl 4 g

MgSO₄ 0,5 g

Na₂HPO₄ 0,5 g

KH₂PO₄ 0,5 g Wasser zur Auffüllung auf 1000 mi.

Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Kulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrakts oder essentielle Nutrilite zusetzt. Zu den essentiellen Nutriliten gehören Biotin, Pantothensäure, Nicotinsäure, Thiamin, Inosit und Pyridoxin. Die zugesetzte Menge des Hefeextraktes liegt am besten in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million. Die erforderliche Menge jedes Nutriliten liegt zwischen etwa 0,1 Teilen pro Million für Biotin und etwa 10 Teilen pro Million für Inosit.

Das wäßrige Nährmedium in jedem Fermenter wird zweckmäßig beim gewünschten pH-Wert gehalten, indem ein wäßriges Medium von hohem pH-Wert stufenweise oder kontinuierlich zugesetzt wird.

Die optimale Temperatur des Kultivierungsgemisches ist verschieden je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis 35° C.

Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum des Mikroorganismus wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt.

Günstige Verfahren für die Kultivierung der Mikroorganismen und für die Abscheidung des Produkts sind z. B. in den britischen Patentschriften 914567 und 914568, in den DE-OSen 1545238, 1545239, 1517 736 und 1545 252, in der DE-AS 1442 212 sowie in den DE-PSen 1470507 und 1442070 beschrieben.

Beispiel

_5 Die folgenden Mikroorganismen wurden gemäß der Erfindung als Symbiosekultur gezüchtet: a) Ein Stamm der Spezies Pseudomonas methanicum mit einem mittleren Durchmesser von 3 μ und

ίο b) ein Stamm der Spezies Mycobacterium methanicum mit einem mittleren Durchmesser von 1 μ. Ein Impfmaterial wurde in einer 2-1-Charge in einem mit Rührwerk versehenen Fermenter gezüchtet. Nach 72 Stunden betrug die Zelldichte 3,5 g/l. Dieses Impfmaterial wurde in einen mit Leitblechen und Rührwerk versehenen 20-1-Ferrnenter überführt, der kontinuierlich in Gegenwart eines Kulturmediums betrieben wurde, das bei Zuführung zum Fermenter die folgende Zusammensetzung hatte, wobei die Ver-λ» dünnungsrate 0,05 betrug:

(NH₄J₂SO₄ 1 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,2 g/l

FeSO₄-7H₂O 0,005 g/l

MnSO₄ H₂O 0,002 g/I

KH₂PO₄ 2 g/l

Na₂HPO₄ 12H₂O 3 g/l

CaCl₂ 0,1 g/l

Hefeextrakt 0,008 g/l

jo Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml.

Dem Fermenter wurde ein Gasgemisch, das 20 Vol.-% Methan und 80Vol.-% Luft enthielt, in einer Menge von 10 V/V/Stunde zugeführt. Der Mi-

J5 kroorganismus bestand in dieser Kultivierungsphase aus einem Gemisch von 15% des kleineren Mikroorganismus (Trockengewicht) und 85% des größeren Mikroorganismus.

Durch Zentrifugieren wurden pro Liter 3 g des Mi-

kroorganismus vom Kulturmedium abgetrennt. Diese Produktfraktion bestand zu 90% aus großen Mikroorganismen und zu 10% aus kleinen Bakterien (Trockengewicht). Die im Kreislauf geführte Fraktion enthielt pro Liter 0,2 g Zellen, die sich aus 90% kleinen Bakterien und aus 10% großen Mikroorganismen (Trockengewicht) zusammensetzten. Durch die im Kreislauf geführte Fraktion wurde eine ständig erneute Impfung bewirkt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf Kohlenwasserstoffmaterialien in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und Sauerstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoffamterial Methan und ein Gemisch von Methan verzehrenden Bakterien einsetzt, wobei in dieser Mischung wenigstens ein Bakterienstamm vorliegt, dessen Zellen kleiner als die Zellgröße eines zweiten Bakterienstammes im Mikroorganismengemisch sind, daß man das Produkt der Kultivierung kontinuierlich aus der Kultivierungsstufe abzieht und mit oder ohne Zwischen- '⁵ behandlung eine den großen Mikroorganismus und den kleinen Mikroorganismus enthaltende Fraktion zentrifugiert und dabei eine Zentrifugierfraktion erhält, in der das Zahlenverhältnis des Bakterienstammes mit den größeren Zellen zum -° Bakterienstamm mit den kleineren Zellen größer als das entsprechende Zahlenverhältnis in der Kultivierungsstufe ist, und wobei v/eiterhin aus der Zenirifugierungsstufe eine Zentrifugierkreislauffrakiion gewonnen wird, die den Bakterienstamm mit den kleineren Zellen enthält, wobei wenigstem; ein Teil dieser zentrifugierten Kreislauffraktion mit oder ohne Zwischenbehandlung in die Kultivierungsstufe zurückgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- μ kennzeichnet, daß man als Bakterienstamm mit den größeren Zellen einen solchen mit einem mittleren Zellendurchmesser im Bereich von 1 bis 3 Mikron und als Bakterienstamm mit den kleineren Zellen einen solchen mit einem mittleren ZeI- κ lendurchmesser unter 1 Mikron einsetzt.