AT509716B1 - Neue tetrahydroanthracenon-derivate - Google Patents

Description

österreichisches Patentamt AT509 716B1 2011-11-15

Beschreibung [0001] Die vorliegende Erfindung betrifft neue Tetrahydroanthracenon-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Antiinfektiva, vor allem gegen mehrfach wirkstoffresistente Erreger.

STAND DER TECHNIK

[0002] Durch den höchst erfolgreichem Einsatz antimikrobieller Arzneimittel wurde in den späten 1960er- und frühen 1970er-Jahren angenommen, dass Infektionskrankheiten fortan keine Gefahr mehr darstellen würden. Dies sollte sich als schwerer Irrtum heraussteilen, zumal die Mikroben 40 Jahre danach eine größere Bedrohung als jemals zuvor darstellen, weswegen ein dringender Bedarf an neuen antimikrobiellen Wirkstoffen besteht. Heutzutage sind Infektionskrankheiten die dritthäufigste Todesursache in den USA und die zweithäufigste weltweit. Für die meisten dieser Fälle sind unwirksame antimikrobielle Arzneimittel verantwortlich, und die Resistenz mancher Bakterien und Pilze gegen diese Wirkstoffe stellt in unserer Gesellschaft ein ernstes Problem dar. Statistischen Daten aus den USA zufolge wird der Großteil der im Krankenhaus erlittenen Infektionen (den sog. nosokomialen Infektionen) von wenigen Bakterienspezies hervorgerufen, nämlich von Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter sp., die nach ihren Anfangsbuchstaben als "ESKAPE'-Pathogene bezeichnet werden (Boucher et al., "IDSA Report on Development Pipeline", CID 2009:48, Infectious Disease Society of America, 1. Januar 2009). Mit diesem Begriff soll freilich gleichzeitig ausgedrückt werden, dass sich diese resistenten Erreger der Wirkung antibakterieller Arzneimittel entziehen (engl.: to escape), zumal Antibiotikaresistenz auf molekularer Ebene nichts anderes bedeutet als, dass ein Mikroorganismus die Fähigkeit erlangt hat, sich der wachstumshemmenden oder bakteriziden Wirkung einer antimikrobiellen Substanz zu widersetzen. Das heißt, die Substanz wird klinisch unwirksam. So bedeutet etwa "methicillinresistenter Staphylococcus aureus" (auch als MRSA abgekürzt, wiewohl dieselbe Abkürzung auch in allgemeinerer Weise für "multiresistenten Staphylococcus aureus" gebraucht wird), dass die Verwendung von ß-Lactamen in der Therapie von S. aureus unwirksam ist, während beispielsweise Glykopeptide zumeist Wirkung zeigen. Es ist daher unbedingt erforderlich die Wirkung von neuen Antiinfektiva gegen multiresistente Stämmen zu testen, da Wirksamkeit gegen dafür empfindliche Spezies oder Stämme nicht zwangsläufig auch Wirksamkeit gegen multiresistente Bakterien bedeutet, wie auch beispielsweise ein gegen grampositive Bakterien wirksames Mittel nicht notwendigerweise gegen gramnegative Bakterien wirkt oder umgekehrt (siehe u.a. Boucheret al., s.o.).

[0003] Neben Bakterien und Pilzen fehlen gegenwärtig aber auch wirksame Strategien gegen respiratorische Viren. Zumeist werden lediglich die Symptome geheilt, ohne das Virus selbst zu bekämpfen. Eine Lösung für die Zukunft könnten vor allem Wirkstoffkombinationen sein.

[0004] In der Vergangenheit wurden in endophytischen Pilzen zahlreiche Substanzen zur Bekämpfung der Vermehrung von Mikroorganismen gefunden. Diese Substanzen zeigen in einer Reihe von Fällen sehr gute antibakterielle, antifungale und antivirale Aktivität und könnten für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden (G. A. Strobel, Crit. Rev. Biotechnol. 22, 315-333 (2002)). Aufgrund der Tatsache, dass diesbezügliche Forschung überwiegend akademisch war und nicht direkt die Entwicklung neuer Wirkstoffe zum Ziel hatte, sind heute kaum entsprechende Arzneimittel auf dem Markt. Insbesondere das Screenen gegen resistente Mikroben wurde in der Vergangenheit vernachlässigt, so dass nur einige wenige Substanzen gegen arzneimittelresistente Mikroben gestestet wurden. Noch schlimmer ist die Lage bei respiratorischen Viren, gegen die bisher nahezu keine Substanzen gescreent wurden.

[0005] Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstands haben in früheren Arbeiten (vgl. die österreichischen Patentanmeldungen AT AM 842/09, nunmehr Patent AT 507.298, und AT AM 843/09) die Wirksamkeit von sowohl bekannten als auch neuen Altersolanol- und Alterporri-ol-Derivaten als Antiinfektiva herausgefunden. Dabei handelt es sich um optisch aktive Anthra-chinon-Derivate, die durch die nachstehenden allgemeinen Formeln dargestellt werden können 1 /10 österreichisches Patentamt AT509 716B1 2011-11-15 und deren Namen von den Pilzen abgeleitet wurde, aus denen die jeweils ersten Vertreter isoliert werden konnten, nämlich Alternaria solani, einem Schimmelpilz, der die sog. Dürrfleckenkrankheit bei Kartoffeln hervorruft, und Alternaria porri, Erreger der Purpurfleckenkrankheit bei Zwiebelgemüse. Die erste, bereits 1969 isolierte Verbindung wurde als Altersolanol A bezeichnet:

OH

Altersolanol A: 7-Methoxy-2-methyl-(1R.2S,3R,4S)‘1,2,3,4-tetrahydro-1,2,3,4,5-pentahydroxyanthracen“9,10-dion [0006] Altersolanole entsprechen im Allgemeinen einer der beiden Formeln (1) und (2): R ,ch3 H3C" ΥΊγ O Λ R r*' CH, f^R2 R3 OH r 0 (2} [0007] wobei R1 bis R4 jeweils H oder OH sein können, was im Falle von OH in Formel (2) jeweils ein chirales Kohlenstoffatom ergibt, das sowohl in R- als auch in S-Konfiguration vorliegen kann. Die "dimeren" Alterporriole entsprechen im Allgemeinen der folgenden Formel (3):

[0008] wobei ähnlich vielfältige Substitutions- und Hydrierungsmuster an den aromatischen Ringen möglich sind wie für die "monomeren" Altersolanole. Aufgrund eingeschränkter Freiheit der Rotation um die Achse der chemischen Bindung zwischen den Anthrachinon-Kernen liegen zahlreiche Alterporriol-Derivate in Form zweier Atropisomere vor.

[0009] Die Erfinder haben in Ergänzung der wenigen älteren Berichte über mögliche anti-infektive Wirksamkeit derartiger Verbindungen herausgefunden, dass es unmöglich ist vorherzusagen, ob ein bestimmtes Altersolanol- bzw. Alterporriol-Isomer oder -Derivat antiinfektive Wirkung zeigt oder nicht, geschweige denn gegen welche Gattungen oder gar Spezies von (Mikro-)Organismen (d.h. Viren, Bakterien, Pilze).

[0010] Dies gilt natürlich gleichermaßen für andere, strukturell ähnliche Mono- und Bis-anthracenone. Bekannte Vertreter, wie die nachstehend als Beispiele für mögliche Substituti- 2/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15 onsmuster-Variationen angeführten Atrovirin B (erstmalig aus Cortinarius atrovirens isoliert), Icterinoidin und Flavomannin, wurden zumeist ebenfalls aus Pilzen isoliert und finden gelegentlich auch in der Medizin Verwendung. So haben sich beispielsweise Flavomannine und Methylether davon aufgrund ihrer antiproliferativen Wirkung als wirksame Antitumormittel erwiesen. OH OH 0 OH OH 0

icterinoidin

Atrovirin B

CH3 OH

[0011] Derartige Verbindungen weisen zumindest ein Chiralitätszentrum im Molekül auf und liegen daher in Form von Enantiomeren vor, wobei in der Regel auch Atropisomerie auftritt.

[0012] Berichte bezüglich der antimikrobiellen Wirksamkeit derartiger Verbindungen fehlen jedoch weitestgehend. So ist lediglich eine Studie bekannt, in der die beiden Atropisomere von Atrovirin B, aus Talaromyces wortmannii isoliert, gegen Mikroorganismen getestet wurden. Als Ergebnis zeigten beide Isomere keinerlei Aktivität gegen Bacillus subtilis, Saccharomyces cere-visiae, Cladosporium cucumerinum und Cladosporium herbarum (I.D. Intriani, "Biodiversität von Pilzen mariner Herkunft und Identifizierung ihrer Sekundärstoffe", Diss., Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2007)).

[0013] Das Ziel der Erfindung war vor diesem Hintergrund die Identifikation, Isolierung und Herstellung neuer Substanzen zur Verwendung als antimikrobielle Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen, vor allem von Verbindungen, die Aktivität gegen mehrfach wirkstoffresistente ("multiple drug resistant", MDR-) Erreger zeigen.

[0014] Die Erfinder konnten nun im Verlauf ihrer Forschungen zwei Substanzen mit bisher unveröffentlichter Struktur, d.h. neue chemische Verbindungen, identifizieren, die gute Aktivität gegen Mikroorganismen, insbesondere auch gegen MDR-Erreger, zeigen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

[0015] Konkret haben die Erfinder die folgenden neuen chemischen Verbindungen hergestellt, isoliert und charakterisiert: Ra- und Sa-(7R,7'R)-7,7'-Dimethyl-2,2',3,3',7,7', 10,10-octahydroxy-7,7 ,8,8-tetrahydro-1,1'-bianthracenyl-5,5'(6H,6'H)-dion, die - wegen der eingeschränkten Freiheit der Rotation um die Bindung zwischen den beiden Anthracenon-Einheiten - Atropisomere darstellen, die als "Atrovirin C1" und "Atrovirin C2" bezeichnet werden, sobald die eindeutige Zuordnung der Ra- und Sa- bzw. Plus-(P-) und Minus- (M-) Konfiguration zu den beiden isolierten Rotameren feststeht, was bislang noch nicht erfolgt ist. Die nachstehende Formel für Atrovi- 3/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15 rin C bezeichnet daher beide Atropisomere:

Atrovirin C

[0016] Bezüglich der Nomenklatur sei darauf hingewiesen, dass für derartige Anthracen-Dimerstrukturen anstelle von Bianthracenyl auch die Bezeichnungen Biathracen oder Bi-santhracen geläufig sind, wobei die Nummerierung der Kohlenstoffatome mitunter an der Stelle der Ketogruppe beginnt, was die neuen Verbindungen zu 5, 5'-Bi(s)-anthracenen machen würde. In Anlehnung an Biphenyl und andere Biaryle sind derartige Verbindungen jedoch gemäß lUPAC-Empfehlungen als 1, 1'-Bianthracenyle zu bezeichnen.

[0017] Da die neuen Verbindungen in Screening-Versuchen ausgezeichnete antimikrobielle Wirkung zeigten, besteht ein zweiter Aspekt der Erfindung in der Verwendung dieser neuen Verbindungen als Antiinfektiva, vorzugsweise gegen grampositive und gramnegative Bakterien, und insbesondere als Antiinfektiva gegen mehrfach wirkstoffresistente ("multiple drug resistant", MDR-) Erreger.

[0018] Speziell werden die Verbindungen vorzugsweise gegen mehrfach wirkstoffresistente Stämme von methicillinresistentem Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli, Klebsiella sp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis bzw. faecium, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter, Propionibacterium acnes, Clostridium difficile und Enterobacter sp. eingesetzt, was durch die späteren Ausführungsbeispiele im Detail belegt wird.

[0019] Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen, das darin besteht, einen die Verbindung oder einen Vorläufer davon produzierenden Mikroorganismus unter Wachstumsbedingungen zu fermentieren und die jeweilige Verbindung, gegebenenfalls nach Zerstörung der Zellen des Mikroorganismus zur Erhöhung der Ausbeute, aus der Kultur zu gewinnen. In einem solchen Fermentationsverfahren wird als Mikroorganismus vorzugsweise ein reiner Stamm von Talaromyces wortmannii eingesetzt, da die Erfinder mit dieser Spezies die besten Ausbeuten erzielen konnten. Alternativ dazu können jedoch auch beliebige andere Mikroorganismen, die in der Lage sind, die neuen Verbindungen - oder auch Vorstufen davon - zu produzieren, z.B. Cortinarius atrovirens oder Stemphylium globuliferum, zur Fermentation eingesetzt werden. Werden durch die Fermentation Vorstufen erhalten, können diese nach beliebigen, dem einschlägigen Fachmann auf dem Gebiet der organischen Synthese wohlbekannten Verfahren in die gewünschten neuen Verbindungen übergeführt werden, wobei gegebenenfalls auch Verfahrensschritte unter Enzymkatalyse eingesetzt werden können, um höhere Stereoselektivität zu gewährleisten.

[0020] Beispielsweise kann etwa Cortinarius atrovirens kultiviert werden, um aus der Fermentationsbrühe Atrovirin B (oder auch ein anderes Mitglied der Atrovirin-Familie) zu erhalten, das 4/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15 einer formalen Dehydratisierung an C3-C4 und C3'-C4', gegebenenfalls nach Austausch der Hydroxylgruppen an C4 und C4' gegen lod zur anschließenden Dehydroiodierung oder gegen eine andere, zusammen mit den H-Atomen an C3 und C3' eliminierbare Abgangsgruppe, vorzugsweise unter Schützen der übrigen OH-Gruppen von Atrovirin B mit herkömmlichen Schutzgruppen, unterzogen wird, um das entsprechende Diarin-Derivat zu erhalten, das in der Folge durch (formale) stereoselektive Addition von Wasser in Atrovirin C der vorliegenden Erfindung übergeführt werden kann.

[0021] Ein weiterer Syntheseweg besteht im Isolieren einer Verbindung aus der Fermentationsbrühe, die eine Methylgruppe an C7 sowie an C6, C7 bzw. C8 eine oder mehrere Gruppen (z.B. OH-Gruppen) aufweist, die auf geeignete Weise eliminiert werden können, um eine Doppelbindung zwischen C6 und C7 bzw. C7 und C8 und somit ein prochirales Zentrum an C7 zu erhalten. Anschließend kann diese Doppelbindung enzymatisch (re)hydratisiert werden, was bei geeigneter Wahl der Stereospezifität des Enzyms (z.B. Hydratase, Peroxygenase) die gewünschte Verbindung der vorliegenden Erfindung ergibt. Dieselbe Vorgangsweise kann natürlich an den entsprechenden Atomen des zweiten Anthracenon-Grundkörpers im Molekül durchgeführt werden.

[0022] Geeignete Enzyme für die Syntheseschritte zur Umsetzung von Vorläufern der gewünschten Verbindung können in manchen Fällen ebenfalls aus dem zur Fermentation eingesetzten oder auch aus einem anderen Mikroorganismus isoliert werden. Letzterer Fall kann sinnvoll sein, wenn beispielsweise ein Mikroorganismus zwar das gewünschte Produkt produziert, aber z.B. in so geringen Mengen oder so stark verunreinigt, dass es wirtschaftlicher ist, durch Kultivierung eines anderen Stamms (oder sogar einer anderen Spezies oder Gattung) einen Vorläufer des Produkts zu erhalten und diesen mittels enzymatischer Synthese zur Zielverbindung umzusetzen.

[0023] Die Gewinnung der jeweiligen Verbindung erfolgt gemäß vorliegender Erfindung jedoch vorzugsweise durch Extraktion und anschließende Isolierung aus einem Rohextrakt einer Kultur, z.B. mittels fraktionierter Kristallisation oder Chromatographieverfahren, noch bevorzugter präparativer HPLC, was bisher erneut die besten Ausbeuten bei gleichzeitig höchster Reinheit ergeben hat. Freilich sind speziell bei Ansätzen in größerem Maßstab auch andere Isolierungsverfahren, wie z.B. direkte fraktionierte Kristallisation des Rohextrakts oder auch Absorptionsmethoden, denkbar. Der Fachmann kann jedoch ohne übermäßiges Experimentieren das für den jeweiligen Kultivierungs- (bzw. Synthese- oder Partialsynthese-) Schritt geeignete Isolierungsverfahren ermitteln.

BEISPIELE

[0024] Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf konkrete Ausführungsbeispiele näher beschrieben, die jedoch den Schutzumfang nicht einschränken sollen.

[0025] Die neuen Verbindungen der Erfindung wurden durch Kultivierung von Talaromyces wortmannii und anschließende Extraktion erhalten.

ISOLIERUNG DES MIKROORGANISMUS

[0026] In kleine Stückchen zerkleinerte Blätter von Aloe vera (Echte Aloe) wurden zur Isolierung des endophytischen Pilzes verwendet. Die Oberfläche der Stücke wurde zweimalig mit 70%igem Ethanol 2 min lang sterilisiert und danach mit sterilem Wasser abgespült, um den Alkohol zu entfernen. Zur Unterscheidung etwaiger verbliebener epiphytischer Pilze von endophytischen Pilzen wurde ein Abdruck der Blattoberfläche auf Biomalzagar angefertigt. Kleine Gewebeproben aus dem Inneren wurden aseptisch aufgeschnitten und in Petrischalen auf Malzagarmedium gepresst, das zur Unterdrückung von bakteriellem Wachstum ein Antibiotikum enthielt. Die Zusammensetzung des Isoliermediums war folgende: 15 g/l Malzextrakt, 15 g/l Agar und 0,2 g/l Chloramphenicol in destilliertem Wasser, pH 7,4-7,8). Aus den Kulturen wurde durch wiederholtes Überimpfen auf Malzagarplatten ein reiner Pilzstamm erhalten.

[0027] Die Pilzkultur wurde nach einer molekularbiologischen Vorschrift mittels DNA-Amplifi- 5/10 österreichisches Patentamt AT509 716B1 2011-11-15 kation und Sequenzierung der ITS-Region als Talaromyces sp. identifiziert. Zur Klärung der Spezies wurde eine Probe an die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland, gesandt, wo der Pilzstamm als Talaromyces wortmannii identifiziert wurde. Die Sequenzdaten wurden bei GenBank unter der Zugriffsnummer HM 807532 hinterlegt.

KULTIVIERUNG

[0028] Zur Kultivierung von Talaromyces wortmannii wurden zwei 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 g Reis und 100 ml destilliertes Wasser enthielten, autoklaviert, um ein gequollenes, festes Reismedium zu erhalten. Ein kleiner Teil des obigen Isoliermediums, das den reinen Pilzstamm enthielt, wurde unter sterilen Bedingungen auf das feste Reismedium aufgebracht, und der Pilz wurde bei Raumtemperatur (22°C) 40 d lang kultiviert.

EXTRAKTION UND ISOLIERUNG

[0029] Nach 40 d wurde die Kultur zweimal mit 300 ml Ethylacetat (EtOAc) extrahiert. Der EtOAc-Extrakt wurde bis zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen n-Hexan und 90%igem Methanol verteilt. Eindampfen der Methanol-Phase ergab einen Rückstand, der Säulenchromatographie über eine Diaion HP20-Säule mit Laufmitteln abnehmender Polarität, nämlich Wasser/Methanol, Aceton/Methanol und reinem Aceton, unter Detektion mittels Dünnschichtchromatographie (DC) auf Kieselgel F245 (Merck, Darmstadt, Deutschland) unterzogen wurde. Die die gewünschten Verbindungen enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und semipräparativer HPLC (Merck, Hitachi L-7100) unter Verwendung einer Eurosphere 100-10 C18-Säule (300 x 8 mm, L x i.d.) und eines linearen Wasser-Methanol-Gradienten mit zunehmender Polarität als Laufmittel unterzogen. Auf diese Weise wurden die neuen Verbindungen der Erfindung als getrennte Atropisomere in reiner Form erhalten.

ANALYTIK VERBINDUNG 1 [0030] Diese Verbindung wurde als braunes, amorphes Pulver mit guter Löslichkeit in Methanol erhalten. Im UV-Spektrum sind Maxima bei 235,5, 278,1 und 408,0 nm zu erkennen. Bei der obigen HPLC wurde eine Retentionszeit von 27,0 min festgestellt. Aus dem ESI-MS-Spektrum im positiven Modus ergibt sich das Molekülion bei m/z[M+H]+ 547,3 als Basispeak, während die Messung im negativen Modus einen Molekülion-Peak bei m/z [M-H] 545,4 zeigt, woraus ein Molekulargewicht von etwa 546 g/mol folgt. Aus dem Wert m/z [M+H]+ 547,2074 als Pseudomo-lekülion-Peak bei HRESI-MS ergibt sich die Summenformel zu C3oH27010 (ber.: 547,53), d.h. eine Summenformel für Verbindung 1 von C3oH26010, woraus ein Molekulargewicht von 546,52 folgt. Die Daten der in nachstehender Tabelle 1 angegebenen 1H- und 13C-NMR-Spektren sowie des ESI/MS-Spektrums sind mit Ausnahme der Lage der aromatischen Protonen sehr ähnlich zu jenen von Atrovirin B. Das 1H-NMR-Spektrum zeigt Signale einer tertiären Methylgruppe bei δ 1,41 (3H, s, H-11), zwei Methylengruppen bei δ 2,76 (2H, m, H-6) und δ 3,09 (2H, m, H-8), sowie zwei aromatische Protonen bei δ 6,72 (1H, s, H-4) und δ 6,87 (1H, s, H-9). Das 13C-Spektrum umfasst 15 Kohlenstoffsignale, die gemäß DEPT-Messungen einer Methylgruppe, zwei Methylengruppen, zwei Methingruppen und zehn quaternären Kohlenstoffatomen zugeordnet werden können. Die HMBC-Daten bestätigen dies und zeigen innerhalb der Verbindung Proton-Kohlenstoff-Fernkorrelationen. Das aromatische Proton bei δ 6,72 (1 H, s, H-4) korreliert mit drei Sauerstoff tragenden aromatischen Kohlenstoffatomen an δ 159,0, 161,5 und 167,8, die C2, C3 und C10 entsprechen. Weiters korreliert H-4 über ω-Korrelationen auch mit den Kohlenstoffatomen C9 und C9a. Darüber hinaus zeigt das COSY-Spektrum Fernkorrelationen zwischen den in einem aliphatischen Ring liegenden Protonen H-8 und dem in einem aromatischen Ring liegenden Proton H-9, was mittels ROESY bestätigt wurde. Eine Bestätigung des Spinsystems im aliphatischen Ring erfolgte durch die beobachteten COSY-Crosspeaks und die HMBC-Messung. VERBINDUNG 2 [0031] Diese Verbindung wurde ebenfalls als braunes, amorphes Pulver mit guter Löslichkeit in 6/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15

Methanol erhalten. Im UV-Spektrum sind Maxima bei 234,7, 279,4 und 410,3 nm zu erkennen. Bei der obigen HPLC wurde eine Retentionszeit von 23,6 min festgestellt. Aus dem ESI-MS-Spektrum im positiven Modus ergibt sich das Molekülion ebenfalls bei m/z [M+H]+ 547,4 als Basispeak, während die Messung im negativen Modus einen Molekülion-Peak bei m/z [M-H] 545,4 zeigt, woraus erneut ein Molekulargewicht von etwa 546,4 g/mol folgt. Aus LCMS-Daten, UV-Spektren und NMR-Daten (COSY, HMBC) folgt, dass das Molekül ein Isomer von Verbindung 1 sein muss. Das in nachstehender Tabelle 1 angegebene 1H-NMR-Spektrum zeigt Signale einer tertiären Methylgruppe bei δ 1,43 (3H, s, H-11), zwei Methylengruppen bei δ 2,83 (2H, m, H-6) und δ 3,05 (2H, dd, J=12,5 Hz, H-8), sowie zwei aromatische Protonen bei δ 6,72 (1H, s, H-4) und δ 6,87 (1H, s, H-9). Die 2D-NMR-Daten sind für beide Verbindungen sehr ähnlich.

[0032] Tabelle 1:1H-NMR- und 13C-NMR-Daten von Verbindung 1 und Verbindung 2

Verbindung 1 Verbindung 2 Atom Nr. Ή-NMR IJC-NMR* Ή-NMR IJC-NMR 1 106,8 2 159,0 3 161,5 4 6,72 6,72 102,9 4a 108,7 5 203,3 6 2,76 51,0 2,83 51,0 7 70,0 70,7 8 3,09 48,0 3,05 43,7 8a 137,0 137,5 9 6,87 118,0 6,87 117,1 9a 141,0 141,6 10 167,8 10a 107,0 107,7 11 1,41 29,0 1,43 29,2 * Ia C-Daten wurden dem HMBC-Spectrum entnommen.

[0033] Aufgrund der Lage und Anzahl an Signalen in den jeweiligen Spektren der beiden Verbindungen ist klar, dass sie Dimere mit jeweils derselben stereochemischen Konfiguration in ihren Molekülhälften sein müssen. Da beide Verbindungen gleiche(s) Molekulargewicht und UV-Absorptionsmaxima und weitestgehend gleiche 1H-NMR-, COSY- und HMBC-Daten aufweisen, müssen sie nahezu dieselbe Struktur besitzen.

[0034] Zur Bestimmung der Stereochemie am chiralen Zentrum C7 wurde die chemische Verschiebung der enantiotopen Methylenprotonen an C8 im 1H-NMR-Spektrum in Analogie zu Atrovirin B1 und B2 berechnet (M. Gill und P.M. Morgan, ARKIVOC 2004 (x), 152-165). Für die beiden Verbindungen ergab sich eine Differenz zwischen den axialen und den äquatorialen Wasserstoffen von Δδ < 0,002 bzw. Δδ < 0,003, so dass beide in 7R-Konfiguration vorliegen müssen.

[0035] Die Zuordnung der Ra- und Sa- bzw. Plus- (P-) und Minus- (M-) Konfiguration zu den beiden isolierten Rotameren soll demnächst erfolgen.

AKTIVITÄTSBESTIMMUNG

[0036] Die Aktivität der neuen Verbindungen wurden in zwei unterschiedlichen Screeningsystemen getestet. Die antibakterielle Aktivität wurde in einem MHK-Test untersucht.

[0037] MHK steht für die "minimale Hemm-Konzentration" (engl.: MIC für "minimal inhibitory concentration") und bezeichnet die niedrigste Konzentration einer Substanz, bei der mit bloßem Auge keine Vermehrung von Mikroorganismen wahrgenommen werden kann. Bestimmt wird die MHK mit einem so genannten Titerverfahren, bei dem die Substanz ausverdünnt und anschlie- 7/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15 ßend der Erreger zugefügt wird.

[0038] In der Regel wird so die Konzentration eines Antibiotikums bestimmt, die das Wachstum eines Bakterienstammes gerade noch hemmt. Die MHKwird in Mikrogramm pro Milliliter (pg/ml) angegeben, und die Verdünnungen erfolgen in der Regel in log2-Schritten. Hierin wurde eine Ausgangskonzentration von 250 pg/ml jeweils auf das Doppelte verdünnt, was folglich Testkonzentrationen von 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,25 pg/ml, 15,6 pg/ml, 7,8 pg/ml usw. ergab. Niedrigere Werte spiegeln demnach bessere Aktivität als Antiinfektivum wider.

[0039] Die Tests wurden nach den vom EUCAST (European Committee for Antimicrobial Sus-ceptibility Testing) geforderten Standards durchgeführt. In der umseitigen Tabelle 2 sind die Testergebnisse bezüglich der antiinfektiven Wirkung gegen einige multiresistente Bakterien für die neuen Verbindungen sowie einige bekannte Vergleichssubstanzen angeführt. Sämtliche Daten sind Mittelwerte von Mehrfachbestimmungen.

[0040] Es ist klar ersichtlich, dass die neuen Verbindungen der Erfindung - mitunter ausgezeichnete - Aktivität gegen sämtliche getesteten Bakterienspezies zeigen, wobei beide Atrovirin-C-Isomere in dieser Testreihe ein sehr breites Aktivitätsspektrum aufweisen und somit bestens geeignete Kandidaten für Wirkstoffe in Breitband-Antibiotika darstellen. 8/10 österreichisches Patentamt AT509 716 B1 2011-11-15

Tabelle 2: MHK-Werte bei multiresistenten Bakterien

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