DE1593964A1

DE1593964A1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen Spiramycinderivats

Info

Publication number: DE1593964A1
Application number: DE19671593964
Authority: DE
Inventors: Homme Jean Preud; Serge Tchelitcheff
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1966-01-06
Filing date: 1967-01-05
Publication date: 1971-02-25
Also published as: BE692238A; DE1593964B2; CH460249A; GB1158396A; SE322233B; DE1593964C3; DK117502B; NL6618334A; US3472930A; NL148798B; FR1505352A

Description

Di. F. Zumstein sen - Dr. E, Assmann
Pr. R. KoenLgsborger - Dipl. Phys. R. Holzhauer

Dr. F Zumstern jun.

F α t β η t α η- w 6 I t β

8 München 2, Bräubausstraße 47III

Neue vollständige Anmeldungsunterlagen SC 28J1

RHONE-POULENC, S«Α., Paris, Frankreich

Verfahren zur Herstellung eines neuen Spiramycinderivats

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Die vorliegende JSrfindung betrifft die Herstellung eines neuen Derivats von Spiramycin I.

Spiramycin ist ein antibakterielles Antibioticujn, das aus drei Komponenten zusammengesetzt 1st, Spiramycin I, Spiramycin II und Spiramycin III, deren Strukturformeln von R. Paul und S. TchelXitcheff, Bull. Soc. ChIm. (3), 650 (1965), ermittelt wurden.

Unter diesen Spiramycinen weist das Spiramycin I ein besonderes Interesse auf _s da en direkt durch Fermentation in technischem Maßstab erhalten werden kann,

BAD ORIGINAL

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Dae erfinduagagemäß erhältliche neue Derivat yon Spiramycin I ist ein Iriaoetylderivat des Spiramycins I, dessen Strukturformel noch nicht bestimmt wurde.

Man stellt ein letraaoetylderivat voi« Spiramycin I duroh Umsetzung von Spiramycin I mit Essigaäureanhydrid bsi einer Temperatur zwischen 50 und 15O⁰C, vorzugsweise bei 10O⁰O, in An- oder Abwesenheit einer organischen tertiären Base» wie beispielsweise Eyridin, her. Zur Erzielung einer vollständigen Reaktion ist es erforderlich, die Reaktion je nach der Iempera-;ur während 5 bis 70 Stunden fortzusetzen.

Das neue SriacetyXderivat von Spiramycin I wird erfindungagemäö durch Metbanolyse des oben beschriebenen Tetraaoetylderivats erhalten. Man arbeitet duroh Einwirkung eines Gemische von Wasser und Methanol, vorzugsweise unter Erhitzen des Reaktionsgemische bei seiner RUokfluBtemperatur. Man kann auch bei einer weniger erhöhten Temperatur arbeiten, doch ist es dann erforderlich, die Reaktion viel langer fortzusetzen. Diese I-Iethanolyaö bewirkt die Abspaltung einer dor vior sa dem Spiraasycin I Aootylgruppsa.

BAD

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Das erfindungsgemäss erhältliche neue Triacety!derivat des Spiramycins I kann als solches vervrendet oder auch gereinigt werden, um das entsprechende kristallisierte reine Produkt zu erhalten. Man kann diese Reinigung nach den üblichen Arbeitsweisen durchführen, insbesondere durch direkte Kristallisation in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Isopropyläther, Gegenstromverteilung, Chromatographie, Extraktion mit einem Gemisch von Wasser und organischem Lösungsmittel bei einem geeigneten pH-Wert.

Das neue Triaoetylderivat von Spiramycin I besitzt den Vorteil, in sauerem Medium viel stabiler als Spiramycin I oder das Gemisch von Spiramycinen zu sein. So behält es bei einer 5-stündigen Behandlung mit n/10-Salzsäure seine volle antibakterielle Aktivität bei, während das Spiramycin I oder das Gemisch der' Spiramycine unter diesen Bedingungen 90 % der Aktivität verliert.

Das erfindungsgemäss erhältliche neue Derivat des Spiramycins I ist als antibakterielles Mittel wie das Spiramycin und eeine Komponenten wirksam. Es ist besonders wertvoll, da es bei Versuchen in vivo bei Bakterieninfektionen der Maus eine antibakterielle Wirksamkeit bei Verabreichung auf oralem Weg auf Streptokokken- und Pneumokokkeninfektionen gezeigt hat, die zwei- bis dreimal höher als diejenige von Spiramycin I oder dem Gemisch von Spiramycinen ist.

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Aufgrund seiner besseren Stabilität in sauerem Medium und seiner höheren antibakteriellen Wirksamkeit in vivo stellt das erfindungsgemäss erhältliche neue' Produkt einen Fortschritt gegenüber Spiramycin und seinen Komponenten dar.

Das Triacetylspiramycin I entspricht der Bruttoformel Cf-jHgpO.gNo und besitzt die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

Aussehen: cremefarbenes Pulver

Schmelzpunkt: I56 bis 157°C

/~cf7 ^⁰= -97° (c = 1 % in Äthanol)

Elementaranalyse: C = 60 - 60,5 % H = 8,2 - 8,4 %

0 » 28,3 % N ^ 2,6 - 2,65 % CH₃CO = 12,5 bis 12,9 %

Ultraviolett-Spektrum (die Bestimmung wurde mit einer Lösung in Äthanol vorgenommen): Absorptionsmaximum bei 230 nm (E*"*,,-- 280).

Infrarot-Spektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpresstem Produkt vorgenommen):

Dieses Spektrum ist in der beigefügten Fig. 1 wiedergegeben, in der als Abszissen'einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm" (oberer Maßstab) und als Ordinaten die optischen Dichten aufgetragen sind.

BAD

'.' ι' ι· t' ;i ■·' i. U B b

. ■ ■ ■ ·

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarot« Absorption für dieses Produkt angegeben:

	Tabelle I	1040	sst
3^20 sst	1370 st	1020	Sch
2960 Sch	1335 Sch:	985	m
2920 at	1292 m	965	m
2850 et	1270 sch	9^5	Sch
2820 Sch	1230 sst	930	Sch
2770 m	1170 Sch	900	m
1750 sst	1150 st	850	m
1625 st	II.15 st	835	m
1590 Sch	1080 m	800	sch
1450 st	1060 Sch
sst «	sehr stark
St-	stark
m «	mittel
., sch »	schwach
Sch °	Schulter

Es wurde die Chromatographie von Spiramycin*I, Tetraacetylspira· myoin I und Triacetylspiraraycin I (kristallisiert) an einer dünnen Schicht von Aluminiumoxyd durchgeführt. Es wurde eine

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Aluminiumoxydschicht von 0,3 mm Dicke verwendet, die auf einer Glasplatte aufgebracht war. Nach Trocknen während 12 Stunden bei Zimmertemperatur wurde der Träger durch einstündiges Erhitzen bei 100'C aktiviert. Dann wurden Plecken von 10 μΐ einer benzolischen Lösung mit einem Gehalt von 0,1 mg der zu prüfenden Produkte Je ml (entsprechend 1 pg je Fleck) aufgebracht. Die Entwicklung wurde mit Hilfe eines Gemische von Benzol und Essigsäureäthylester (60 : 40 Volumina) vorgenommen, das man bis zu 15 bis 17 cm von der Ausgangslinie wandern Hess. Die Chromatogramme wurden dann 15 Minuten in einem warmen Luftstrom getrocknet und anschliessend au> mit Bacillus subtills beimpften Agarplatten biologisch geprüft.

Es wurden die folgenden Rf-Worte erhalten: Spiramycin I : Rf-O Tetraacetylspiramycin I: Rf « 0,6

kristallisiertes Triaoetylspiramycin I: Rf «0,5

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird die Aktivität durch biologische Bestimmung nach der Diffusionßmothcde unter Verwendung von Bacillus subtllis als empfindlichem Keim und bezogen auf eine reine Probe von Spiramycin als Eichmass bestimmt. Diese Aktivität

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1st in Einheiten Je mg (E/mg) ausgedrückt, wobei die Einheit die kleinste Menge an Produkt ist, die, gelöst in 1 ecm eines geeigneten Kulturmediums, des Wachstum von Staphylococcus aureus ATCC 6558 P unter bestimmtan Bedingungen Inhibiert.

Beispiel 1 Herstellung; von tetraacetyllertem Spiramycin I

Man hält eine Lösung von 1000 g Spiramycin I in 5400 g eines durch Mischen von 4752 g Pyridin und 648 g Essigsäureanhydrid erhaltenen Acetylierungsgemieche 24 Stunden bei 100*C . Nach Abkühlen giesst man das Reaktionagemisch in 10 kg Eiswasser, stellt den pH-Wert der Lösung dur»ch Zugabe von 800 ecm 1On-Natronlauge auf 7»5 ein und extrahiert mit 2 1 und dann ud*

1 1 Chloroform. Die Chloroformlösungen werden vereinigt, viermal mit Je 4 1 Wasser gewaschen, filtriert und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird unter vermindertem Druck (1 mm Hg) getrocknet und dann wieder in j30 1 Cyclohexan gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei 28⁰C filtriert und eingedampft. Der feste Rückstand wird unter vermindertem Druck (1 mm Hg) getrocknet. Man erhält so II50 g tetraacetyllertes Spiramycin I mit einem Gehalt von 1185 E/nißj P= 148 bis 152'C; [a]§²> -106* (c -

2 % in Äthanol); CH₃CO « 17»0 %.

BAD ORlOINAl

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Herstellung von triacetyliertem Spiramycin I

Man erhitzt eine Lösung von 1000 g tetraacetyliertem Spiramycin I (hergestellt wie oben beschrieben) in 9000 ecm" eines Gemische von 7200 com Methanol und 1800 ecm Wasser 24 Stunden unter Rückfluss. Nach Abkühlen setzt man 10 1 V/ässer zu und extrahiert mit 4 1 Methylenchlorid. Nach Dekantieren dampft man die Methylenohio· ridiösung ein und trocknet das zurückbleibende Produkt unter vermindertem Druck (1 mm Hg) bei 60*0 bis zur Gewichtskonstanz. Man erhält 705 6 triacetyliertes Spiramycin I mit einem Gehalt von 1670 E/mg; P « 148 bis 150*0; [α)ψ - -86^# (c - 2 % in Äthanol); CH,CO - 12,6 %,

Beispiel 2 Reinigung des triacetylierten Spiramycins I durch Kristallisation

27*5 g rohes, wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenes tri- acetyliertes Spiramycin I werden in 50 com Isopropyläther unter Rückfluss gelöst. Die erhaltene Lösung wird dann in einem Eisbad

unter Rühren während 24 Stunden kristallisiert. Das kristallite

slerte Produkt wird abfiltriert, dreimal mit'10 ecm Isopropyläther gewaschen und bei 40*C unter vermindertem Druck (2 mm Hg) 12 Stunden getrocknet. Man erhalt ij,5 g Kristalle von triacetyliertem Spiramycin I vom F = 150 bis 152*C.

BAD ORJGIMAL 109809/206 6

Beispiel 3

Reinigung des triacetylierten Spiramycins I durch Oegenstromverteilung

44,5 g rohes, wie in Beispiel 1 beschrieben erhaltenes triacetyliertes Spiramycin I werden durch Gegenstromverteilung zwischen den getrennten Phasen des Gemischss Benzol + Cyclohexan + Methanol + Wasser (45 : 55 : 80 ! 20 Volumina) gereinigt, wobei 500 Überführungen in einer Craig-Apparatur vorgenommen werden, deren Zellen ein Fassungsvermögen von 50 ecm haben. Das triacetylierte Spiramycin I befindet sich dann in den Zellen 140 bis 210 (k 1,38). Der_sInhalt der Zellen 164 bis 196 wird vereinigt und dann unter vermindertem Druck bei 25-⁹O. auf 200 ecm eingeengt· Das erhaltene wässrige Konzentrat wird bei pH 8,5 zweimal mit 1 Volumen Benzol extrahiert. Die vereinigten Benzolextrakte werden mit 20 % ihres Volumens Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 30*C unter vermindertem Druck (3 mm Hg) zur Trockne eingeengt. Man erhält 15*6 g gereinigtes triäcetyliertes Spiramycin I/ W^ " -89#S^e (c » 1 % in Äthanol)/ Oehalt: 2300 E/mg.

6,4 g dieses Produkts werden in der Wärme in 14O ecm Isopropyläther gelöst. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter vermindertem Druck auf 50 ecm eingeengt. Durch Abkühlen in einem Eisbad unter Rühren während 2 Stunden erhält man farblose Nadeln, die man abfiltriert, mit 5 ecm Isopropyläther wäscht und

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BAD GWQiNAL

- ίο -

bei 4o*C unter vermindertem Druck (5 mn Hg) 12 Stunden trocknet. Man erhält 5,25 g kristallisiertos Triacetylspiramycin I mit einem Gehalt von 2500 E/nigi F = 150 bis V52*C.

J3»75 S dieses kristallisierten, triacetylierten Spiramycins I werden in der Wärme wieder in 150 ecm Isopropyläther gelöst, und die erhaltene Losung wird filtriert und dann unter vermindertem Druck auf 45 ecm eingeengt. Durch Kristallisation in einem Eisbad wie oben erhält man schliesglich 2,5 g umkristallisiertes Triacetylspiramyoin I mit einem Gehalt von 2J5OO E/mg vom P * 156 bis 157⁰C; Drehvermögen [a]^° « -97° (c = 1 % in Äthanol).

Claims

- li - ■ Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Triacetylderivats von Spiramycin I, dadurch gekennzeichnet, daß man Spiramycin I mit Essigsäureanhydrid bei einer Temperatur von 50 bis 15Ö°C bis zur Bindung von vier Acetylresten je Molekül verestert und anschließend das Tetraacetylderivat mit wässrigem Methanol bis zur Entfernung eines der Acetylreste behandelt.

2. Als neue Verbindung Triacety!derivat von Spiramycin I, das

die Bruttoformel ^C5i^H82°l8^N2 ^besitzt» ^Del ¹^ ^Dis 157⁰C schmilzt, ein optisches Drehvermögen von [gC] = -97° (c = 1 % in Äthanol) aufweist, dessen Elementaranalyse einen Gehalt von 6o bis 6o,5 % C, 8,2 - 8,4 % H, 28,5 % 0, 2,6 - 2,65 #-N und einen Acetylgehalt von 12,5 -.12,9 anzeigt, dessen Ultraviolettspektrum (bestimmt mit einer Lösung in Äthanol) ein Absorptionsmaximum bei 2^0 nm (E,^ - 280) enthält und dessen Infrarotspektrum (bestimmt mit Presslingen einer Mischung mit Kaliumbromid) folgende hauptsächlichen Absorptionsbanden aufweist: 3^20 sehr stark, 2960 Schulter, 2920 stark, 285O stark, 2820 Schulter, 2770 mittel, 1730 sehr stark, 1Ö25 stark, 1590 Schulter, 1450 stark, 137O stark, 1^35 Schulter, 1292 mittel, 1270 sehwach, I23O sehr stark, 1170 Schulter, II50 stark, 1115 stark, I080 mittel, 1060 Schulter, lOAo sehr stark, 1020 Schulter, 985 mittel, 965 mittel, 945 Schulter, 950 Schulter, 900 mittel, 850 mittel, 835 mittel und 800 schwach.

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