AT204697B

AT204697B - Verfahren zur Herstellung eines hydrierten Antibiotikums in einheitlicher Form

Info

Publication number: AT204697B
Application number: AT415058A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1957-06-14
Filing date: 1958-06-13
Publication date: 1959-08-10

Description

Verfahren zur Herstellung eines hydrierten Antibiotikums in einheitlicher Form
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetrahydro-foromacidin A.
Gemäss dem Verfahren der deutschen Patentschrift Nr. 1021130 entstehen bei der Züchtung einer neuen Art der Gattung Streptomyces vier Antibiotika, die Foromacidin A, B, C bzw. D genannt wurden.

In dem bei der Isolierung anfallenden lipophilen Basengemisch liegen die genannten Stoffe in wechselnden Mengenverhältnissen vor. Da sie chemisch sehr nahe verwandt sind, können sie nur auf umständlichem Wege voneinander getrennt werden. Obwohl die einzelnen Foromacidine fast gleiche antibiotische und pharmakologische Eigenschaften besitzen, wäre es aus Gründen der genauen Dosierung und Reproduzierbarkeit wünschenswert, für therapeutische Präparationen ein einheitliches Produkt zur Verfügung zu haben.
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das O-Acetyl- bzw. O-Propionylderivat des Foromacidins A aufgefasst werden. Die direkte Überführung von Foromacidin B bzw. C bzw. D in Foromacidin A mittels Hydrolyse oder Umesterung gelingt nicht, da dabei die Moleküle infolge ihrer Labilität weitergehend abgebaut werden, wobei antibiotisch nur wenig wirksame Verbindungen entstehen.

Nach dem Verfahren der oben genannten deutschen Patentschrift können durch Hydrierung der genannten Foromacidine die Tetrahydro-foromacidine A, B, C und D gewonnen werden.

Es wurde nun gefunden, dass überraschend Tetrahydro-foromacidin A in vorteilhafter Weise erhalten wird, wenn man die Tetrahydro-foromacidine B, C und/oder D mit höchstens 1, 3, Äquivalenten eines basischen Mittels hydrolysiert. Auf Grund unserer Befunde ist das Tetrahydro-foromacidin A antibiotisch ungefähr gleich wirksam wie das Gemisch der Foromacidine und Tetrahydro-foromacidine A, B, C und D.

Als Ausgangsmaterialien kann man einheitliches Tetrahydro-foromacidin B, C oder D verwenden oder ein beliebiges Gemisch derselben, auch in Gegenwart von Tetrahydro-foromacidin A, insbesondere aber das Hydrierungsprodukt des bei der fermentativen Herstellung der Foromacidine anfallenden lipophilen Rohbasengemisches. Das neue Verfahren ermöglicht es somit, solche Gemische auf einfache Weise in ein einheitliches Produkt überzuführen.

Diese Reaktion kann in wässeriger, in organischer oder vorzugsweise in wässerig-organischer Lösung durchgeführt werden. Als Lösungsmittel kommen z. B. niedere Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Propylalkohol, niedere Ketone, wie Aceton oder Methyl-äthyl-keton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykole
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geeignet hat sich ein Gemisch von Methanol und Wasser erwiesen.

Alkalische Mittel sind beispielsweise Hydroxyde von Alkalien und Erdalkalien, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Bariumhydroxyd, Karbonate von Alkalien und Erdalkalien, wie Natrium- und Kaliumkarbonat, Ammoniak und seine Alkylderivate, wie Methylamin oder Tetramethylammoniumhydroxyd, und basische Ionenaustauscherharze in der Hydroxylform.

Verfahrensgemäss werden höchstens 1, 3, besonders l Äquivalent dieser alkalischen Mittel auf einmal oder portionenweise zu einer Lösung der genannten Ausgangsstoffe in einem der erwähnten Lösungsmittel zugegeben. Das PH der Reaktionslösung beträgt während der Reaktion vorzugsweise mindestens 9.

Das Reaktionhgemisch wird vorteilhaft unter Ausschluss von Sauerstoff und Licht sich selbst überlassen. Wird die Reaktion in einem heterogenen System, z. B. in mehreren nicht mischbaren Lösungsmitteln oder mit einem Ionenaustauscher durchgeführt, so ist es angezeigt, dieselbe unter Rühren oder Schütteln durchzuführen.

Es hat sich gezeigt, dass ein Erwärmen nicht notwendig ist, sondern dass die Hydrolyse mit den meisten genannten alkalischen Mitteln schon bei Zimmertemperatur glatt und vollständig verläuft. Die Reaktionsdauer schwankt zwischen 1 Stunde und ein paar Tagen. je nach der Wahl der alkalischen Mittel. Wird z. B. für die Hydrolyse Natriumhydroxyd in wässerig-rnethanolischer Lösung verwendet, so ist die Umsetzung bei Zimmertemperatur nach 24 Stunden vollständig. Der Grad der Umsetzung wird vorteilhafterweise laufend mittels Titration oder Papierchromatographie verfolgt.

Die Isolierungsmethode des gebildeten Tetrahydro-foromacidins A aus dem Reaktionsgemisch ist verschieden je nach den verwendeten Lösungsmitteln. Sind diese rein organischer Natur, so werden sie, vorteilhafterweise im Vakuum, entfernt, worauf das zurückbleibende Tetrahydro-foromacidin A nach dem unten angegebenen Verfahren gereinigt wird. Wird in wässerigen oder wässerig-organischen Lösungsmitteln gearbeitet, so kann das Reaktionsgemisch, gegebenenfalls nach Abdestillieren des organischen Lösungsmittels, bei einem PH von mindestens 7, mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden.

Dazu eignen sich Ester niederer Fettsäuren, wie Äthylacetat oder Amylacetat, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketone, wie Methylpropylketon oder Diisobutylketon, Alkohole, wie Butylalkohole oder Amylalkohole, Äther, wie Äthyläther, Diisopropyläther oder Glykoläther, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Toluol u. dgl.

An Stelle einer Lösungsmittelextraktion des Reaktionsgemisches oder in Kombination mit einer solchen als weiterer Reinigungsschritt kann man das Tetrahydro-foromacidin A auch durch Adsorption, beispielsweise an Aktivkohle, aktivierten Erden oder sauren Ionenaustauscherharzen, und anschliessende Elution des Adsorbates gewinnen, z. B. mit einer sauren wässerigen Lösung und/oder mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Isopropanol, Butanol oder Aceton.

Ein gutes Verfahren zur Reinigung des Tetrahydro-foromacidins A und zur Abtrennung von Nebenprodukten besteht in Verteilung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen, z. B. zwischen 0, 2-molarem Citratpuffer und Methylenchlorid oder Chloroform oder zwischen wässerigem Methanol und chlorierten Kohlenwasserstoffen.

Eine weitere Reinigungsoperation stellt die fraktionierte Neutralisation dar. Bei dieser werden die in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelösten basischen Reaktionsprodukte portionenweise mit Säure extrahiert, wobei die gesamte angewendete Säure gerade zur Neutralisation ausreicht. Dabei wird das Tetrahydro-foromacidin A in den mittleren Portionen angereichert, während sich in den ersten bzw. letzten Fraktionen stärker bzw. schwächer basische Nebenprodukte befinden.

Das Reaktionsprodukt kann auch durch Chromatographie gereinigt werden, wozu z. B. Adsorptionsmittel, wie Aluminiumoxyd, Silicagel oder Magnesiumsilikat, verwendet werden können. Besonders geeignet ist die Verteilungschromatographie an Cellulosesäulen, die mit Puffern von einem PH zwischen 3, 5 und 7 imprägniert sind. Als Elutionsmittel eignen sich hier z. B. mit Pufferlösung gesättigte, mit Wasser nicht mischbare aliphatische Ketone, wie Methyl-äthyl-keton oder Diäthyl-keton.

Man kann die Reaktion sowie die Isolierung des Tetrahydro-foromacidins A mittels Papierchromato- graphie verfolgen.

Das gereinigte Tetrahydro-foromacidin A kann aus organischen und/oder organisch-wässerigen Lösungen kristallisiert werden, wobei sich besonders Gemische von aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie Benzol oder Toluol, mit niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Hexan oder Petroläther, oder Gemische von aliphatischen Äthern, wie Diäthyläther, mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen, oder wässeriges Aceton bewährt haben.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
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gegebenen Verfahren erhalten wurde, werden in 45 ml Methanol-Wasser (1 : 1) gelöst und mit 5 ml 1-n Natronlauge versetzt, so dass eine anfängliche Laugenkonzentration von zirka 0, 1 normal resultiert. Die Lösung wird unter Ausschluss von Licht und Luft während 24 Stunden bei 20 - 250 C stehen gelassen. Nach dieser Zeit reagiert die Lösung nicht mehr oder höchstens noch schwach phenolphthaleinalkalisch. Man verdünnt sie mit Wasser auf das doppelte Volumen und extrahiert dreimal mit dem fünffachen Volumen Äther.

Der Ätherextrakt wird mit wenig Wasser und mit gesättigter wässeriger Kochsalz-

lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, wobei in 80 - 85o ; oiger Ausbeute ein farbloser, pulveriger Rückstand erhalten wird. Dieses Material besteht, wie sich papier- chromatographisch zeigen lässt, aus Tetrahydro-foromacidin A (Rf-Wert : 0, 17) sowie geringen Mengen von Ausgangsmaterial (Rf-Wert : 0, 32) und von schwächer basischen Nebenprodukten (Rf-Wert : > 0, 55).

Für den papierchromatographischen Nachweis der Foromacidine und Tetrahydro-foromacidine verwendet man ein mit 0, 2-molarem Citratpuffer vom PH 5, 3 imprägniertes Whatman-No. 1-Papier. Als mobile Phase dient Methyläthyl-keton, das mit der gleichen Pufferlösung gesättigt ist. Die Lage des Substanzfleckens wird durch Besprühen mit 15eiger Phosphorsäure und kurzes Erhitzen auf 1000 sichtbar gemacht.
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Phasen über 100 Stufen verteilt, wobei das Material in die ersten 5 Einheiten in Form einer 4% igen Lösung der unteren Phase eingefüllt wird. Die Fraktionen 40 - 55, die gemäss Papierchromatogramm reines Tetrahydro-foromacidin A enthalten, werden vereinigt. Aus der Pufferlösung wird die Base durch Zugabe von Sodalösung in die Chloroformphase gedrängt.

Die Chloroformlösung wird mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum zur Trockne eingedampft. Der farblose Rückstand kristallisiert aus Toluol-Hexan in prismatischen Kristallen. Zur Analyse wird noch 2mal aus Äther-Hexan umkristallisiert und bei 700/0, 05 mm während 4 Stunden über P2O5
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[a]Ultraviolett-Spektrum (EtOH) : schwache Absorption in Form einer breiten Bande bei zirka 280 mil (e ; 20) und Endabsorption gegen 210 mu.
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(Nujol) : starke Banden bei : 2, 90, 5, 80, 7, 88, 8, 68, 8, 95, 9, 40, 9, 55, 9, 88,10, 10, 11, 10, 11, 90, 12, 40, 12, 80, 13, 90u.
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<tb>
<tb> Analyse <SEP> :

Rf-Wert im angegebenen System : 0, 17. Vergleichsweise zeigt Foromacidin A im gleichen System einen Rf-Wert von 0, 11. Farbreaktionen : Nach Fischbach und Levine gibt Tetrahydro-foromacidin A eine ähnliche jedoch weniger intensive violettrote Farbreaktion wie die Foromaeidine (vgl. Helv. 39 [1956], S. 317). Das Produkt ist gemäss seinen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften identisch mit Tetrahydro-foromacidin A, das durch direkte katalytische Hydrierung von Foromacidin A erhalten wird.

Tetrahydro-foromacidin A besitzt eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber Testorganismen in vitro, wie die folgende Tabelle zeigt. Als Testmethode wurden Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 370 bebrütet worden sind, verwendet.
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<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration
<tb> y/ml
<tb> Streptococcus <SEP> mitis <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 100
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtherise <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1 <SEP>
<tb>

Beispiel 2 : Verseifung von Tetrahydro-foromacidin C.

1 Mol Tetrahydro-foromacidin C, durch Hydrierung von Foromacidin C entsprechend dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren erhalten (angenommenes Molgewicht = 949), wird in MethanolWasser (l : l) mit 1 Mol Natriumhydroxyd umgesetzt. Reaktion, Aufarbeitung, Reinigung und Kristallisation erfolgen nach der im Beispiel 1 angegebenen Vorschrift. Das erhaltene Produkt ist gemäss seinen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften identisch mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Tetrahydro-foromacidin A.

Beispiel 3 : Verseifung eines Gemisches von Tetrahydro-foromacidin B und C.

Ein künstliches Gemisch von reinem Tetrahydro-foromacidin B und C im Verhältnis 1 : 1 wird nach der im Beispiel 1 angegebenen Vorschrift in Methanol-Wasser (1 : 1) und 1 Mol Natronlauge pro 1 Mol Basengemisch umgesetzt. Es wird dabei ein mittleres Molgewicht von 940 für das Basengemisch angenommen. Aufarbeitung, Reinigung und Kristallisation nach der im Beispiel 1 angegebenen Vorschrift liefert reines kristallisiertes Tetrahydro-foromacidin A.

Beispiel 4 : Hydrierung und Verseifung eines Gemisches von Foromacidin A. B, C und D.

Das rohe Gemisch der Foromacidine A, B, C und D, das man aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces A 8703 oder A 9427 nach der deutschen Patentschrift Nr. 1021130 erhält, wird in 2%iger alkoholischer Lösung mit 10% igem Palladium-Kalziumkarbonat-Katalysator bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnahme hydriert. Das nach Abtrennung des Katalysators und Verdampfung des Alkohols erhaltene Gemisch der Tetrahydro-foromacidine wird in 50%igem Methanol nach der im Beispiel 1 gegebenen Vorschrift mit Natriumhydroxyd umgesetzt. Die anzuwendende Menge Natronlauge richtet sich nach dem Gehalt des Gemisches an Tetrahydro-foromacidin B, C und D derart, dass pro Mol Tetrahydrobase B bzw. C bzw. D ein Mol Natriumhydroxyd eingesetzt wird.

Das relative Mengenverhältnis der vier Tetrahydrobasen wird papierehromatographisch abgeschätzt. Nach beendigter Reaktion wird das Produkt, wie unter Beispiel 1 angegeben, durch Ätherextraktion gewonnen. Es enthält neben dem gewünschten Tetrahydro-foromacidin A schwächer basische (Rf-Wert > 0, 18) und stärker basische (Rf-Wert < 0, 16) Neben-
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Portionen einer verdünnten wässerigen Salzsäurelösung ausgeschüttelt. Die Stärke der Säure wird so bemessen, dass die Gesamtmenge zur Neutralisation des Basengemisches gerade ausreicht. Die einzelnen Säureextrakte werden mit gesättigter Sodalösung auf PH 9 gebracht und mit Äther ausgeschüttelt. Die
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halten, das nach dem Konzentrieren der ätherischen Lösung und Zugabe von Hexan kristallisiert.

Aus den Vor- und Nachfraktionen kann weiteres kristallines Tetrahydro-foromacidinA durch Gegenstromverteilung nach der im Beispiel 1 angegebenen Vorschrift gewonnen werden.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines hydrierten Antibiotikums in einheitlicher Form, dadurch gekenn-
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- foromacidinforomacidin D oder ein Tetrahydro-foromacidingemisch aus beliebigen der Tetrahydro-foramacidine A, B, C und D, wie es insbesondere das Hydrierungsprodukt des bei der fermentativen Herstellung der Foromacidine anfallenden Rohbasengemisches ist, mit höchstens 1, 3 Äquivalenten, vorzugsweise mit einem Äquivalent, eines basischen Mittels, vorzugsweise bei Zimmertemperatur und einem pH-Wert von mindestens 9 hydrolysiert.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hydrolyse in wässeriger Lösung vornimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hydrolyse in einem Gemisch von Wasser in einem organischen Lösungsmittel, wie vorzugsweise einem niedrigmolekularen Alkohol, durchführt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als alkalisches Mittel Natriumhydroxyd verwendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als alkalisches Mittel basische Ionenaustauscher verwendet.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die alkalischen Mittel auf einmal zugibt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die alkalischen Mittel portionenweise zugibt.