DE1593964B2

DE1593964B2 - Triacetyl-spiramycin i und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE1593964B2
Application number: DE19671593964
Authority: DE
Inventors: Jean Paris Tschehtcheff Serge Vitry sur Seine Preud'Homme, (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1966-01-06
Filing date: 1967-01-05
Publication date: 1973-08-16
Also published as: NL6618334A; FR1505352A; DK117502B; US3472930A; NL148798B; CH460249A; DE1593964A1; BE692238A; GB1158396A; DE1593964C3; SE322233B

Description

Spiramycin ist ein antibakterielles Antibioticum, das aus drei Komponenten zusammengesetzt ist, dem Spiramycin I, dem Spiramycin II und dem Spiramycin III, deren Strukturformeln von R. Paul und S. Tchelitcheff, in Bulletin de la Societe Chimique de France (3), S. 650 (1965), angegeben wurden.

Unter diesen Spiramycinen weist das Spiramycin I ein besonderes Interesse auf, da es direkt durch Fermentation in technischem Maßstab erhalten werden kann.

Die Erfindung betrifft' das Triacetyl-Spiramycin I des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Aus »Bulletin de la Societe Chimique de France« (1965), S. 192, ist zwar schon ein Triacetylderivat des Spiramycins I bekannt, jedoch ist diese Verbindung nicht mit der erfindungsgemäßen Verbindung identisch, wie sich aus den physiko-chemischen Eigenschaften ergibt. Beispielsweise beträgt der Schmelzpunkt der erfindungsgemäßen Verbindung 156 bis 157° C, während der Schmelzpunkt der bekannten Verbindung 140 bis 142⁰C beträgt; andererseits verhält sich die erfindungsgemäße Verbindung bei chemischen Reaktionen anders als die bekannten Verbindung. Zum Beispiel bleibt bei 24stündigem Sieden in Methanol die erfindungsgemäße Verbindung unverändert, während aus der bekannten Verbindung eine Acetylgruppe abgespalten wird. Auf Grund des verschiedenartigen Verhaltens bei chemischen Reaktionen ergibt sich, daß sich bei der erfindungsgemäßen Verbindung eine Acetylgruppe an dem Makrolactonring und die beiden anderen Acetylgruppen an dem Mycarosering des Spiramycin-Moleküls befinden, wohingegen bei der bekannten Verbindung eine Acetylgruppe an dem Makrolactonring; eine an dem Mycaminosering und eine an dem Mycarosering steht.

Das erfindungsgemäße Triacetyl-Spiramycin I stellt ein antibakterielles Mittel wie das Spiramycin und seine Komponenten dar. Es ist aber besonders wertvoll, da es bei Versuchen in vivo bei Bakterieninfektionen der Maus eine antibakterielle Wirksamkeit bei Verabreichung auf oralem Wege auf Streptokokken- und Pneumokokkeninfektionen gezeigt hat, die zweibis dreimal höher ist als diejenige von Spiramycin I oder einem Gemisch von Spiramycinen aus 65°/₀ Spiramycin I, 20 % Spiramycin II und 15⁰/„ Spiramycin III.

Die Wirkung wurde in den folgenden Versuchen geprüft.

Kurative Wirksamkeit bei Streptokokken

Mäuse werden durch intraperitonale Injektion von 0,5 ecm einer 10~³-Verdünnung in physiologischer Kochsalzlösung von 18stündigen Streptokokken-Kulturen (Stamm Dig 7) in Herz-Hirn-Bouillon infiziert. Die zu untersuchenden Verbindungen werden auf oralem Wege in Suspension in Wasser, das mit Tween 80 versetzt ist, verabreicht. Man verwendet 10 Mäuse je Dosis. Man führt drei Behandlungen in Abständen von 24 Stunden durch, wobei die erste Behandlung eine Stunde nach der Infektion erfolgt, und man beobachtet die Mäuse im Verlaufe von 8 Tagen. Es wird diejenige Dosis (DC₅₀) in Milligramm/ kg/Tag der zu prüfenden Verbindung bestimmt, für die 50% der Mäuse am 8. Tage überleben.

Kurative Wirksamkeit bei Pneumokokken

Die Arbeitsweise und die Berechnung der Resultate sind die gleichen wie bei dem vorhergehenden Test, man ersetzt lediglich die Streptokokken-Kulturen durch Pneumokokken-Kulturen (Stamm Til I).

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

	45	Erfindungsgemäßes Tri-	DC₅₀ mg/kg/Tg p. 0. bei	Pneumo kokken
Geprüfte Substanzen	acetylspiramycin I	Strepto kokken	(Stamm Til I)
Spiramycin I (bekannt) ...	(Stamm Dig 7)
⁵⁰ Spiramycin-Gemisch aus		16
65 % Spiramycin I ]	40	48
20% Spiramycin II ...\	160
15 % Spiramycin III ..J
	37
93

Außerdem besitzt das erfindungsgemäße Triacetyl-Spiramycin I den Vorteil, daß es in sauerem Medium viel stabiler ist als Spiramycin I oder das Gemisch von Spiramycinen. So behält es bei einer 5stündigen Behandlung mit n/10-Salzsäure seine volle antibakterielle Aktivität bei, während das Spiramycin I oder das Gemisch der Spiramycine unter diesen Bedingungen 90 % der Aktivität verliert.

Das erfind ungsgemäße Triacetyl-Spiramycin I wird dadurch hergestellt, daß man Spiramycin I in an sich bekannter Weise mit Essigsäureanhydrid bei einer Temperatur von 50 bis 150⁰C bis zur Bindung von vier Acetylresten je Molekül verestert und anschließend

das Tetraacetylderivat mit wäßrigem Methanol bis zur Entfernung eines der Acetylreste behandelt.

Vorzugsweise wird die Acetylierung bei 100⁰C, in An- oder Abwesenheit einer organischen tertiären Base wie Pyridin, durchgeführt. Zur Erzielung einer vollständigen Reaktion ist es erforderlich, die Reaktion, je nachdem, bei welcher Temperatur in dem angegebenen Bereich gearbeitet wird, 5 bis 70 Stunden fortzusetzen.

Die Methanolyse wird vorzugsweise unter Erhitzen des Reaktionsgemisches bei seiner Rückflußtemperatur durchgeführt. Man kann auch bei einer weniger erhöhten Temperatur arbeiten, doch ist es dann erforderlich, die Reaktion viel länger fortzusetzen. Diese Methanolyse bewirkt die Abspaltung einer der vier Acetylgruppen des Tetraacetylspiramycins I.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Triacetyl-Spiramycin I kann als solches verwendet oder es kann auch nach üblichen Methoden gereinigt werden, um das entsprechende kristallisierte reine Produkt zu erhalten. Die Reinigung kann insbesondere durch direkte Kristallisation mittels eines entsprechenden organischen Lösungsmittels, wie Isopropyläther, oder durch Gegenstromverteilung bzw. Chromatographie oder Extraktion mit einem Gemisch von Wasser und einem organischen Lösungsmittel erfolgen.

Die im folgenden Beispiel erwähnten Aktivitäten werden durch biologische Bestimmung nach der Diffusionsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis als empfindlichem Keim und bezogen auf eine reine Probe von Spiramycin als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist in Einheiten je mg (E/mg) ausgedrückt, wobei die Einheit die kleinste Menge an dem geprüften Stoff ist, die, gelöst in 1 ecm eines geeigneten Kulturmediums, das Wachstum von Staphylococcus aureus ATCC 6538 P unter bestimmten Bedingungen inhibiert.

Die antibiotische Aktivitätseinheit für das Spiramycin wurde folgendermaßen bestimmt:

Zusammensetzung des Mediums

20 g Pepton für bakteriologische Zwecke,
5 g kristallisiertes Natriumchlorid,
2 g D-Glucose

werden mit destilliertem Wasser auf 1000 ecm aufgefüllt. Dieses Medium wird über Supercel filtriert und auf pH 7,4 eingestellt.

Beimpfung

10 ml des Nährmediums werden mit einer Platinöse aus einer Kultur von Staphylococcus aureus ATCC 6538 P auf Schrägagar beimpft. Nach 8 Stunden Inkubation bei 37° C wird die erhaltene Suspension auf ¹ZiOOo verdünnt. Diese Lösung dient zum Beimpfen der Teströhrchen in einer Dosis von 1 Tropfen je Röhrchen.

Auswertung der Resultate

Nach löstündiger Inkubation bei 37° C wird die antibiotische Aktivität der Probe berechnet, indem diejenige antibiotische Menge je ml bestimmt wird, welche das Wachstum des Versuchskeimes zu hemmen vermag.

Beispiel

Man hält eine Lösung von 1000 g Spiramycin I in 5400 g eines durch Mischen von 4752 g Pyridin und 648 g Essigsäureanhydrid erhaltenen Acetylierungsgemisches 24 Stunden bei 100⁰C. Dann läßt man das Ganze abkühlen, gießt das Reaktionsgemisch in 10 kg Eiswasser, stellt den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 800 ecm 10 η-Natronlauge auf 7,5 ein und extrahiert die Mischung zuerst mit 2 1 und dann mit

11 Chloroform. Die Chloroformlösungen werden vereinigt, viermal mit je 41 Wasser gewaschen, filtriert und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird unter

ίο einem Druck von 1 mm getrocknet und dann wieder in 30 1 Cyclohexan gelöst. Die erhaltene Lösung wird nun bei 28⁰C filtriert und eingedampft. Der feste Rückstand wird unter einem Druck von 1 mm getrocknet. Man erhält 1150 g tetraacetyliertes Spiramy ein I mit einem Gehalt von 1185 E/mg; F. 148 bis 152°C; [a]f = -106° (c = 2% in Äthanol); CH₃CO-Gehalt = 17,0%.

1000 g des oben erhaltenen tetraacetylierten Spiramycins I werden in 9000 cm eines Gemischs von 7200 ecm Methanol und 1800 ecm Wasser gelöst, und die Lösung wird 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Dann läßt man das Ganze abkühlen, setzt 10 1 Wasser hinzu und extrahiert mit 41 Methylenchlorid. Darauf dekantiert man die Methylenchloridlösung, dampft diese ein und trocknet das zurückbleibende Produkt unter einem Druck von 1 mm bei 6O⁰C bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält 705 g Triacetyl-Spiramycin I mit einem Gehalt von 1670 E/mg; F. 148 bis 150°C; [α]? = -86° (c = 2% in Äthanol); CH₃CO-Gehalt = 12,6%.

Die Reinigung des Triacetyl-Spiramycins wird wie folgt durchgeführt:

a) Durch Umkristallisation.

27,5 g rohes, oben erhaltenes Triacetyl-Spiramycin I werden in 50 ecm Isopropyläther unter Rückfluß gelöst. Die erhaltene Lösung wird dann in einem Eisbad unter Rühren im Verlaufe von 24 Stunden kristallisieren gelassen. Das auskristallisierte Produkt wird abfiltriert, dreimal mit je 10 ecm Isopropyläther gewaschen und bei 40° C unter einem Druck von 2 mm

12 Stunden getrocknet. Man erhält 13,5 g kristallines Triacetyl-Spiramycin I vom F. 150 bis 152° C.

b) Durch Gegenstromverteilung und Umkristallisation.

44,5 g rohes, oben erhaltenes Triacetyl-Spiramycin I werden durch Gegenstromverteilung zwischen den getrennten Phasen des Gemischs aus Benzol + Cyclohexan + Methanol + Wasser (45 : 55 : 80 : 20 Volumina) gereinigt, wobei 300 Überführungen in einer Craig-Apparatur vorgenommen werden, deren Zellen ein Fassungsvermögen von 50 ecm haben. Das Triacetyl-Spiramycin I befindet sich dann in den Zellen 140 bis 210 (Jc = 1,38). Der Inhalt der Zellen 164 bis 196 wird vereinigt und dann unter einem Druck von 3 mm bei 25° C auf 200 ecm eingeengt. Das erhaltene wäßrige Konzentrat wird bei einem pH-Wert von 8,5 zweimal mit 1 Volum Benzol extrahiert. Die vereinigten Benzolextrakte werden mit 20% ihres Volumens Wasser gewaschen, hierauf über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 30°C unter einem Druck von 3 mm zur Trockne eingeengt. Man erhält 15,6 g gereinigtes Triacetyl-Spiramycin I vom [cc[o²

= -89,2° (c = 1% in Äthanol); Gehalt: 2300 E/mg.

6,4 g dieses Produkts werden nun in der Wärme in 140 ecm Isopropyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter einem Druck von 3 mm auf 50 ecm eingeengt. Dann läßt man das Ganze in einem Eisbad 2 Stunden unter Rühren abkühlen, wobei man

farblose Nadeln erhält, die man abfiltriert, mit 5 ecm 3420 sst

Isopropyläther wäscht und bei 40⁰C unter einem 2960 Sch

Druck von 3 mm 12 Stunden trocknet. Man erhält 2920 st

5,25 g kristallisiertes Triacetylspiramycin I mit einem 2850 st

Gehalt von 2300 E/mg; F. 150 bis 152⁰C. 5 2820 Sch

3,75 g dieses kristallisierten Triacetyl-Spiramycins I 2770 m

werden in der Wärme wieder in 150 ecm Isopropyl- 1730 sst

äther gelöst, die erhaltene Lösung wird filtriert und 1625 st

dann unter einem Druck von 3 mm auf 45 ecm einge- 1590 Sch

engt. Durch 2stündige Kristallisation in einem Eisbad io 1450 st

unter Rühren werden 2,5 g reines Triacetylspiramycin I mit einem Gehalt von 2300 E/mg vom F. 156 bis 157⁰C; Drehvermögen [a]f = -97° (c=l°/₀ in Äthanol) erhalten.

15 Gewichtsanalyse in % für C₅₁H₈₂O₁₈N₂:

Berechnet ... C 60,5%, H 8,17%, 0 28,4%, N 2,76%;

gefunden ... C 60 bis 60,5 % H 8,2 bis 8,4 %, 0 28,3%, N 2,6 bis 2,65%;

Gefunden: CH₃CO-Gehalt 12,5 bis 12,9% Ultraviolett-Spektrum (die Bestimmung in äthanolischer Lösung vorgenommen): Absorptionsmaximum bei 230 nm (EYL = 280).

Das Infrarot-Spektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen) der Verbindung ist in dem Diagramm wiedergegeben, in dem als Abzissen einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm-¹ (oberer Maßstab) und als Ordinaten die optischen Dichten aufgetragen sind.

1370 st
1335 Sch
1292 m
1270 sch
1230 sst
1170 Sch
1150 st
1115 st
1080 m
1060 Sch

1040 sst 1020 Sch 985 m 965 m 945 Sch 930 Sch 900 m 850 m 835 m 800 sch

Die Hauptbanden der Infrarot-Absorption für diese Verbindung sind folgende:

sst = sehr stark, st = stark, m = mittel, sch = schwach, Sch = Schulter.

Ferner wurden die Rf-Werte von Spiramycin I, Tetraacetylspiramycin I und des reinen kristallinen Triacetylspiramycins I (durch Chromatographie) an einer dünnen Schicht von Aluminiumoxyd ermittelt. Es wurde hierzu eine Aluminiumoxydschicht von 0,3 mm Dicke verwendet, die auf einer Glasplatte aufgebracht war. Nach 12stündigem Trocknen des Trägers bei Zimmertemperatur wurde der Träger durch lstündiges Erhitzen bei 100⁰C aktiviert. Dann wurden Flecken von 10 μΐ einer benzolischen Lösung mit einem Gehalt von 0,1 mg der zu prüfenden Substanzen je ml (entsprechend 1 μg je Fleck) aufgebracht. Die Entwicklung wurde mit Hilfe eines Gemischs von Benzol und Essigsäureäthylester (60: 40 Volumina) vorgenommen, das man bis zu 15 bis 17 cm von der Ausgangslinie wandern ließ. Die Chromatogramme wurden dann 15 Minuten in einem wannen Luftstrom getrocknet.

Es wurden die folgenden Rf-Werte erhalten:

Spiramycin I Rf = O

Tetraacetylspiramycin I Rf = 0,6

kristallisiertes reines Triacetylspiramycin I Rf = 0,5

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Triacetyl-Spiramycin I (C₅₁H₈₂O₁₈N₂), das folgende Kennzahlen aufweist: F. 156 bis 157° C; optisches Drehvermögen [oc]f = —97° (c = 1 °/₀ in Äthanol); Ultraviolettspektrum (bestimmt in äthanolischer Lösung) mit einem Absorptionsmaximum bei 230 nm (EYL = 280); Infrarotspektrum (bestimmt mit Preßlingen einer Mischung mit Kaliumbromid) mit folgenden hauptsächlichen Absorptionsbanden: 3420 sehr stark, 2960 Schulter, 2920 stark, 2850 stark, 2820 Schulter, 2770 mittel, 1730 sehr stark, 1625 stark, 1590 Schulter, 1450 stark, 1370 stark, 1335 Schulter, 1292 mittel, 1270 schwach, 1230 sehr stark, 1170 Schulter, 1150 stark, 1115 stark, 1080 mittel, 1060 Schulter, 1040 sehr stark, 1020 Schulter, 985 mittel, 965 mittel, 945 Schulter, 930 Schulter, 900 mittel, 850 mittel, 835 mittel und 800 schwach.

2. Verfahren zur Herstellung des Triacetyl-Spiramycins I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Spiramycin I in an sich bekannter Weise mit Essigsäureanhydrid bei einer Temperatur von 50 bis 15O⁰C bis zur Bindung von vier Acetylresten je Molekül verestert und anschließend das Tetraacetylderivat mit wäßrigem Methanol bis zur Entfernung eines der Acetylreste behandelt.