DE1620553A1 - Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5'-phosphaten - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

(COLN 1, DEICHMANNHAÜS

18. Juni 1966 Fu/bz

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27» 2-chome, Doshomachi, Higashi-ku, Os a k a (Japan)

Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5¹-phosphaten

Die Erfindung betrifft ein neues und technisch wertvolles Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5¹-phosphaten. Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Ribonucleoside mit Boroxyd umsetzt, das dabei anfallende Produkt mit einem Phosphorylierungsmittel zur Reaktion bringt und anschließend das phbsphorylierte Produkt hydrolysiert .

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5 '-phosphaten aus den entsprechenden Ribonucleosiden ar beiten in der Weise, daß man zunächst die 2'- und 5'-Hydroxyl- ' gruppen des Riboseanteils mit Acylgruppen oder der Isopropylidengruppe blockiert und daraufhin die freie 5'-Hydroxylgruppe mit einem geeigneten Mittel phosphoryliert. Anschließend werden dann die schützenden Gruppen entfernt und der in 5'-Stellung eingeführte Rest der Hydrolyse unterworfen.

In den bisher bekannten Verfahren ist es jedoch notwendig, vergleichsweise umständliche Verfahren für die Entfernung der blockierenden Gruppen einzusetzen. Sind diese beispiels-

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weise Acylreste, dann muß zu ihrer Entfernung ein Verfahren unter Verwendung von methanolischem Ammoniak zur Verwendung kommen, während im Fall der-Isopropylidengruppe zu deren Entfernung das Erhitzen des phosphorylierten Produktes unter sauren Bedingungen notwendig ist. Diese Verfahrensschritte sind dabei nicht nur umständlich, sondern geben dazu eine verhältnismäßig niedrige Ausbeute an Ribonucleosid-5¹ -Phosphaten. Sie sind daher aus dem Gesichtspunkt der technischen Verwendung unvorteilhaft und es sind viele Versuche gemacht worden, die geschilderten Schwierigkeiten und Nachteile zu überwinden. Bisher hat jedoch keiner dieser Versuche - wenigstens aus der Sicht der großtechnischen Produktion - vollständig befriedigt.

Von dieser Aufgabenstellung ausgehend, ist nun gefunden worden, daß die 3¹- und 2^f-0H-Gruppen von Ribonucleosiden leicht durch Umsetzung mit Boroxyd geschützt werden können, und daß ein derart blockiertes Ribonucleosid selektiv in der 5¹ -OH-Gruppe phosphoryliert werden kann. Wenn ein derart phosphoryliertes Produkt anschließend der Hydrolyse unterworfen wird, um einen in der 5'-Stellung eingeführten Rest - beispielsweise den Rest

in den entsprechenden PhosphorsKurerest

umzuwandeln, so werden die Schutzgruppen leicht dabei entfernt, ohne daß eine spezielle Behandlung für deren Entfernung notwendig wäre. Auf diesen Erkenntnissen baut das erfindunga-

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gemäße, neue Verfahren auf.

Gemäß der Erfindung ist die Herstellung von Ribonucleosld-5*-phosphaten in guten Ausbeuten möglich, und zwar durch einfache Hydrolyse des bei der selektiven Phosphorylierung anfallenden Produktes, ohne die Notwendigkeit einer spezifischen Behandlung für die Entfernung der vorher eingeführten Schutzgruppen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit aus dem Gesichtspunkt der industriellen Verwertung den bekannten vergleichbaren Verfahren unter Blockierung der 2¹- und J¹-Stellungen des Riboseanteils überlegen. -

Als Ribonucleoside können im erfindungsgemäßen Verfahren solche eingesetzt werden, die Purinbasen {z.B.Adenosin, Guanosin, Inosin usw.) Pyrimidinbasen (z.B. üridin, Cytidin, oder Pyridinbasen (z.B. Nikotinsäureamidribonucleosid usw.) enthalten. Dabei ist es gleichgültig, ob diese natürlichen oder synthetischen Ursprungs sind.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst Boroxyd mit einem Ribonucleosid umgesetzt. Vorzugsweise werden dabei etwa 1 bis etwa 5 Mole Boroxyd je Mol Ribonucleosid verwendet. Die Umsetzung kann bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen durchgeführt werden» In der Regel werden Temperaturen von etwa j50 bis 80°C bevorzugt.

Die Umsetzung kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Lösungsmitteln erfolgen. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln ist in der Regel vorzuziehen. Jedes Lösungsmittel kann verwendet werden, solange es nicht den Reaktionsablauf hindert. Beispiele für verwendbare Lösungsmittel sind Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Äthylenglykol usw., Ketone, z.B. Aceton, Methylethylketon usw., cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe, ζ. B. Dioxan, Tetrahydrofuran, Hexan usw.,

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Phenole, ζ. B. Phenol, Naphthol, Kresol, o-Chlorphenol, Thymol, Xylenol usw., halogenierte Kohlenwasserstoffe, ζ. B. Tetrachlorkohlenstoff, Säureamide, z.B. Dimethylformamid, Ester, z.B. Kthylacetat, Butylaeetat usw., organische Basen. z.B. Pyridin, Collidin usw. sowie auch Gemische solcher Verbindungen.

Bevorzugt werden als Lösungsmittel phenolische Verbindungen eingesetzt.

Das Lösungsmittel wird,zweckmäßigerweise in Mengen eingesetzt, die zur Auflösung des Reaktionsgemisches ausreichen, wobei in der Regel etwa 5 bis iO Mole Lösungsmittel je Mol Ribonucleosid ausreichen.

Erfindungsgemäß wird dann das anfallende Produkt entweder nach seiner Isolierung oder auch ohne es zu isolieren der Phosphorylierung unterworfen. Die Phosphorylierung wird durch Umsetzung mit einem Phosphorylierungsmittel bewirkt. Als Phosphorylierungsmittel können beispielsweise Phospharoxychlorid, Phosphortrichlorid, deren Hydrolysate, die durch Mischen von Wasser und der jeweiligen Phosphorverbindung erhalten worden sind, Phosphorpenthachlorid, Tetrachlorpyrophosphorsäure usw. eingesetzt werden.

Die Menge des Phosphorylierungsmittels sollte nicht weniger als etwa 1 Mol, bezögen auf das Ribonucleosid, betragen. In der Praxis kann man etwa 1 bis 20 Mole des Phosphorylierungsmittels, bezogen auf das Ribonucleosid, einsetzen.

Die Phosphorylierung kann in Gegenwart oder in Abwesenheit von Lösungsmitteln erfolgen, auch hier wird es jedoch bevorzugt, die Umsetzung in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln durchzuführen. Auch hler kann jedes Lösungsmittel verwendet werden, sofern es nicht den erwünschten Reaktionsablauf hindert. Geeignete Lösungsmittel für die Phosphorylierung sind beispielsweise Ketone, z.B. Aceton, Nethylethyl-

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keton usw., cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Dioxan, Tetrahydrofuran, Hexan, usw.. Phenole, z. B. Phenol, Naphthol, Kresol, o-Chlorphenol, Thymol, Xylenol usw., halogenierte Kohlenwasserstoffe, z.B. Tetrachlorkohlenstoff, Säureamide, z.B. Dimethylformamid} Ester, z. B. Äthylacetat, Butylacetat usw., organische Basen, z. B. Pyridin, Aldehydcollidin usw. und Gemische hiervon.

Die Temperatur der Phosphorylierungsstufe liegt in der Regel zwischen etwa O und 60°C. Bevorzugt wird bei Temperaturen zwischen etwa 5 und 25°C gearbeitet.

Erfindungsgemäß können die Blockierungsreaktion und die Phosphorylierung auch in einer Verfahrensetufe durchgeführt werden, beispielsweise derart, dad man ein Gemisch von Ribonucleosid, Boroxyd und einem Phosphorylierungsmittel bei etwa 5°C über mehrere Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit eines Lösungsmittels rührt. Das so gewonnene phosphorlyierte Produkt wird anschließend hydrolyiert_e Diese Verfahrensstufe kann in bekannter Weise durchgeführt werden, beispielsweise dadurch, daß man das Reaktionsprodukt in Wasser oder in ein Wasser -· vorzugsweise kaltes Wasser enthaltendes organisches Lösungsmittel eingießt, oder auch durch Einstellung des p_H-W®rfcs des Reaktionsgemisches auf den schwach sauren Bereich, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 2 durch Zusatz von Alkalien, z.B« Hati?liira~ hydroxyd, Kaliumhydroxyd, NatriumearboBafe und Mhnlloh® Verbindungen. Auf diese Weise wird das gewünscht® Hifeo» nucleosid-5¹-phosphat gewonnen.

Das Endprodukt des Verfahrens, d. h. Phosphat kann, aus dem Rösktia*iegemisQh In laeksni^ter gewonnen werden. Beispiele hierfür sind Adsorptionsverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschharz®!! oder Aktivkohle oder auch KrtetallisatioBsverfahren u?it@r- Gewinnung in Balz-

form, beispielsweise als Natriumsalz, Kaliumsalz, Bariumsalz, Aminosäuresalz usw.

Das gewünschte Ribonucleosid-5¹ -Phosphat kann leicht in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten werden.

Beispiel 1

Ein Gemisch von 3 g 2-Chlorinosin und 0,9 g Boroxyd wird auf 5°C gekühlt. Zu diesem Gemisch werden 20 ml Tetrachlorpyrophosphorsäure gegeben. Das Gemisch wird bei 5°C für 3 Stunden gerührt. Das anfallende Reaktionsgemisch wird durch Eingießen in eine 1-normale wässrige Lösung von Natriumhydroxyd auf einen p_H-Wert von 2 eingestellt und dann der Adsorption an einer Aktivkohlesäule unterworfen. Die Säule wird mit 50 ml Wasser gewaschen und dann mit 100 ml eines Gemisches aus Äthanol, 28 tigern wässrigem Ammoniak und Wasser (Volumenmischungsverhältnis 50 : 2 : 48) eluiert. Das Eluat wird aufkonzentriert. Eine Analyse des Konzentrats durch Papierelektrophorese in einem Citrat-Puffer bei p™ 5,8 zeigt, daß das 2-ChIOrInOsIn-S¹-phosphat in einer Ausbeute von 80 % gebildet worden ist. Zu dem Konzentrat wird ein Gemisch von Bariumacetat und Äthanol gegeben. Hierbei fällt das Bariumsalz des 2-Chlorinosin-5'-phosphats al» farbloses Pulver an. Die Ausbeute beträgt 3,9 g (berechnet als Anhydrid).

llementaranalyse als C₁₍^i_l00gN^ClPBa · 5HgO

Bereehnets C 19.7*1 H 3.32j N 9.2lj P 5.10 aefundem C 19.93J H 3.07; N 8.785 P 5.04

0,,3Ln-HCl _ , 0. In-HCl

max. ²^ ^m/^{U {S} '^{1ΐΛχ 10}^t ^min. ²^ ^ra/^u

H₀O , H₀O

² 255 ra/i (fe» I2.3 χ ICK); *?s» 226 m/i

max. ' min. '

0 09816/180 1 ßAD

O.In-NaOH O.In-NaOH

256 m/u (C ß 12.7 x 1<K)J ¹^- 227 m/u'

max. ' mm. /

-⁵ « -22°(C=0.77, H₀O)
D *

Beispiel 2

I96 g Inosin und 30 g Boroxyd werden mit 5*6 1 m-Kresol ("Meta-cresylsäure Nr. 1" Japanischer Industriestandard) vermischt. Das Gemisch wird bei 50⁰C für 50 Stunden unter Auflösen verrührt. Die erhaltene Lösung wird dann auf 5°C gekühlt. Anschließend werden 56Ο g Tetrachlorpyrophosphorsäure zugesetzt, worauf man die Reaktion bei der gleichen Temperatur für 2 Stunden stattfinden läßt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen und mit Benzol zur Entfernung des m-Kresols aus dem Reaktionsgemisch extrahiert. Die Benzolschicht wird zunächst mit 6 1 Wasser und dann mit 4 1 Wasser gewaschen. Die ursprüngliche gewonnene wässrige Schicht und die Waschwasseranteile werden zusammengegeben und. nochmals mit Benzol extrahiert. Der Pjj-Wert der so gewonnenen wässrigen Schicht wird durch Zugabe einer 5-nwässrigen Lösung von Natriumhydroxyd auf den Wert von 1 gestellt. Die Analyse der wässrigen Schicht in der Papierelektrophorese ,in einem Borat-Puffer beim Pjr 9#2 zeigt» daß das Inosin-5¹-phosphat in einer Ausbeute von 99*5 % erhalten worden ist. Die wässrige Lösung wird mit Wasser auf 50 1 verdünnt und durch eine mit 2 kg Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Diese wird dann mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 0,7#igen wässrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wird durch Zugabe von Salzsäure auf den p_H~Wert von 8,6 gebracht und aufkonzentriert. Es werden 2^4 g (berechnet als Anhydrid) des Dinatriumsalzes von Ineosin-5¹-phosphat erhalten. Ausbeute: 81,5 %

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- 8 Beispiel ?

1,96 g Inosin land 0,5 g Boroxyd werden zu 75 ml m-Kresol gegeben. Die Mischling wird auf 50⁰C zur Lösung erhitzt und dann auf 5⁰C gekühlt. Anschließend werden 15,8 g Phosphoroxychlorid zugesetzt und die Reaktion unter Rühren bei 5⁰C während eines Zeitraumes von 6 Stunden durchgeführt. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch Papierelektrophorese zeigt, daß Inosin-5¹-phosphat in einer Ausbeute von 61,5 % gebildet worden ist; Das Reaktionsgemisch wird entsprechend dem Verfahren des Beispiels 2 aufgearbeitet. Es fällt das Dinatriumsalz des Inosin-5'-phosphate in einer Ausbeute von 1,4 g (berechnet als Anhydrid) an.

Beispiel K

1,96 g Inosin und 0,4 g Boroxyd werden zu 75 ml m-Kresol gegeben. Das Gemisch wird unter Lösung auf 50⁰C erhitzt und dann auf 5°C gekühlt.

Ein Gemisch von 50 g Phosphor oxy chlor id, 3 ml Wasser und 55 ml Tetrachlorkohlenstoff wird für 5 Stunden am Rückfluß gekocht und dann der Destillation unterworfen. Es wird dabei ein Rückstand mit einem Siedepunkt über etwa 90⁰C bei 10 mm Hg erhalten. Dieser Rückstand wird dem vorher geschilderten Gemisch zugesetzt und eine Umsetzung bei 5⁰C während 2 Stunden durchgeführt. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch Paplerelektrophorese zeigt, daß das Inosin-5*-phosphat in einer Ausbeute von 98,5 % gebildet worden ist. Das Reaktionsgemisch wird dann wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgearbeitet. Es fällt das Dinatriumsalz des Inosin-5¹-Phosphats in einer Ausbeute von 2,5 g (berechnet als Anhydrid) an.

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Beispiel 5

Ein Gemisch von 2,8 g Guanosin, 0,7 g Boroxyd und 600 ml m-Kresol wird bei 50⁰C für den Zeitraum von einer Stunde gerührt. Dabei löst sich das Quanosin. Das Reaktionsgemisch wird dann auf 5°C gekühlt, anschließend werden 20 ml Tetrachlorpyrophosphorsäure zugesetzt und die Umsetzung unter Rühren bei 5°C für den Zeitraum von 2 Stunden vorgenommen. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch Papierelektrophorese zeigt, daß Guanosln«5'-phosphat in einer Ausbeute von 85 % gebifet worden isti Das Reaktionsgeraiseh wird wie in Beispiel 2 aufgearbeitet«. Is wird das Dinatriumsalz des Guanosin-5¹-phosphate in einer Ausbeute von 2,5 g erhalten. Die Analyse der Kristalle in ά@τ Papierelektrophorese (Citrat»Puffer bei pw 5s8) und die Papierteilungschromatographi© (aufsteigendem Verfateen unter Verwendung eines Gemisches von Isofouttersäurei 0,5-n wässrige Ammoniaklösung in einem Volümmisstaäuggverhältnis von 10 : 6) zeigen, daß die Auswanderangsstrecke und der Rf-Wert der Kristall® identisch mit den Werten von Guanosin-5*-phosphat sind.

Die Verhältnisse der UV-Afosorptionßw©2»te der Kristalle sind;

250 m/u/ 260 m/U = 1.15* 280 m,u/26Q lU/U « 0,65 und 290 nyu/ 260 nyu ^ 0,28.

Die Kristalle werden durch Behandlung mit 5*-Nueleotidase aus Bullensamen vollständig dephosphorjlierto

Claims (4)

- ίο - Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-5'-phosphaten aus den entsprechenden Ribonucleosiden unter Verwendung von Blockierungs- und Phosphorylierungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ribonucleoside mit Boroxyd umsetzt, das anfallende Produkt mit einem Phosphorylierungsmittel behandelt und schließlich das phosphorylierte Produkt hydrolysiert.

2) Verfahren naeh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Boroxyd in Mengen von etwa 1 bis 5 Mol je Mol Ribonueleosid einsetzt, während das Phosphorylierungsmittel in Mengen von etwa 1 bis etwa 20 Mol, bezogen auf das Ribomieleosid verwendet werd.

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphorylierungsmittel Tetrachlorpyrophosphorsäure, Phosphoroxychlorid oder ein Hydrolysat einsetzt, das durch Mischen von Phosphoroxychlorid und Wasser erhalten worden ist«

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Inosin oder Guanosin. phosphoryliert.

SAD ORIGINAL

tQDI'fÖ/1801