WO2005080311A1 - Hygrophorone und deren derivate - Google Patents

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WO2005080311A1
WO2005080311A1 PCT/EP2005/001957 EP2005001957W WO2005080311A1 WO 2005080311 A1 WO2005080311 A1 WO 2005080311A1 EP 2005001957 W EP2005001957 W EP 2005001957W WO 2005080311 A1 WO2005080311 A1 WO 2005080311A1
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Ludger A. Wessjohann
Norbert Arnold
Tilo Lübken
Hans Locher
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Leibniz-Institut Für Pflanzenbiochemie (Ipb)
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/007—Esters of unsaturated alcohols having the esterified hydroxy group bound to an acyclic carbon atom
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members

Definitions

  • the present invention relates to hygrophorones and their derivatives which have biocidal, in particular fungicidal and bactericidal, properties, processes for their preparation and the use of these compounds.
  • Mushrooms of the genus Schnecklinge live in symbiosis with various deciduous and coniferous trees. Many of these species are characterized by the fact that their fruiting bodies are covered by a thick layer of mucus. Some species in the genus snail are characterized by macroscopic color reactions. For example, the stems of some mushrooms turn yellow when they are wetted with potassium hydroxide solution. A detailed examination of the fruiting bodies of the snails shows that they are hardly affected by parasitic fungi. Both the color reaction and the ecological observation outlined above suggest that some snails may be of interest with regard to the development of novel compounds with biocidal properties.
  • Cyclopentenones with short chain substituents are known as compounds with various biological properties.
  • S. Ohira et al., Tetrahedron Letters 45 (2004) disclose that diastereomers of pentenocin B have inhibitory properties for enzymes that convert interleukin-1-beta.
  • the compounds disclosed there are distinguished by the fact that the basic cyclopentonone structure has only short-chain radicals.
  • M. Pohmakotr et al. in Tetrahedron Letters 43 (2002) 7385 to 7387 disclose the synthesis of dehydropentenomycin and analogous compounds. These compounds are characterized in turn by the fact that the basic cyclopentonone structure is only substituted by short-chain radicals.
  • the cyclopentenoids disclosed there show antibiotic properties.
  • the compounds of the present invention are distinguished in that they are based on the basic structure of the known antibiotic pentenomycin (I). However, the compounds of the present invention are distinguished by new substitution patterns which have not yet been disclosed in connection with the basic structure of pentenomycin. In addition, the compounds of the present invention, which are also called hygrophorones, show a strong fungicidal and bactericidal activity. Furthermore, the compounds of the present invention show good surface properties.
  • the compound groups found according to the invention thus show activity against different organism groups, as well as a significantly higher or different biological activity compared to the known compound pentenomycin. For example, the compounds of the present invention show different surface properties, higher lipophilicity, membrane permeability and cell permeability. These compounds are characterized by these particular properties Invention and demonstrate that the compounds of the present invention are valuable substances with interesting biocidal properties.
  • the compounds of the present invention are distinguished by the basic structure (II) or (III). With regard to the biological properties, it can be stated that the cyclopenten-1-ols of structure (III) have a lower biological activity than the corresponding ketone compounds of structure (II).
  • X represents hydrogen, a short alkyl chain, preferably having 1 to 6 carbon atoms, more preferably having 1 to 4 carbon atoms, in particular methyl or ethyl, OH, O-alkyl, where alkyl is as defined above, or OR ', in particular what is serstoff, -Methyl and ethyl are preferred, especially hydrogen. If the group X is a hydroxyl group and the group OR 'which is also present on the same carbon atom is also a hydroxyl group, a ketone group can also be provided instead of the two hydroxyl groups.
  • R ' is either absent (in the grouping shown with the dashed bond to form a ketone) or R' is hydrogen or acyl, where acyl means the group CO-H or CO-alkyl, where alkyl is as defined above is.
  • the alkyl group of the acyl group is preferably methyl, ethyl, propyl or butyl, which also includes isopropyl and tertiary butyl.
  • R ' is particularly preferably hydrogen or methyl acyl, ethyl acyl, propylacyl or butyl acyl and in the group with the broken bond R' is preferably absent, so that a ketone group is formed.
  • the group R ' can also be a bridging group that connects two oxygen atoms connected to R'.
  • R ' preferably represents an alkylidene group having 1 to 3 carbon atoms or a grouping -CO-, or a combination thereof, if five-membered, six-membered or seven-membered rings are formed.
  • the groups R 'present in a compound can be the same or different. The following options are preferred: the two groups R 'on the carbon atoms 4 and 5 are either both OH or both acyl or the group R' on the carbon atom 5 is OH and the group R 1 on the carbon atom 4 is acyl. Further preferred configurations result from the examples.
  • R represents hydrogen, halogen, preferably fluorine, chlorine, alkyl, as defined above, preferably methyl or ethyl, or perhaloalkyl, alkyl being as defined above.
  • perhaloalkyl groups perfluoroalkyl is preferred, particularly preferably CF 3.
  • the two groups R can be independent, the same or different from each other.
  • R is preferably hydrogen or alkyl, particularly preferably hydrogen.
  • the side chain R is of essential importance for the present invention. It can be selected from the following options:
  • side chain R is a linear alkyl chain with 5 to 22 carbon atoms, preferably an even-numbered radical, particularly preferably C 0 H 21 , C 12 H 25 , C ⁇ 4 H 29 or C ⁇ 6 H 33 .
  • Alkyl chains with 7 or more carbon atoms are preferred, preferably 10 or more carbon atoms.
  • oligoprenyl radical (IVa) - Another alternative for the side chain R is an oligoprenyl radical (IVa) -, where n is from 1 to 10.
  • the bond drawn in dashed lines indicates that these residues can be partially or completely hydrogenated.
  • oligoprenyl residues which are preferred in the context of the present invention include geranyl, neryl, farnesyl, geranylgeranyl, phytyl and solanosyl.
  • this group R is a residue of the same type linked to the oligoprenyl residue (IVa) regioinversely, i.e. X and the point of attachment (bond that crosses the serpentine line) are reversed.
  • N is preferably from 1 to 5.
  • Another alternative for the side chain R is a noroligoprenyl residue (IVb), in which the first CH 2 group is missing at the binding site compared to IVa.
  • IVb a noroligoprenyl residue
  • the preferred embodiments specified in connection with group IVa also apply to group IVb.
  • V polyethylene glycol residue
  • m is 0 or 1
  • p is from 0 to 50, preferably from 3 to 10
  • X is selected from OH, OMe or OAc, where Ac (Acyl) as defined above.
  • OMe is particularly preferred.
  • R "is hydrogen, X is hydrogen, R 'is hydrogen or -C ( 0) methyl, and R is an even-numbered, linear alkyl chain.
  • R "is hydrogen, X is hydrogen, the group R 'is absent from the residue shown with the dashed bond and the remaining residues R' are either both hydrogen or one of the remaining residues R 'is hydrogen and the other is -C ( 0) -Me, it being preferred that the hydroxyl group sits on the carbon atom of position 5 of the cyclopentenone ring.
  • Other preferred compounds are as follows:
  • compounds of the general formula (II) with 1 'alcohol oxidation state selected from:
  • butyrolactone derivatives which are characterized by the following structure:
  • both the E and the Z isomers are included, together in a mixture or individually and where Z is a linear alkyl group having 5 to 22 carbon atoms (again the preferred embodiments already described above apply here) or the remainder CH 2 -0-phenyl , and wherein R "is as defined above, preferably both radicals R" represent hydrogen.
  • the compounds of the present invention are distinguished by the biocidal properties defined at the outset.
  • the compounds of the present invention are therefore particularly suitable as a biocide, in particular for the treatment of surfaces for disinfection and for use against biofilms.
  • the connections of the The present invention can be used as a fungicide, in particular for the treatment of fungal diseases in living organisms, ie plants, animals and humans.
  • the compounds of the present invention can be used as wood preservatives and for protecting other building materials against fungal attack.
  • the compounds of the present invention can be used as an antibiotic, in particular for the treatment of infections with gram-positive germs.
  • the compounds of the present invention can be used as inhibitors of interleukin-1-beta converting enzymes.
  • the uses disclosed in the context of the present invention also relate to the formulation of the compounds according to the invention in suitable forms, e.g. in the form of pharmaceutical preparations comprising at least one compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • suitable forms e.g. in the form of pharmaceutical preparations comprising at least one compound of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • solutions, suspensions, emulsions, ointments, tablets, capsules, solutions or emulsions for spray use, etc. can be provided so that the compounds of the present invention can be suitably used in the respective fields of use.
  • the compounds of the present invention can also be combined with other auxiliaries and other pharmaceutically active compounds, in particular with active agents which act against gram-negative bacteria.
  • the compounds of the present invention can be prepared by either a semi-synthetic or a fully synthetic route, and the person skilled in the art can use the conventional synthetic methods of organic chemistry.
  • a mass can be extracted from fresh or freeze-dried material in comminuted form with non-polar (preferably petroleum ether, alkanes, ethyl acetate) or polar solvents (ethanol, methanol, acetone). Extraction with supercritical C0 2 is also suitable.
  • Usual extraction aids such as chemical aids (e.g. salt) but above all physical aids (stirring, ultrasound, heat, pressure) can help to improve the extraction. Further details can be found in the attached examples, which show by way of example how the compounds according to the invention can be obtained by extracting natural raw materials. Suitable raw materials are mushrooms of the genus Schnecklinge, in particular H. persoonii, H. olivaceoalbus, H. latidabundus and H. pustulatus.
  • the compounds of the present invention have strong antibiotic and antifungal properties.
  • the compounds of the present invention also exhibited activity in particular against strains resistant to vancomycin.
  • the present invention therefore makes it possible to provide biocidal agents which can be used against strains which are already resistant.
  • Hygrophorones are soluble in petroleum ether, methanol or chloroform but not in water. Therefore, they can easily be extracted from mushroom material with petroleum ether. The yield of an extraction is greater when using fresh raw material or frozen raw material compared to freeze-dried material. All hygrophorones are sensitive to bases and strong acids. They can easily be detected on TLC plates, either by development with a hydroxide solution or by heating, which causes the hygrophorones to turn yellow or brown. The second alternative is simpler and more sensitive.
  • the petroleum ether extract from H. latitabundus is a rich source of cyclopentenone derivatives ives (19, 20).
  • the petroleum ether extract of H. persoonii contained two butyrolactone hygrophorones F 12 (27) and G 12 (28). They were able to isolate SPE, HPLC, and further column chromatography.
  • Preparative HPLC was performed with Merck-Hitachi L-6250 low pressure gradient pump with an L-4250 UV detector or with a Varian ProStar 218 system with a PrepStar 330 photodiode array detector.
  • ESI mass spectra were recorded with a Bruker Apex III Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, USA), equipped with an Infinity TM cell, a 7.0 Tesla superconducting magnet (Bruker , Düsseldorf, Germany), an RF-oniy hexapole ion guide and external electrospray ion source (Agilent, off axis spray). The sample solutions were fed continuously by a spray pump at a flow rate of 120 ⁇ l h "1 .
  • FT-ICR Fourier transform ion cyclotron resonance
  • GC-MS measurements of the methylboronated compound 18 were carried out using a GC-MS system (Voyager, ThermoQuest): 70 eV El, source temp. 200 ° C; Column DB-5MS (J&W, 30 mx 0.25 mm, 0.25 ⁇ m film thickness), injection temperature 250 ° C, interface temperature 300 ° C, carrier gas He, flow rate 1.0 ml / min, constant flow mode, splitless injection, temperature program for the column: 60 ° C for 1 min, then rise to 300 ° C at a rate of 10 ° C min "1 , isothermal at 300 ° C for 20 min).
  • the derivatization with the boron compound was carried out in a known manner. (Takatsuto et al., 1982).
  • IR spectra were measured with a Bruker IFS 28, CD and UV spectra with a Jasco J-710. The specific rotation was measured with a JASCO DIP-1000 polarimeter.
  • H. latitabundus was collected under Pinus sylvestris near Bad Bibra, in November 2002 (leg./det. M. Huth).
  • H. olivaceoalbus was collected from Picea abies near Kelheim, in September 2001 (leg. T. Lübken / det. N. Arnold).
  • H. persoonii became Quercus robur near Ingolstadt in September 2000 (leg./det. N. Arnold) collected.
  • H. pustulatus was collected from Picea abies near Harzgerode in November 2001 (leg. T. Lübken / det. Arnold). Samples are deposited with the Leib ⁇ iz Institute for Plant Biochemistry Halle (IPB).
  • Frozen fruiting bodies of H. persoonii (229 g) were extracted three times with light petrol (40-60 ° C). The light yellow solution was concentrated in vacuo to obtain an oily mass (1,453 g), which was initially adsorbed onto a Chromabond diol cartridge. Then it was fractionated by sequential extraction, with 50%, 70%, and 100% aqu. MeOH.
  • Fractions from 28.0 to 31.0 min contained 1.3 mg of 4-0-acetylhygrophoron A 2 (2) and 1.7 mg of 6-O-acetylhygrophoron A 12 (3), which were further purified by repeated HPLC.
  • Fractions from 34.0 to 37.0 min contained 1.2 mg of a mixture of 4-O-acetylhygrophoron A 4 (5) and 6-O-acetylhygrophoron A 14 (6), which was not further treated.
  • Fractions from 33.0 to 34.0 min contained hygrophoron F 12 (27) together with G 12 (28). Further purification by column chromatography over Lichroprep diol with CHCI 3 gave 0.9 mg 27 and traces of 28.
  • a solution of 13.6 mg 1 in pyridine (1.5 ml) and a few drops of acetic anhydride were added and it was stirred one night. After removal of the solvents in vacuo, the peracetylated derivative 8 was obtained in quantitative yield.
  • Frozen fruiting bodies of H. olivaceoalbus (570 g) were extracted three times with light petrol (40-60 ° C). The slightly yellow solution was evaporated to dryness in vacuo. The oily residue (451 mg) was first fractionated by solid phase extraction using a Chromabond Diol Cartridge with 70% and 100% aqu. MeOH.
  • the 70% eluate was further fractionated by preparative HPLC using a column LiChrospher 100 RP-18 (10 ⁇ m, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) with H 2 0 (A) and MeOH (B) as solvent (linear gradient : 0-50 min, 79% - 82.5% B, flow rate 27.6 ml / min and 82.5% - 100% B; flow rate 5 ml / min).
  • Fraction II was separated by HPLC using a column of LiChrospher 100 RP-18 (10 ⁇ m, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) with H 2 0 (A) and MeOH (B) as solvent (linear gradient: 0- 50 min, 79% - 82.5% B, flow rate 27.6 ml / min and 82.5% - 100% B; flow rate 5 ml / min) around a mixture (2.2 mg) of 22 and 1-O-acetylhygrophoron E 12 (25) result that were not further separated.
  • Fraction III was also separated by HPLC, using a LiChrospher 100 RP-18 column (10 ⁇ m, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) with H 2 0 (A) and MeOH (B) as solvent (linear gradient: 0 -50 min, 79% - 82.5% B, flow rate 27.6 ml / min and 82.5% - 100% B; flow rate 5 ml / min) to give 4.5 mg 1, 4-di-O-acetylhygrophoron E 4 (24).
  • Hygrophoron B 16 (10) 4,5-c / s-4,5-dihydroxy-5- (1-hydroxyheptadecyl) -2-cyclopenten-1-one: white amorphous solid; 1 H NMR (500 MHz, CDCI 3) 7.644 dd (6.0 / 2.3) H-3 '6.301 dd (6.0 / 1.3) H-2, 4.727 dd (2.3 / 1.3) H-4, 3,777 Groom (10.1) H -6, 3,718 br s 6-OH, 3,073 br s 4-OH, 2,196 br s 5-OH, 1.7 m H-7, 1.2-1.4 m H-8 - H-21, 0.880 t (6.9) H-22 ; ESI-FT-ICR-MS: m / z 391.28259 ([M + Na] + , calculated for C 22 H 44 Na0 4 + 391.28188).
  • Hygrophoron C 12 (18) c / s-4,5-dihydroxy-5 ⁇ tridecanoyl-2-cyclopenten-1-one: white solid; vjj) TM cm "1 3416 (br, w), 2954 (m), 2922 (s), 2852 (s), 1728 (m), 1711 (m), 1465 (w), 1438 (w), 1399 ( w), 1377 (W), 1341 (w), 1256 (w), 1226 (w), 1199 (w), 1173 (w), 1159 (w), 1111 (w), 1078 (w), 1018 ( w), 758 (w), 720 (w); 1 H NMR (500 MHz, CDCI 3 ) see Table 1; 13 C NMR (125 MHz, CDCI 3 ) see Table 2; 70 eV ElMS of the methyl boronate, m / z (rel.
  • Hygrophoron D 12 (20) fra / 7s-4,5-dihydroxy-5-tridecanoyl-2-cyclopenten-1-one: colorless oil; v fl1 TM cm “1 3416 (br, m), 2952 (m), 2924 (s), 2853 (s), 1729 (s), 1712 (s), 1629 (w), 1464 (m), 1438 ( f), 1406 (m), 1376 (m), 1236 (m), 1180 (m), 1149 (m), 1125 (m), 1080 (w), 1047 (w), 977 (w), 822 ( vw), 722 (vw); 1 H NMR (500 MHz, CDCI 3 ) see Table 1; 13 C NMR (125 MHz, CDCI 3 ) see Table 2; ESI-FT-ICR-MS: m / z 333.20417 ([ M + Na] + , calculated for C 18 H 30 NaO 4 + 333.20363).
  • CDCI 3 see table 1. 2,3-Dihydroxy-2- (1-hydroxytridecyl) -4-methoxycyclopentanone (31) 1 H NMR (500 MHz, CDCI 3 ): 4,073 ddd (8.8 / 5.3 / 4.5) H-4, 2,956 ddd (19.4 / 8.8 /0.7) 5A, 2,360 ddd (19.4 / 4.5 / 0.7) 5B, 3,435 s 4-OMe, 4,224 dd (5.3 / 0.7) H-3, 3,916 dddd (10.2 / 4.3 / 1.6) H-6; 13 C NMR (125 MHz, CDCI 3 ): 214.6 (C-1), 83.0 (C-2), 82.6 (C-3), 80.5 (C-4), 73.2 (C-6), 57.6 (4- OMe), 41.9 (C-5), 31-22 (C-7 - C17), 4.4 (C-18); ESI-FT-ICR-MS: m
  • MIC Minimum inhibitor concentrations
  • Vancomycin, linezolid and ciprofloxacin were used as comparative samples.
  • the test panel included reference strands from ATCC as well as clinical isolates with different resistance mechanisms.
  • a cell wall permeable strand of Saccharomyces cerevisiae was added as a eucaryotic test organism.
  • Clinical isolates were originally obtained from the University Hospital of Basel, Switzerland, as well as from other European and US hospitals. These samples were stored at -80 ° C as glycerol cultures.
  • the membrane-opaque fluorescent nucleic acid dye SYTOX Green (Roth BL, Poot M, Yue ST, Millard PJ. Appl. Env. Microbiol 63: 2421-31, 1997) was used to determine the influence of the compounds on the membrane integrity of the bacteria.
  • SYTOX Green was added to suspension of S. Aureus or E. Coli in the presence or in the absence of the compounds. After incubation for 20 minutes to 3 hours, the fluorescence was determined in black microtiter plates with a Tecan Spectrafluor Plus fluorescence device with excitation with 485 nm and an emission wavelength of 535 nm.
  • Bacteria lysed with detergents (4% n-octyl-beta -D-glycopyranoside (ONPG), 4% Triton-X-100) served as a 100% positive control.
  • the antibacterial activity is shown in Table 4.
  • Compound 1 was the most active compound, with MIC values of 0.5-2 ⁇ g / ml against Gram positive bacteria. This corresponds to the activity of linezolid or vancomycin.
  • Compounds 2, 3 and 4 were moderately active, with MIC values of 2 - 8 ⁇ g / ml.
  • Compound 5 has the weakest activity. These compounds showed no cross-resistance with important antibiotics available on the market. Strands of MRSA and vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) were also inhibited. With the exception of Moraxella, these compounds were not active against Gram-negative bacteria (e.g. E. coli and Pseudomonas aeruginosa).
  • the newly tested compounds according to the invention have a broad antimicrobial spectrum, including Gram-positive bacteria and yeasts, which is very interesting per se.
  • the compounds according to the invention are therefore interesting with regard to their use as topical disinfectants or as spermicidal or microcidal agents.
  • Table 4 Antibacterial activity (MICs in ⁇ g / ml)
  • the curves marked (inhib) show the growth inhibition (% inhibition) compared to the treated control samples (growth was measured as fluorescence after lysis of the bacteria by detergents).
  • the curves marked (perm) show the membrane permeability, measured as a fluorescence signal. Incubation times were 20 minutes and 3 hours, respectively.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Hygrophorone und deren Derivate, die biozide, insbe­sondere fungizide und bakterizide Eigenschaften haben, sowie Verfahren zu deren Herstellung und die Verwendung dieser Verbindungen. Die vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen der folgenden Struktur zur Verfü­gung (II), (III), (IVa), (IVb) (V).

Description

Hygrophorone und deren Derivate
Die vorliegende Erfindung betrifft Hygrophorone und deren Derivate, die biozide, insbesondere fungizide und bakterizide Eigenschaften haben, sowie Verfahren zu deren Herstellung und die Verwendung dieser Verbindungen.
Beschreibung des Standes der Technik
Pilze der Gattung Schnecklinge leben in Symbiose mit verschiedenen Laub- und Nadelbäumen. Viele dieser Arten sind dadurch gekennzeichnet, dass ihre Fruchtkörper von einer kräftigen Schleimschicht überzogen sind. Einige Arten in der Gattung der Schnecklinge zeichnen sich durch makroskopische Farbreaktionen aus. So verfärben sich beispielsweise die Stiele einiger Pilze gelb, wenn sie mit Kalilauge benetzt werden. Bei eingehenden Untersuchungen der Fruchtkörper der Schnecklinge fällt auf, dass diese kaum von parasitischen Pilzen befallen werden. Sowohl die Farbreaktion als auch die oben skizzierte ökologische Beobachtung lässt darauf schließen, dass einige Schnecklinge von Interesse aein können im Hinblick auf die Entwicklung von neuartigen Verbindungen mit bioziden Eigenschaften.
Cyclopentenone mit kurzkettigen Substituehten sind als Verbindungen mit verschiedenen biologischen Eigenschaften bekannt. So offenbaren beispielsweise S. Ohira et al., Tetrahedron Letters 45 (2004), dass Diastereomere des Pentenocin B Inhibitoreigenschaften für Enzyme aufweisen, die lnterleukin-1-beta umwandeln. Die dort offenbarten Verbindungen zeichnen sich dadurch aus, dass die Cyclopeπtenon-Grundstruktur lediglich kurzkettige Reste aufweist. M. Pohmakotr et al. offenbaren in Tetrahedron Letters 43 (2002) 7385 bis 7387 die Synthese von Dehydropentenomycin und analogen Verbindungen. Diese Verbindungen zeichnen sich wiederum dadurch aus, dass die Cyclopente- non-Grundstruktur lediglich durch kurzkettige Reste substituiert ist. Die dort offenbarten Cyclopentenoide zeigen antibiotische Eigenschaften.
Weitere Cyclopentanderivate werden beispielsweise von S. Caddick et al. in Tetrahedron 57 (2001) 6295 bis 6303 offenbart. Auch diese Verbindungen sollen wertvoll sein im Hinblick auf die Herstellung von biologisch aktiven Molekülen. Den oben genannten Offenbarungen ist jedoch gemein, dass die dort offenbarten Verbindungen lediglich eine beschränkte antibiotische Aktivität entfalten, und dass andere biozide Aktivitäten, beispielsweise fungizide Aktivitäten, nicht beobachtet werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Ausgehend von dem bekannten Stand der Technik ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue niedermolekulare Verbindungen mit vergleichsweise einfacher Struktur anzugeben, die biozide Eigenschaften zeigen.
Kurze Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Die oben gestellte Aufgabe wird durch die Bereitstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Verfügung, sowie die Verwendung dieser Verbindungen als biozide Mittel. Die in diesem Zusammenhang bevorzugten Ausführungsformen sind ebenfalls in den Ansprüchen definiert.
Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeichnen sich dadurch aus, dass sie auf dem Grundgerüst des bekannten Antibiotikums Pentenomycin (I) beruhen. Jedoch zeichnen sich die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch neue Substitutionsmuster aus, die im Zusammenhang mit der Grundstruktur von Pentenomycin bislang noch nicht offenbart wurden. Darüber hinaus zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die auch Hygrophorone genannt werden, eine starke fungizide und bakterizide Wirkung. Weiterhin zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gute Oberflächeneigenschaften. Die erfindungsgemäß aufgefundenen Verbindungsgruppen zeigen also Aktivität gegen unterschiedliche Organismengruppen, sowie eine deutlich höhere bzw. andersartige biologische Aktivität, verglichen mit der bekannten Verbindung Pentenomycin. Beispielsweise zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung andere Oberflächeneigenschaften, eine höhere Lipophilie, Membranpermeabilität und Zellgän- gigkeit. Diese besonderen Eigenschaften zeichnen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung aus und demonstrieren, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wertvolle Substanzen mit interessanten bioziden Eigenschaften sind.
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Penteno(my)cin (I) II III
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IVa IVb V
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch die Grundstruktur (II) bzw. (III) aus. Im Hinblick auf die biologischen Eigenschaften lässt sich festhalten, dass die Cyclopenten-1-ole der Struktur (III), verglichen mit den korrespondierenden Keton- verbindungen der Struktur (II), eine geringere biologische Aktivität aufweisen.
In den. Strukturen (II) sowie (III) benennen gestrichelte Bindungen optionale Bindungen, da die in jedem Fall betroffene Gruppierung OR' entweder in der Form eines Ketons oder in der Form der Gruppierung OR' vorliegen kann (im Falle der Ketonstruktur ist kein Rest R' vorhanden).
Die in den Strukturen (II) und (III) gezeigten Substituenten haben im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die folgenden Bedeutungen:
X stellt Wasserstoff, eine kurze Alkylkette, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, stärker bevorzugt mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl oder Ethyl, OH, O-Alkyl, wobei Alkyl wie vorstehend definiert ist, oder OR' dar, wobei insbesondere Was- serstoff, -Methyl und Ethyl bevorzugt sind, insbesondere Wasserstoff. Ist die Gruppierung X eine Hydroxygruppe und ist die am gleichen Kohlenstoffatom ebenfalls vorhandene Gruppierung OR' auch eine Hydroxygruppe, so kann anstelle der beiden Hydroxygrup- pen auch eine Ketongruppe vorgesehen sein.
R' ist entweder abwesend (bei der Gruppierung, die mit der gestrichelten Bindung gezeigt ist, so dass ein Keton entsteht) oder R' ist Wasserstoff oder Acyl, wobei Acyl die Gruppe CO-H oder CO-Alkyl bedeutet, wobei Alkyl wie vorstehend definiert ist. Die Al- kylgruppe der Acylgruppe ist bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, wobei auch Isopropyl und Tertiärbutyl mit umfasst sind. Besonders bevorzugt ist R' Wasserstoff oder Methylacyl, Ethylacyl, Propylacyl oder Butylacyl und bei der Gruppe mit der gestrichelten Bindung ist R' bevorzugt abwesend, so dass eine Ketongruppe geformt wird. Die Gruppe R' kann auch eine verbrückende Gruppe sein, die zwei Sauerstoffatome, die mit R' verbunden sind, verbindet. In diesem Fall stellt R' bevorzugt eine Alkylidengruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen dar oder eine Gruppierung -CO-, oder eine Kombination daraus, sofern fünfgliedrige, sechsgliedrige oder siebengliedrige Ringe entstehen. Die in einer Verbindung vorliegenden Gruppen R' können gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind folgende Optionen: die beiden Gruppen R' an der Kohlenstoffatomen 4 und 5 sind entweder beide OH oder beide Acyl oder die Gruppe R' an Kohlenstoffatom 5 ist OH und die Gruppe R1 am Kohlenstoffatom 4 ist Acyl. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Beispielen.
R" stellt Wasserstoff, Halogen, bevorzugt Fluor, Chlor, Alkyl, wie vorstehend definiert, bevorzugt Methyl oder Ethyl, oder Perhaloalkyl, wobei Alkyl wie vorstehend definiert ist, dar. Bei den Perhaloalkylgruppen ist Perfluoroalkyl bevorzugt, insbesondere bevorzugt CF3. Die beiden Gruppierungen R" können unabhängig, voneinander gleich oder verschieden sein. Bevorzugt ist R" Wasserstoff oder Alkyl, insbesondere bevorzugt Wasserstoff.
Von wesentlicher Bedeutung für die vorliegende Erfindung ist die Seitenkette R. Diese kann unter den folgenden Optionen gewählt werden:
Eine Alternative für die Seitenkette R ist eine lineare Alkylkette mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, bevorzugt ein geradzahliger Rest, insbesondere bevorzugt Cι0H21, C12H25, Cι4H29 oder Cι6H33. Bevorzugt sind Alkylketten mit 7 oder mehr Kohlenstoffatomen, bevorzugt 10 oder mehr Kohlenstoffatome.
Eine andere Alternative für die Seitenkette R ist ein Oligoprenylrest (IVa)-, wobei n von 1 bis 10 ist. Die gestrichelt gezeichnete Bindung zeigt an, dass diese Reste teilweise oder ganz hydriert sein können. Beispiele von Oligoprenylresten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, umfassen Geranyl, Neryl, Farnesyl, Geranylgeranyl, Phytyl und Solanosyl. Möglich ist auch, dass diese Gruppe R ein zum Oligoprenylrest (IVa) regioinvers angebundener Rest desselben Typs ist, d.h. X und die Anknüpfungsstelle (Bindung, die sich mit der Schlangenlinie kreuzt) sind vertauscht. Bevorzugt ist n von 1 bis 5.
Eine weitere Alternative für die Seitenkette R ist ein Noroligoprenylrest (IVb), bei dem gegenüber IVa die erste CH2-Gruppe an der Bindungsstelle fehlt. Die im Zusammenhang mit der Gruppierung IVa angegebenen bevorzugten Ausführungsformen gelten auch für die Gruppierung IVb.
Eine weitere Alternative für die Seitenkette R ist ein Polyethylenglycolrest (V) (PEG), wobei m 0 oder 1 ist, p von 0 bis 50 ist, bevorzugt von 3 bis 10 und wobei X ausgewählt ist unter OH, OMe oder OAc, wobei Ac (Acyl) wie oben definiert ist. Insbesondere bevorzugt ist OMe.
Besonders bevorzugte Gruppen und Verbindungen umfassen die folgenden Kombinationen an Substituenten:
R" ist Wasserstoff, X ist Wasserstoff, R' ist Wasserstoff oder -C(=0)-Methyl, und R ist eine geradzahlige, lineare Alkylkette.
R" ist Wasserstoff, X ist Wasserstoff, die Gruppe R' an dem mit der gestrichelten Bindung gezeigten Rest ist abwesend und die verbleibenden Reste R' sind entweder beide Wasserstoff oder einer der verbleibenden Reste R' ist Wasserstoff und der andere ist -C(=0)-Me, wobei bevorzugt ist, dass die Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom der Position 5 des Cyclopentenonrings sitzt. Weitere bevorzugte Verbindungen sind wie folgt:
In bevorzugten Ausführungsformen Nerbindungen der allgemeinen Formel (II) mit 1' Alkohol-Oxidationsstufe ausgewählt aus:
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In bevorzugten Ausfύhrungsformen von Verbindung der allgemeinen Formel (II) mit 1'- Keton-Oxidationsstufe ausgewählt aus:
Figure imgf000009_0001
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Butyrolactonderivate zur Verfügung, die durch die folgende Struktur gekennzeichnet sind:
Figure imgf000009_0002
wobei sowohl die E als auch die Z Isomere umfasst sind, gemeinsam in Mischung oder einzeln und wobei Z eine lineare Alkylgruppe mit 5 bis 22 Kohleπstoffatomen darstellt (wobei hier wieder die oben bereits beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen gelten) oder den Rest CH2-0-Phenyl, und wobei R" wie vorstehend definiert ist, wobei bevorzugt beide Reste R" Wasserstoff darstellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch die eingangs definierten bioziden Eigenschaften aus. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich daher insbesondere als Biozid, insbesondere zur Behandlung von Oberflächen zur Desinfektion und zum Einsatz gegen Biofilme. Weiterhin können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Fungizid eingesetzt werden, insbesondere zur Behandlung von Pilzerkrankungen bei Lebewesen, d.h. Pflanzen, Tieren und Menschen. Weiterhin können die Verbindungen der voriiegenden Erfindung als Holzschutzmittel eingesetzt werden, sowie zum Schutz anderer Baustoffe gegen Pilzbefall. Darüber hinaus können die Verbindungen der voriiegenden Erfindung als Antibiotikum eingesetzt werden, insbesondere zur Behandlung von Infektionen mit gram-positiven Keimen. Weiterhin können die Verbindungen der voriiegenden Erfindung als Inhibitoren von lnterleukin-1-beta umwandelnden Enzymen verwendet werden.
Die im Rahmen der voriiegenden Erfindung offenbarten Verwendungen betreffen auch die Formulierung der erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Formen, z.B. in der Form von pharmazeutischen Zubereitungen, umfassend mindestens eine Verbindung dervoriiegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff. In Übereinstimmung mit der voriiegenden Erfindung können daher Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Salben, Tabletten, Kapseln, Lösungen oder Emulsionen zum Sprüheinsatz usw. bereitgestellt werden, so dass die Verbindungen der voriiegenden Erfindung in geeigneter Weise in den jeweiligen Einsatzbereichen verwendet werden können.
Dabei können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch mit weiteren Hilfsstoffen und anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen kombiniert werden, insbesondere mit aktiven Mitteln, die gegen gram-negative Bakterien wirken. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können entweder auf halbsynthetischem oder vollsynthetischem Weg hergestellt werden, wobei der Fachmann auf die üblichen Syntheseverfahren der organischen Chemie zurückgreifen kann. Alternativ ist es möglich, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung aus Pilzen der Gattung Schnecklinge durch geeignete Verfahren zu gewinnen. Beispielsweise kann eine Masse aus frischem oder gefriergetrocknetem Gut in zerkleinerter Form mit unpolaren (bevorzugt Petrolether, Alkane, Essigester) oder polaren Lösungsmitteln (Ethanol, Methanol, Aceton) extrahiert werden. Geeignet ist auch eine Extraktion mit überkritischem C02. Übliche Extraktionshilfsmittel, wie chemische Hilfsmittel (z.B. Salz) aber vor allem auch physikalische Hilfsmittel (Rühren, Ultraschall, Wärme, Druck) können zur Verbesserung der Extraktion beitragen. Weitere Details ergeben sich aus den angefügten Beispielen, die exemplarisch zeigen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Extraktion von natürlichen Rohmaterialien erhalten werden können. Geeignete Rohmaterialien sind Pilze der Gattung der Schnecklinge, insbesondere H. persoonii, H. olivaceoalbus, H. latidabundus und H. pustulatus.
Die Evaluierung der biologischen Eigenschaften der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ergab, dass die Verbindungen der voriiegenden Erfindung starke antibiotische und antimykotische Eigenschaften haben. Die Verbindungen der voriiegenden Erfindung wiesen insbesondere auch Aktivität auf im Hinblick auf Stämme, die gegen Vancomycin resistent sind. Daher ermöglicht es die vorliegende Erfindung biozide Mittel bereitzustellen, die gegen bereits resistente Stämme eingesetzt werden können.
Biologische Aktivität wurde weiterhin im Hinblick auf gram-positive Bakterien bestätigt, insbesondere gegen Cladosporium cucumerinum. Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis und Streptococcus pneumoniae, wobei eine mit Vanomycin vergleichbare Ativi- tät festgestellt wurde.
Weitere bevorzugte Verbindungen sind nachfolgend gezeigt:
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:R1=Ac R2 = H R3 = Ac π = 12 9:R1=H R2 = H R3 = H n = 14 : R1 = Ac R2 = H R3=H n = 12 10:R =H R2 = H R3 = H n = 16:R1=H R2 = H R3 = Ac n = 12 11: R1 =Ac R2 = H R3 = H n = 14: R1 = Ac R2 = H R3 = Ac n = 14 12:R1=H R2 = H R3 = Ac n = 14: R1 = Ac R2 = H R3 = H n = 14 13:R >1' -=Ac Rz = H R 3ö _ = Ac n = 14: R1 = H R2 = H R3 = Ac n = 14 14: R1 =Ac R2 = Ac R3 = Ac n = 14: R1 = H R2 = H R3 = H n = 12: R1 = Ac R2 = Ac R3 = Ac n = 12
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: R = Ac n= 12 17:R = Ac:R = H n=12 18:R = H: R = Ac n= 14
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: Epipentenomycin 16: Pentenomycin
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: R = Ac n = 12: R = Ac n = 10: R = Ac n = 14:R=H n = 12:R=H n = 10
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Beispiele
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
Hygrophorone sind in Petroleumether, Methanol oder Chloroform löslich aber nicht in Wasser. Daher können sie einfach aus Pilzmaterial mit Petroleumether extrahiert werden. Die Ausbeute einer Extraktion ist größer wenn frisches Ausgangsmaterial oder gefrorenes Ausgangsmaterial verwendet wird, verglichem mit gefriergetrocknetem Material. Alle Hygrophorone sind gegenüber Basen und starken Säuren empfindlich. Sie können einfach auf DC-Platten detektiert werden, entweder durch Entwicklung mit einer Hydroxidlösung oder durch Erwärmung, wodurch sich die Hygrophorone gelb oder braun verfärben. Die zweite Alternative ist einfacher und empfindlicher.
Der Petroleumetherextract von H. persoonii ergab sechs Verbindungen (1-6) nach Auftrennung durch SPE und HPLC (Fig. 1).
Deacetylierung von 1 mit verdünnter NaOH in MeOH ergab die Derivate 2 und 3 ebenso wie Hygrophoron A12 (7) mit drei freien OH-Gruppen und das korrespondierende Me- thanoladduct (31). Das 4,5,6-tri-O-Acetylhygrophoron A12 (8) konnte einfach durch Acety- lierung von 1 mit einem Überschuß Acetanhydrid in Pyridin erhalten werden. Aus dem Extrakt von H. olivaceoalbus mit Leichtpetroleum konnten die Hygrophorone B14 (9) und B16 (10) isoliert werden.
Acetylierung von 9 mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ergab, abhängig von der Reaktionszeit und Überschuß an Reagenz, die Derivate (11), (12), (13) (14) . Die Ester könen durch HPLC getrennt werden.
Der Petroletherextract von H. pustulatus ergab das 4-O-Acetylhygrophoron C12 (17) sowie Hygrophoron C12 (18) die durch SPE und HPLC isoliert werden konnten.
Der Petroletherextract von H. latitabundus ist eine reichhaltige Quelle für Cyclopente- nonderivate ives (19, 20).
Der Petroletherextract von H. persoonii enthielt zwei Butyrolactonhygrophorone F12 (27) undG12 (28). Sie konnten SPE, HPLC, und weitere Säulenchromatographie isoliert werden.
Evaluierung der Bioaktivität (Resultate in Tabelle 3)
Erste Untersuchungen im Hinblick auf biozide Eigenschaften wurden in Übereinstimmung mit der Voeschrift von Gottstein et al. (1982) durchgeführt. Ein Aliquot einer Methanollösung der Hygrophorones enthaltend 20 oder 40 μg Substanz wurde auf 0.5 mm dünne Silicaplatten gegeben und mit einer wäßrigen and Nährlösung besprüht, enthaltend Cladosporium cucumerinum EIL et Arth. Nach zwei Tagen in einer Feuchtkammer (>95% Luftfeuchtigkeit) waren die Platten mit dunkelgrau gefärbtem Mycelbewuchs ü- berwachsen. Flächen mit ausreichend fungiziden Effekten waren sichtbar als weiße Flächen (Inhibierungsfläche). Eine relative quantitative Abschätzung kann basierend auf der Größe und der Intensität der Flächen gemacht werden. Die Ausdehnung der Inhibierungsfläche von ausgewählten Hygrophoronen ist in Tabelle 3 gegeben. Alle getesteten Hygrophorone zeigtem mindestens eine gewisse antifungale Aktivität gegen C. cucumerinum. 4-O-Acetylhygrophoron A 2 (2) war die aktivste der neuen Cyclopentenonderiva- te. 1D (1H, 13C, ) and 2D (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) NMR Spektren wurden mit Varian Unity 500 aufgenommen. Chemische Verschiebungen sind bezogen auf den internen Standard TMS (δ = 0, 1H) bzw. CDCI3 (δ = 77.0, 13C).
Präparative HPLC wurden mit Merck-Hitachi L-6250 low pressure gradient pump mit einem L-4250 UV Detektor oder mit einem Varian ProStar 218 System mit einem PrepStar 330 photodiode array Detektor durchgeführt.
Hochauflösungs-ESI-massenspektren wurden mit einem Bruker Apex III Fourier trans- form ion cyclotron resonance (FT-ICR) Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, USA) aufgenommen, ausgerüsted mit einer Infinity™ Zelle, einem 7.0 Tesla supercon- ducting magnet (Bruker, Karlsruhe, Germany), einer RF-oniy hexapole ion guide und externen Electrosprayionenquelle (Agilent, off axis spray). Die Probenlösungen wurden kontinuierlich zugeführt, durch eine Spritzpumpe bei einer Flußrate von 120 μl h"1.
GC-MS-Messungen der methylboronierten Verbindung 18 wurden mit einem GC-MS System (Voyager, ThermoQuest): 70 eV El, source temp. 200 °C; Säule DB-5MS (J&W, 30 m x 0.25 mm, 0.25 μm Filmdicke), Injectionstemperatur 250 °C, Interfacetemperatur 300 °C, Trägergas He, Flußrate 1.0 ml/min, constant flow mode, splitless injection, Temperaturprogramm für die Säule: 60 °C für 1 min, dann Anstieg auf 300 °C bei einer Rate von 10 °C min"1, Isothermal bei 300 °C für 20 min) gemessen. Die Derivatisierung mit der Borverbindung wurde in einer bekannten Art und Weise durchgeführt. (Takatsuto et al., 1982).
IR-Spektren wurden mit einem Bruker IFS 28 gemessen, CD- und UV-Spektren mit einem Jasco J-710. Die spezifische Rotation wurde mit einem JASCO DIP-1000 Polarime- ter gemessen.
Pilzmaterial
H. latitabundus wurde unter Pinus sylvestris in der Nähe von Bad Bibra, im November 2002 (leg./det. M. Huth) gesammelt. H. olivaceoalbus wurde unter Picea abies in der Nähe von Kelheim, imSeptember 2001 (leg. T. Lübken / det. N. Arnold) gesammelt. H. persoonii wurde unter Quercus robur in der Nähe von Ingolstadt im September 2000 (leg./det. N. Arnold) gesammelt. H. pustulatus wurde unter Picea abies in der Nähe von Harzgerode im November 2001 (leg. T. Lübken / det. Arnold) gesammelt. Proben sind beim Leibπiz-Institut für Pflanzenbiochemie Halle (IPB) hinterlegt.
• Extraktion und Auf reinigung
Hygrophorus persoonii
Gefrorene Fruchtkörper von H. persoonii (229 g) wurden dreimal mit Leichtpetrol extrahiert (40-60 °C). Die leichtgelbe Lösung wurde im Vakuum aufkonzentriert um eine ölige Masse zu erhalten (1.453 g), die zunächst auf eine Chromabond Diol Cartridge adsorbiert wurde. Dann wurde durch sequentielle Extraktion fraktioniert, mit 50%, 70%, und 100% aqu. MeOH. Das 70% Eluat (337 mg) wurde durch präparative HPLC gereinigt, unter Einsatz einer Säule LiChrospher 100 RP-18 (10 μm, 250 x 4 mm ID, Merck, Ger- many) unter Einsatz von H20/MeOH (30/70) (A) und MeOH (B) als Eluationsmittel (linearer Gradient: 0 - 45 min, 70% - 100% B, Flußrate von 5.0 ml/min) um 51.1 mg 4,6-di-O- Acetylhygrophoron A12 (1, rt = 32.8 min) und 12.6 mg 4,6-di-O-Acetylhygrophoron A14 (4, rt = 38.7 min) zu erhalten. Fraktionen von 28.0 bis 31.0 min enthielten 1.3 mg 4-0- Acetylhygrophoron A 2 (2) und 1.7 mg 6-O-Acetylhygrophoron A12 (3) die weiter durch wiederholte HPLC aufgereinigt wurden. Fraktionen von 34.0 bis 37.0 min enthielten 1.2 mg einer Mischung von 4-O-Acetylhygrophoron A 4 (5) und 6-O-Acetylhygrophoron A14 (6), die nicht weiter behandelt wurde. Fraktionen von 33.0 bis 34.0 min enthielten Hygrophoron F12 (27) zusammen mit G12 (28). Weitere Aufreinigung durch Säulenchromatographie über Lichroprep Diol mit CHCI3 ergab 0.9 mg 27 und Spuren an 28.
10 Tropfen von NaOH in MeOH (ca. 0.1 %) wurden zu einer Lösung von 9.7 mg 1 in MeOH (2 ml) gegeben, wonach eine Nacht gerührt wurde. Die Lösung wurde mit 8 ml Wasser verdünnt und auf eine Chromabond Diol Cartridge gegeben, konditioniert mit 50% MeOH. Die Cartridge wurde mit 50% MeOH und 100% MeOH eluiert. Das 100% Eluat wurde weiter durch HPLC aufgereinigt, unter Einsatz einer Säule Nucleosil 100 RP-18 (7 μm, 250 x 7 mm ID, Macherey-Nagel, Germany) unter Einsatz von Wasser (A) und Methanol (B) als Eluationsmittel (isocratischer Fluß, 25% A und 75% B, Flußrate = 27.6 ml/min) um eine Mischung von (18.45 min - 21.00 min, 2.6 mg) 7 und dessen Me- thanoladdukt 31 zu erhalten, die nicht weiter getrennt wurden. Eine Lösung von 13.6 mg 1 in Pyridin (1.5 ml) und einige Tropfen Essigsäureanhydrid wurden zugegeben und es wurde eine Nacht gerührt. Nach Entfernung der Lösungsmittel im Vakuum wurde das pe- racetylierte Derivativ 8 in quantitativer Ausbeute erhalten.
Hygophorus olivaceoalbus
Gefrorene Fruchtkörper von H. olivaceoalbus (570 g) wurden dreimal mit Leichtpetrol extrahiert (40-60 °C). Die leicht gelbe Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der ölige Rest (451 mg) wurde zunächst fraktioniert durch Festphasenextraktion über eine Chromabond Diol Cartridge mit 70% und 100% aqu. MeOH. Das 70% Eluat (76.6 mg) wurde durch semipräparative HPLC aufgereinigt, unter Einsatz einer Säule Nucleosil 100 RP-18 (7 μm, 250 x 7 mm ID, Macherey-Nagel, Germany) mit H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0-20 min, 80% - 100% B Flußrate 27.6 ml/min) um 17.3 mg Hygrophoron B14 (9, rt = 10.5 min) und 6.4 mg Hygrophoron B16 (10, rt = 13.8 min) zu erhalten.
Drei Tropfen Essigsäureanhydrid wurden zu einer Lösung von 2.8 mg 9 in Pyridin (1 ml) gegeben. Nach Rühren für eine Nacht wurde Pyridin unter verringertem Druck entfernt. Der Rest wurde aufgereinigt, durch HPLC unter Einsatz einer Säule Nucleosil 100 RP-18 (7 μm, 250 x 7 mm ID, Macherey-Nagel, Germany) mit H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0-20 min, 90% - 100% B Flußrate 27.6 ml/min) um zwei Fraktionen zu erhalten. Fraktion I bei 6.8 - 7.8 min ergab 2.4 mg 13 , verunreinigt mit 11 (10%, nach 1H NMR) und Fraktion II bei 8.0 - 9.0 min mit 0.9 mg 14. Die erste Fraktion wurde nicht weiter aufgereinigt.
Eine Lösung von 1 mg 9 in Pyridin (1 ml) und einem Tropfen Essigsäureanhydrid wurde für zwei Stunden gerührt. Der Rest (1.1 mg), nach . Entfernung des enthaltenen Lösungsmittels, enthielt 12 und 13 in einem 2:1 Verhältnis (bestimmt durch 1H NMR) und wurde nicht weiter aufgetrennt.
Hygrophorus pustulatus
Gefrorene Fruchtkörper von H. pustulatus (280 g) wurden dreimal mit Leichtpetrol extrahiert (40-60 °C). Die leicht gelbe Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rest (62.6 mg) wurde durch semipräparative HPLC fraktioniert, unter Einsatz einer Säule LiChrospher 100 RP-18 (10 μm, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) und unter Einsatz von H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0 - 45 min, 60% - 100% B, Flußrate 5.0 ml/min), um 1.0 mg 4-O-Acetylhygrophoron C12 (17, rt = 24.8 min) und 1.5 mg Hygrophoron C12 (18, rt = 27.1 min) zu ergeben.
Hygrophorus latitabundus
Gefrorene Fruchtkörper von H. latitabundus (697 g) wwurden dreimal mit Leichtpetrol extrahiert (40-60 °C). Die leicht gelbe Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rest (187 mg) wurde zunächst durch Festphasenextraktion von einer Chromabond Diol Cartridge fraktioniert, mit 50%, 70%, und 100% aqu. MeOH. Das 70% Eluat wurde weiter fraktioniert durch präparative HPLC unter Einsatz einer Säule LiChrospher 100 RP-18 (10 μm, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) mit H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0-50 min, 79% - 82.5% B, Flußrate 27.6 ml/min und 82.5% - 100% B; Flußrate 5 ml/min). Fraktionen von 18 bis 22.5 min enthielten 1.0 mg Hygrophoron D12 (20), von 26 - 30 min 10.9 mg 4-O-Acetyl hygrophoron D 2 (19), von 31 - 40 min 7.6 mg 1 ,4-di-O-Acetylhygrophoron E12 (22), und von 51 - 55 min 9.7 mg 4- O-Acetylhygrophoron D14 (21).
Eine Menge von 486 mg eines weiteren Leichtpetrolextrakts (erhalten durch vollständige Extraktion von 490 g gefrorenen Fruchtkörpern) wurde durch Säulenchromatographie (RP18, 4 x 28, H20/MeOH = 15/85) in drei Hauptfraktionen aufgetrennt. Fraktion I: 540 - 750 ml (12.1 mg), Fraktion II: 1300 - 1900 ml (31.0 mg), und Fraktion III: 2170 - 2490 ml (30.6 mg). Fraktion I war eine Mischung aus 1 ,4-di-O-Acetylhygrophoron E10 (23) und 1- O-Acetylhygrophoron E10 (26), die nicht weiter getrennt wurden. Fraktion II wurde durch HPLC aufgetrennt, unter Einsatz einer Säule LiChrospher 100 RP-18 (10 μm, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) mit H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0-50 min, 79% - 82.5% B, Flußrate 27.6 ml/min und 82.5% - 100% B; Flußrate 5 ml/min) um eine Mischung (2.2 mg) aus 22 und 1-O-Acetylhygrophoron E12 (25) zu ergeben, die nicht weiter getrennt wurden. Fraktion III wurde auch durch HPLC aufgetrennt, unter Einsatz einer Säule LiChrospher 100 RP-18 (10 μm, 250 x 4 mm ID, Merck, Germany) mit H20 (A) und MeOH (B) als Lösungsmittel (linearer Gradient: 0-50 min, 79% - 82.5% B, Flußrate 27.6 ml/min und 82.5% - 100% B; Flußrate 5 ml/min) um 4.5 mg 1 ,4-di-O-Acetylhygrophoron E 4 (24) zu ergeben. 4,6-Di-O-acetylhygrophoron A (1) 4,5-frat7S-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1 -hydroxytridecyl)-2-cyclopenten-1 -on: farbloses Öl; [α£3+53.0° (MeOH; c O.940);v^m χ cm"1 3470 (br, w), 2955 (m), 2924 (s), 2854 (s), 1746 (s), 1729 (s), 1653 (vw), 1595 (vw), 1465 (m), 1435 (w), 1372 (m), 1329 (vw), 1233 (s), 1192 (w), 1118 (w), 1100 (m), 1070 (m), 1035 (m), 912 (w), 828 (vw), 769 (vw), 719 (vw); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) see Table 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 419.23986 ([M+Na]+, ber. für C22H36Na06 + 419.24041 ).
4-O-Acetylhygrophoron A12 (2) 4,5-f/-ans-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1-hydroxytridecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: 377.23084 ([M+Na]+, ber. für C20H34NaO5 + 377.22984).
6-O-Acetylhygrophoron A12 (3)
4,5-frans-4,5-Dihydroxy-5-(1-acetoxytridecyl)-2-cyclopenten-1 -on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT- ICR-MS: m/z 377.22897 ([M+Na]+, ber. für C20H34NaO5 + 377.22984).
4,5-Di-O-acetylhygrophoron A14 (4)
4,5-frans-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1-acetoxypentadecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; vjj cm'1 3447 (br, w), 2950 (m), 2923 (s), 2852 (s), 1744 (s), 1727 (s), 1645 (vw),
1594 (vw), 1465 (m), 1437 (w), 1371 (m), 1330 (w), 1234 (s), 1119 (w), 1102 (m), 1041 (m), 910 (w), 826 (vw), 753 (vw), 713 (vw); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 7.462 dd (6.2/2.1) H-3, 6.441 dd (6.2/1.8) H-2, 5.721 dd (2.1/1.8) H-4, 5.017 m H-6, 3.247 s 5-OH, 2.136 s 4-OAc, 1.996 s 6-OAc, 1.7 m H-7, 1.20 - 1.33 m H-8 - H-19, 0.888 t (7.0) H-20; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) 202.1 C-1 , 170.7 4-OAc, 170.0 6-OAc, 156.8 C~3, 134.5 C-2, 81.6 C- 5, 79.9 C-4, 74.1 C-6, 28.8 C-7, 21.1 4-OAc, 20.9 6-OAc, 32.0, 29.80, 29.79, 29.77, 29.76, 29.74, 29.69, 29.58, 29.51 , 29.47, 26.1 , 22.8 C-8 - C-19, 14.3 C-20 ESI-FT-ICR- MS: m/z 447.27221 ([M+Na]+, ber. für C24H40NaO6447.27171).
4-O-Acetylhygrophoron A14 (5)
4,5-trans-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1-hydroxypentadecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 7.561 dd (6.1/2.2) H-3, 6.437 dd (6.1/1.6) H-2, 5.801 dd (2.2/1.6). H-4, 3.725 dt (9.6/3.0) H-6, 3.185 s 5-OH, 2.39 όr 6-0H, 2.171 s 4-OAc, 1.7 m H-7, 1.20 -1.33 m H-8 - H-19, 0.880 t (7.0) H-20; ESI-FT-ICR-MS: m/z 405.26152 ([M+Na]+, ber. für C22H38Naθ5+ 405.26115).
6-0-Acetylhygrophoron A14 (6) 4,5-//'at7s-4,5-Dihydroxy-5-(1-acetoxypentadecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; H NMR (500 MHz, CDCI3) 7.524 dd (6.1/2.0) H-3, 6.316 dd (6.1/1.8) H-2, 5.145 dt (10.4/2.9) H-6, 4.835 ddd (6.7/2.0/1.8) H-4, 3.012 d (6.7) 4-OH, 2.958 s 5-OH, 2.045 s 6- OAc, 1.7 m H-7, 1.20 -1.33 m H-8 - H-19, 0.880 t (7.0) H-20; ESI-FT-ICR-MS: m/z 405.26152 ([M+Na]+, ber. für C22H38Na05 + 405.26115).
Hygrophoron A12 (7) 4,5-.rans-4,5-Dihydroxy-5-(1-hydroxytridecyl)-2-cyclopenten-1-on: 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS (positive ion mode): m/z 335.21881 ([M+Na]+, ber. für Cι8H32Na0 + 335.21928).
4,5,6-Tri-O-acetylhygrophoron A12 (8)
4,5-frans-4,5-Diacetoxy-5-(1-hydroxytridecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; *1™ cm"1
2955 (m), 2925 (s), 2854 (s), 1746 (s), 1731 (s), 1597 (vw), 1465 (w), 1434 (w), 1372 (m), 1355 (w), "1249 (s), 1225 (s), 1185 (w), 1155 (w), 1108 (w), 1073 (w), 1032 (m), 980 (w), 922 (w), 905 (w), 825 (w), 794 (w), 757 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 461.25013 ([M+Na]+, ber. für C2 H38Na07 + 461.25097).
Hygrophoron B14 (9)
4,5-c/s-4,5-Dihydroxy-5-(1 -hydroxypentadecyl)-2-cyclopenten-1 -on: weißer amorpher Feststoff; [^£3 + 10.5° (MeOH; c 0.640); v^ cm"1 3509 (m), 3445 ( ), 3403 (m), 3372
(m), 2954 (m), 2916 (s), 2871 (m), 2849 (s), 1715 (s), 1696 (s), 1676 (w), 1653 (w), 1595 (w), 1470 (m), 1399 (w), 1355 (w), 1243 (w), 1214 (w), 1115 (m), 1102 (vw), 1078 (m), 1011 (w), 983 (w), 946 (w), 919 (vw), 900 (vw), 843 (m), 791 (w), 720 (w), 687 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1; 1 C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 363.24825 ([M+Na , ber. für C20H36NaO4 + 363.25058). Hygrophoron B16 (10) 4,5-c/s-4,5-Dihydroxy-5-(1 -hydroxyheptadecyl)-2-cyclopenten-1 -on: weißer amorpher Feststoff; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 7.644 dd (6.0/2.3) H-3,' 6.301 dd (6.0/1.3) H-2, 4.727 dd (2.3/1.3) H-4, 3.777 brä (10.1) H-6, 3.718 br s 6-OH, 3.073 br s 4-OH, 2.196 br s 5-OH, 1.7 m H-7, 1.2-1.4 m H-8 - H-21 , 0.880 t (6.9) H-22; ESI-FT-ICR-MS: m/z 391.28259 ([M+Na]+, ber. für C22H44Na04 + 391.28188).
4-O-Acetyl hygrophoron B14 (11) 4,5-c/s-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1-hydroxypentadecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; ESI-FT-ICR-MS: m/z 405.26155 ([M+Na]+, ber. für C22H38Naθ5+ 405.26115).
6-O-Acetylhygrophoron B14 (12)
4,5-c/s-4,5-Dihydroxy-5-(1-acetoxypentadecyl)-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 405.26155 ([M+Na]+, ber. für C22H38Na05 + 405.26115).
4,6-Di-O-acetylhygrophoron B14 (13)
4,5-c/'s-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-(1 -acetoxypentadecyl)-2-cyclopenten-1 -on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1;,:; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 447.27131 ([M+Naf, ber. fürC24H40NaOβ + 447.27171).
4,5,6-Tή-O-acetylhygrophoron B14 (14) 4,5-c/s-4,5-Diacetoxy-(1-acetoxypentadecyl)-2-cyclopenten-1 -on: farbloses Öl; v 1™ cm"1
5956 (m), 2922 (s), 2850 (s), 1760 (s), 1601 (w), 1468 (m), 1434 (m), 1371 (m), 1258 (s), 1122 (w), 1102 (w), 1047 (m), 1027 (m), 961 (w), 814 (w), 758 (w), 720 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT- ICR-MS: m/z 489.28213 ([M+Na]+, ber. für C26H42Na07 + 489.28227).
4-O-Acetylhygrophoron C12 (17) c/s-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-tridecanoyl-2-cyclopenten-1-on: weißer Feststofff; vjjj™ cm~1
3360 (br, m), 3092 (vw), 3020 (vw), 2950 (m), 2918 (s), 2871 (m), 2850 (s), 1746 (s), 1725 (s), 1689 (s), 1593 (w), 1463 (m), 1404 (w), 1373 (m), 1344 (m), 1315 (w), 1272 (w), 1260 (w), 1227 (m), 1198 (m), 1154 (m), 1112 (w), 1093 (m), 1066 (m), 1046 (w), 955 (vw)-, 930 (vw), 915 (w), 900 (w), 882 (vw), 845 (w), 826 (vw), 795 (w), 756 (m), 746 (m), 729 (w), 717 (m); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS (negative ion mode): m/z 387.19523 ([M+Cl]", ber. für C20H32O5 35Cr 387.19438).
Hygrophoron C12 (18) c/s-4,5-Dihydroxy-5~tridecanoyl-2-cyclopenten-1-on: weißer Feststoff; vjj)™ cm"1 3416 (br, w), 2954 (m), 2922 (s), 2852 (s), 1728 (m), 1711 (m), 1465 (w), 1438 (w), 1399 (w), 1377 (W), 1341 (w), 1256 (w), 1226 (w), 1199 (w), 1173 (w), 1159 (w), 1111 (w), 1078 (w), 1018 (w), 758 (w), 720 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; 70eV-ElMS des Methylboronats, m/z (rel. int., %): 334 ([M+], 4), 197 (58), 151 (12), 138 (51), 137 (100), 123 (11), 109 (21), 96 (37), 95 (44), 85 (26), 71 (46), 57 (67); ESI-FT-ICR-MS (negative ion mode): m/z 345.18679 [M+Cl]", ber. für C18H3o35CI04 " 345.18381).
4-O-Acetylhygrophoron D12 (19) rans-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-tridecanoyl-2-cyclopenteπ-1-oπ: gefärbtes Öl;
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+111.7° (MeOH; c 0.470); v{j cm"1 3441 (br, m), 3081 (w), 2954 (m), 2923 (s), 2872 (m), 2853
• (s), 1757 (s) .1746 (s), 1739 (s), 1731 (s), 1713 (s), 1591 (w), 1466 (m), 1401 (w), 1372 (m), 1349 (m),.1283 (w), 1224 (s), 1183 (w); 1143 (m), 1131 (m), 1093 (m), 1035 (m), 981 (w), 960 (w), 897 w), 821 (w), 758 (w), 722 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 375.21436 ([M+Na]+, ber. für C20H32NaO5 + 375.21419).
Hygrophoron D12 (20) fra/7s-4,5-Dihydroxy-5-tridecanoyl-2-cyclopenten-1-on: farbloses Öl; v fl1™ cm"1 3416 (br, m), 2952 (m), 2924 (s), 2853 (s), 1729 (s), 1712 (s), 1629 (w), 1464 (m), 1438 (w), 1406 (m), 1376 (m), 1236 (m), 1180 (m), 1149 (m), 1125 (m), 1080 (w), 1047 (w), 977 (w), 822 (vw), 722 (vw); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 333.20417 ([M+Na]+, ber. für C18H30NaO4 + 333.20363). 4-O-Acetylhygrophoron D14 (21) frans-4-Acetoxy-5-hydroxy-5-pentadecanoyl-2-cyclopenten-1 -on: farbloses Öl; [αJ? +98.7° (MeOH; c 0.475); v^ cm"1 3446 (br, m), 3080 ( ), 2955 (m), 2923 (s), 2853 (s), 1734 (s), 1711 (s), 1591 (w), 1465 (m), 1400 (w), 1371 (m), 1326 (w), 1282 (w), 1225 (s), 1185 (w), 1131 (m), 1097 (m), 1086 (m), 1035 (m), 981 (w), 897 (w), 822 (w), 762 (vw); 721 (vw); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 7.700 dd (6.2/2.1) H-3, 6.591 dd (6.2/1.7) H-2, 5.826 dd (2.1/1.7) H-4, 4.613 s 5-OH, 2.590 ddd (17.9/7.2/7.1) H-7A, 2.319 ddd (17.9/7.5/6.7) H-7B, 2.088 s 4-OAc, 1.619 m H-8, 1.20 - 1.33 m H-9 - H-19, 0.878 / (6.8) H-20; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) 202.7 C-6, 198.6 C-1 , 169.5 4-OAc, 158.2 C-3, 136.0 C-2, 88.0 C-5, 80.4 C-4, 39.0 C-7, 32.0, 29.78, 29.76, 29.74, 29.73, 29.47, 29.51 , 29.45, 29.44, 29.13, 23.3, 22.8: C-8 - C-19, 20.8 4-OAc, 14.3 C-20; ESI-FT-ICR-MS: m/z 403.24474 ([M+Na]+, ber. für C22H37Na05 + 403.24604).
1 ,4-Di-O-acetyl hygrophoron E12 (22) 1-(2,5-Diacetoxy-1-hydroxy-cyclopent-3-enyl)-tridecan-1-on: farbloses Öl; [of]o +80.3°
(MeOH; c 0.395); v^ cm"1 3449 (br, m), 3073 (w), 2954 (m), 2924 (s), 2853 (s), 1744 (s),
1718 (s), 1465 (w), 1435 (w), 1372 (m), 1319 (vw), 1300 (vw), 1225 (s), 1154 (vw), 1114 vw), 1024 (m), 967 (w), 915 (w), 831 (vw), 786 (vw), 721 (vw); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, -CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 419.24159 ([M+Na]+, ber. für C22H36Na06 + 419.24041).
1,4-Di-O-acetylhygrophoron E10 (23)
1-(2,5-Diacetoxy-1-hydroxy-cyclopent-3-enyl)-undecan-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 6.190 ddd (6.1/1.9/1.1) H-3, 6.159 ddd (6.1/2.1/1.1) H-2, 5.724 ddd (2.0/1.9/1.1) H-4, 5.707 ddd (2.1/2.0/1.1) H-1, 4.003 br s 5-OH, 2.659 ddd (17.8/9.0/6.0) H-7A, 2.589 ddd (17.8/8.8/6.1) H-7B, 2.108 s 1-OAc, 2.018 s 4-OAc, 1.20 - 1.33 m H-8 - H-15, 0.881 . (7.0) H-16; ESI-FT-ICR-MS: m/z 391.21037 ([M+Na]+, ber. für C2oH32Na06 + 391.20911). 1 ,4-Di-O-acetylhygrophoron E14 (24) 1-(2,5-Diacetoxy-1-hydroxy-cyclopent-3-enyl)-pentadecan-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 6.190 ddd (6.1/1.9/1.1) H-3, 6.159 ddd (6.1/2.1/1.1) H-2, 5.724 ddd (2.0/1.9/1.1) H-4, 5.707 ddd (2.1/2.0/1.1) H-1 , 4.003 br s 5-OH, 2.659 ddd (17.8/9.0/6.0) H-7A, 2.589 ddd (17.8/8.8/6.1) H-7B, 2.108 s 1-OAc, 2.018 5 4-OAc, 1.20 - 1.33 m H-8 - H-19, 0.881 t (7.0) H-20; ESI-FT-ICR-MS: m/z 447.27530 ([M+Na]+, ber. für C24H40NaO6 + 447.27171).
1-O-Acetylhygrophoron E12 (25) 1-(2-Acetoxy-1 ,5-dihydroxy- cyclopent-3-enyl)-tridecan-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDC ) siehe Tabelle 1 ; ESI-FT-ICR-MS: m/z 377.23029 ([M+Na]+, ber. für C20H34NaO5 + 377.22984).
1-O-Acetylhygrophoron E10 (26) 1-(2-Acetoxy-1 ,5-dihydroxy-cyclopent-3-enyl)-undecan-1-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz, CDCI3) 6.192 ddd (6.0/2.0/1.0) H-3, 6.058 ddd (6.0/2.2/1.2) H-2, 5.659 ddd (2.2/1.5/1.0) H-1 , 4.932 ddd (2.0/1.4/1.4) H-4, 2.698 ddd (17.7/8.2/6.7) 7A, 2.541 ddd (17.7/8.2/6.6) 7B, 2.018 s 1 -OAc, 1.20 - 1.33 m H-8 - H-15, 0.881 t (7.0) H-16; ESI-FT- ICR-MS: m/z 349.20050 ([M+Na]+ , ber. für C18H30NaO5 + 349.19854). -
Hygrophoron F12 (27)
(5£)-5-(2-Hydroxytetradexylidene)-furan-2(5 τ')-on: weißer amorpher Feststoff; v ™ cm~1 3487 (m), 3396 (br, m), 3269 (br, m), 3133 (w), 3100 (w), 3074 (w), 2953 (m), 2918 (s), 2850 (s), 1785 (m), 1751 (s), 1718 (w), 1669 (w), 1554 (w), 1466 (w), 1372 (vw), 1297 (vw), 1237 (w), 1195 (vw), 1122 (w), 1077 (w), 1064 (w), 1035 (w), 1019 (w), 1008 (vw), 920 (w), ' 908 (w), 894 (w), 840 (vw), 816 (w), 757 (w), 711 (w); 1H NMR (500 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 1 ; 13C NMR (125 MHz, CDCI3) siehe Tabelle 2; ESI-FT-ICR-MS: m/z 317.20921 ([M+Na]+ , ber. für C18H30NaO3 + 317.20872).
Hygrophoron G12 (28)
(5Z)-5-(2-Hydroxytetradexylidene)-furan-2(5H)-on: farbloses Öl; 1H NMR (500 MHz,
CDCI3) siehe Tabelle 1. 2,3-Dihydroxy-2-(1-hydroxytridecyl)-4-methoxycyclopentanon (31) 1H NMR (500 MHz, CDCI3): 4.073 ddd (8.8/5.3/4.5) H-4, 2.956 ddd (19.4/8.8/0.7) 5A, 2.360 ddd (19.4/4.5/0.7) 5B, 3.435 s 4-OMe, 4.224 dd (5.3/0.7) H-3, 3.916 ddd (10.2/4.3/1.6) H-6; 13C NMR (125 MHz, CDCI3): 214.6 (C-1), 83.0 (C-2), 82.6 (C-3), 80.5 (C-4), 73.2 (C-6), 57.6 (4-OMe), 41.9 (C-5), 31-22 (C-7 - C17), 4.4 (C-18); ESI-FT-ICR- MS: m/z 367.24501 ([M+Na]+, ber. für ClgH36 aθ5 + 367.24549)
Η NMR Daten für H1-H7 von ausgewählten for Hygrophoronen in CDC13; 500 MHz. Signale der Alkylketten : 1.20 - 1.33 m (CH2)n, 0.880 t (1.0) CH3. 1 2 3 7 8 9 11 Pos. δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J ( 2 6.441 dd (6.2/1.8) 6.437 dd (6.1/1.6) 6.316 dd (6.1/1.8) .6.366 dd (6.1/1.6) 6.489 dd (6.4/1.8) 6.301 dd (6.0/1.3) 6.438 dd (6.2/ 3 7.462 .dd (6.2/2.1) 7.561 dd (6.1/2.2) 7.524 dd (6.1/2.0) 7.646 dd (6.1/2.0) 7.347 dd (6.4/2.1) 7.644 dd (6.0/2.3) 7.588 dd (6.2/ 4H 5.721 dd (2.1/1.8) 5.801 dd (2.2/1.6) 4.835 ddd (6.7/2.0/1.8) 4.873 dd (2.0/1.6) 6.244 dd (2.1/1.8) 4.727 dd (2.3/1.3) 5.722 dd (2.7/
4 OH / OAc 2.136 sOAc 2.171 sOAc 3.012 d (6.7) OH n.d. 2.135 sOAc 3.073 brs OH 2.156 sOA
5 OH / OAc 3.247 brs OH 3.185 brs OH 2.958 sOH n.d. 1.983* sOAc 2.196 brs OH n.d. 6H 5.017 m 3.725 dt (9.6/3.0) 5.145 dt (10.4/2.9) 3.859 m 5.176 f(6-5) 3.777 brd (10.1) 3.818 m
6 OH / OAc 1.996 sOAc 2.39 ÜΛd(3.0)OH 2.045 sOAc n.d. 2.123* s OAc 3.718 brs OH n.d. 12 13 14 17 18 19 Pos. δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ'H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) 2 6.300 dd (6.1/1.2) 6.438 dd (6.2/1.2) 6.470 dd (6.3/1.5) 6.537 dd (6.0/1.6) 6.466 dd (6.0/1.3) 6.591 dd (6. / .6)
. . 3 7.640 dd (6.1/2.4) 7.550 dd (6.2/2.8) 7.432 dd (6.3/2.8) 7.802 dd (6.0/2.6) 7.857 dd (6.0/2.4) 7.701 dd (6.1/2.1) 4H 4.793 dd (2.4/1.2) 5.785 dd (2.8/1.2) 5.967 dd (2.8/1.5) 5.734 dd (2.6/1.6) 4.850 ddd (7.212.41 \ .3) 5.827 dd (2.1/1.6)
4 OH / OAc n.d. 2.151 sOAc 2.094* sOAc 2.138 sOAc 3.046 d (7.2) OH 2.089 sOAc
5 OH / OAc n.d. 2.730 sOH 2.102* sOAc 4.064 sOH 4.646 sOH 4.622 brs OH 6H 5.177 dd (10.1/2.8) 5.086 dd (9.7/3.6) 5.227 dd (10.1/2.9) — — — — — —
6 OH / OAc 2.000 sOAc 2.062 sOAc 2.002 sOAc — — — — . — — 7A 1.7 m 1.7 m 1.69 m 2.595 ddd (17.9/8.1/6.7) 2.452 dt (17.6/7.4) 2.591 ddd (17.9/7.6/7. 7B 1.7 m 1.7 m 1.83 m 2.439 ddd (19.7/8.1/6.7) 2.390 dt (17.6/7.3) 2.320 ddd (17.9/7.6/7.
20 22 25 27 28 Pos. δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J (Hz) δ1H mult. J(Hz) δ H l Tiult. J (Hz) δ1H Mult •/(Hz) 1 H — — 5.707 ddd (2.1/2.0/1.1) 5.659 ddd (2.2/1.5/1.0) — — — —
1 OH / OAc — — 2.108 sOAc 2.018 sOAc — — — — 2 6.446 dd (6. /1.7) 6.159 ddd(6.1/2.1/1.1) 6.058 ddd (6.0/2.2/1.2) 6.256 dd (5.6/1.8) 6.230 dd (5.5/0.7) 3 7.722 dd (6.1/2.0) 6.190 ddd (6.1/1.9/1.1) 6.192 ddd (6.0/2.0/1.0) 7.794 dd (5.6/0.8) 7.372 dd (5.5/0.4) 4H 4.942 dd (2.0/1.7) 5.724 ddd (2.0/1.9/1.1) 4.932 ddd (2.0/1.4/1.4) — — — —
4 OH / OAc n.d. 2.018 sOAc n.d. — — — —
5 OH / OAc n.d. 4.003 brs n.d. 5.756 ddd (8.1/1.8/0.8) 5.326 ddd (8.4/0.7/0.4) 6H — — — — — — 4.52 m 4.793 m
6 OH / OAc — — — — — — n.d. n.d. 7A 2.643 ddd (18.3/8.0/6.9) 2.659 ddd (17.8/9.0/6.0) 2.698 ddd (17.718.216.7) 7B 2.464 ddd (18.3/8.0/6.5) 2.589 ddd (17.8/8.8/6.1) 2.541 ddd (17.7/8.2/6.6) n.d. = nicht detektiert; * Zuordnung unsicher, austauschbar - •
Tabelle 2. 13C NMR Daten von ausgewählten Hygrophoronen in CDC13, 500 MHz (in ppm) Pos 1 2 3 7 8 9 12 13 14 17 18 19 20 22 27 1 2023 2047 2045 2057 1976 2073 2059 2042 2004 201 2 201 3 1986 1995 77 5** 169 1 2 1344 1349 1325 133 1 135 4 133 5 1329 1354 1356 1354 134 1 136 0 1334 133 8 121 0 3 156 8 161 4 158 1 1627 1548 163 5 1628 157 7 1547 160 0 1648 158 2 1627 1345 140 5 4 79 7 79 3 78 8 79 5 75 6 71 4 71 5 72 5 70 7 73 6 71 7 80 4 79 5 86 2 1503
4 - • OzC-CHj 170 5 170 2 — — 170 2 — — 169 8 169 2 170 1 — 169 5 — 1697 —
4 - • 02C-CH3 20 9 20 8 — — 20 9* — — 20 7 20 3* 20 3 — 20 8 — 21 0 — 5 81 4 81 4 82 8 83 4 84 3 75 8 76 1 77 1 73 0 82 6 82 4 87 9 91 5 83 6 1173
5 - - O2C-CH3 — — — — 1694* — — — 168 6 — — — — —
5 - - 02C-CH3 — — — — 20 8* — — — 20 1* — — — — — 6 74 1 744 75 4 75 6 72 1 73 3 73 4 73 8 79 1 2053 2057 2027 205 8 2077 68 3 6 - - OjC-CHa 169 9 — 171 2 — 169 5* — 170 6 170 4 169 6 6 - 02C-CH3 20 7 — 21 1 — 20 6* — 20 5 20 7 20 5 7 28 7 ... ... *** 28 8 31 2 *** ... *** 37 0 37 1 39 0 39 2 38 3 38 1 1 3 - (ω-1) 31 8 *** *** *** 31 9 31 9 *** ... ... 31 9 31 9 32 0 32 0 32 0 320 29 63 29 63 29 68 29 62 29 61 29 72 29 74 29 75 29 72 29 59 29 61 29 67 29 60 29 59 29 70 29 73 29 73 29 71 29 57 29 59 29 65 29 56 29 5 29 66 29 68 29 71 29 69 29 5 29 53 29 64 29 4 29 4 29 50 29 52 29 59 29 62 29 4 29 45 29 61 29 32 29 33 29 43 29 45 29 57 29 57 29 34 29 39 29 56 29 30 29 26 29 42 29 44 29 45 29 5 29 28 29 32 29 51 28 95 29 0 29 12 29 0 29 37 29 4 25 9 25 8 29 41 23 0 23 1 23 3 23 0 23 7 25 3 22 6 227 29 35 227 227 22 8 22 8 22 8 22 8 26 1 227 ω 14 1 140 140 14 0 14 1 14 1 140 140 140 14 1 14 1 143 143 143 142 * wie in Tabelle 1, ** 1-OAc 1704 und 20 8 ppm, *** teilweise mcht aufgelöste CH2-Sιgnale zwischen 22 - 32 ppm
Tabelle 3
Inhibierungsfläche in mm2 für ausgewählte Hygrophorone nach Anwendung
von 20 or 40 μg. Eine größere Fläche korreliert mit einer höheren Aktivität
1 2 4 17 18 19 20 21 25 27
20 μg 23 188 2 86 55 55 83 14 1 43
40 μg 40 217 148 90 82 170 15 28 64
Antibakterielle Eigenschaften erfindunqsqemäßer Verbindungen
Die folgenden erfindungsgemäßen Verbindungen wurden im Hinblick auf ihre antibakterielle Aktivität evaluiert, im Vergleich mit konventionellen Mitteln.
Name Struktur
4,6-Di-O-acetylhygrophoron A12
Figure imgf000029_0001
2 4,6-Di-O-acetylhygrophoron A 14
Figure imgf000029_0002
3 4-O-Acetylhygrophoron D 12
4 4-O- Acetylhygrophoron D 14
1,4-Di-O-acetylhygrophoron E 12
Figure imgf000029_0003
Materialien und Verfahren
In-vitro-Bestimmung der antibakteriellen Aktivität
Minimale Inhibitorkonzentrationen (MIC) wurden durch ein Mikroverdünnungsverfahren in Übereinstimmung mit den NCCLS Richtlinien bestimmt (National Commitee for Clinical Laboratory Standards. Methods for Dilution Anti icrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 4th ed.; Approved Standard: NCCLS Document M7-A4; National Committee for Clinical Laboratory Satandars: Villanova, PA, USA 1997). In diesen Bestimmungen wurde Kationen eingestellte Müller-Hinton-Brühe (BBL, Lot 2218968) verwendet. Das Medium wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien (siehe oben) zugefügt. Serielle Verdünnungen in Platten mit 96 Vertiefungen wurden durchgeführt unter Einsatz eines Biomek 2000 Roboters. Der pH-Wert des Testmediums betrug 7,2 - 74. Vancomycin, Linezolid und Ciprofloxacin wurden als Vergleichsproben verwendet. Das Testpaneel umfasste Referenzstränge von ATCC ebenso wie klinische Isolate mit unterschiedlichen Resistenzmechanismen. Ein zellwandpermeabler Strang der Saccharomyces cerevisiae wurde als eucaryotischer Testorganismus zugefügt. Klinische Isolate wurden ursprünglich erhalten vom Universitätskrankenhaus Basel, Schweiz, sowie von anderen europäischen und US-amerikanischen Krankenhäusern. Diese Proben wurden bei -80° C als Glycerol-Kulturen gelagert.
Membranintegritätsassay
Der Membran undurchlässige fluoreszierende Nucleinsäurefarbstoff SYTOX Green (Roth BL, Poot M, Yue ST, Millard PJ. Appl. Env. Microbiol 63: 2421-31 , 1997) wurde verwendet um den Einfluß der Verbindungen auf die Membranintegrität der Bakterien zu bestimmen. SYTOX Green wurde zu Suspension von S. Aureus oder E. Coli in der Gegenwart oder in Abwesenheit der Verbindungen gegeben. Nach Inkubation für 20 Minuten bis 3 Stunden wurde die Fluoreszenz bestimmt in schwarzen Mikrotiterplatten mit einem Tecan-Spectrafluor-Plus-Fluoreszenzgerät bei einer Anregung mit 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 535 nm. Bakterien, lysiert mit Detergenzien (4% n- Octyl-beta-D-glycopyranosid (ONPG), 4% Triton-X-100) dienten als 100% Positiv- Kontrolle. Erythrocytenhemolyseassay
Verbindungen, die auf bakterielle Membranen einwirken, wurden im Hinblick auf ihre hemolytische Aktivität mit Schaferythocyten untersucht. Verbindungen wurden in Mi rotiterplatten mit 1% Erythrocyteπ in PBS für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren von freiem Hemoglobin wurde die überstehende Flüssigkeit bei 570 nm gemessen. Zellen, lysiert mit Triton-X-100 dienten als Positiv-Kontrolle.
Resultate
Die antibakterielle Aktivität ist in Tabelle 4 gezeigt. Die Verbindung 1 war die am stärksten aktive Verbindung, mit MIC-Werten von 0,5 - 2 μg/ml gegenüber Grampositiven Bakterien. Dies entspricht der Aktivität von Linezolid bzw. Vancomycin. Verbindungen 2, 3 und 4 waren moderat aktiv, mit MIC-Werten von 2 - 8 μg/ml. Verbindung 5 hat die schwächste Aktivität. Diese Verbindungen zeigten keine cross- Resistenz mit wichtigen marktüblichen Antibiotika. Stränge von MRSA und Vancomycin- resistem Enterococcus faecium (VRE) wurden auch inhibiert. Mit der Ausnahme von Moraxella waren diese Verbindungen nicht aktiv gegenüber Gram-negativen Bakterien (z.B. E. coli und Pseudomonas aeruginosa). Alle antibakteriellen Verbindungen waren auch aktiv gegenüber dem Hefe-Bakterium Saccharomyces cerevisiae. Die Verbindungen verloren ihre Aktivität wenn sie in der Gegenwart von 50% Serum getestet wurden (Tabelle 5). Sehr hohe Bindungsaffinität gegenüber Serumproteinen könnte der Grund für diesen Effekt sein. Um die Mechanismen der Wirkung zu untersuchen, wurden die Verbindungen im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, Membranzerstörung in Zellen von Staphylococcus aureus hervorzurufen (Tabelle 6 und Fig. 1). Alle aktiven Verbindungen zeigten einen sehr schnellen Permeabilisierungseffekt bei der Konzentration MIC oder bei höheren Konzentrationen. Verbindung 1 war aktiv im Erythrocytenhemolysisassay bei 25 μg/ml.
Die neu getesteten erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein breites antimikrobielles Spektrum, umfassend Gram-positive Bakterien und Hefen, was per se schon sehr interessant ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind somit interessant im Hinblick auf eine Anwendung als topische Desinfektionsmittel oder als spermicide oder mikrocide Mittel. Tabelle 4:AntibakterieIle Aktivität (MICs in μg/ml)
Figure imgf000032_0001
Tabelle 5. Antibakterielle Aktivität in der Gegenwart von 50% Humanserum (MIC in ug/ml)
Figure imgf000032_0002
Tabelle 6. SYTOX GREEN MEMBRANE Integritätsassay (% Permeabilität bei 2-8x MIC)
Figure imgf000032_0003
Figur 1 a) 20 min
Vancomycin Linezolid
Figure imgf000033_0001
μg/mL
b)
Figure imgf000033_0002
Die mit (inhib) gekennzeichneten Kurven zeigen die Wachstumsinhibierung (% Inhibierung), verglichen mit den behandelten Kontrollproben (Wachstum wurde gemessen als Fluoreszenz nach Lysis der Bakterien durch Detergentien). Die mit (perm) gekennzeichneten Kurven zeigen die Membranpermeabilität, gemessen als Fluoreszenz- Signal Inkubationszeiten waren 20 Minuten bzw 3 Stunden.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der Formel (II) oder (III)
Figure imgf000034_0001
II III
Figure imgf000034_0002
IVa IVb V wobei gestrichelte Bindungen optionale Bindungen benennen, so dass die jeweils betroffene Gruppierung OR' entweder in der Form eines Ketons oder in der Form der Gruppierung OR' vorliegt (im Falle der Ketonstruktur ist kein Rest R' vorhanden),
wobei weiter
X Wasserstoff, eine kurze Alkylkette, OH, O-Alkyl, wobei Alkyl wie vorstehend definiert ist, oder OR' darstellt, wobei wenn die Gruppierung X eine Hydroxygruppe und ist die am gleichen Kohlenstoffatom ebenfalls vorhandene Gruppierung OR' auch eine Hydroxygruppe, anstelle der beiden Hydroxygruppen auch eine Ketongruppe vorgesehen sein kann, R' entweder abwesend ist (bei der Gruppierung, die mit der gestrichelten Bindung gezeigt ist, so dass ein Keton entsteht) oder R' Wasserstoff oder Acyl ist, wobei Acyl die Gruppe CO-H oder CO-Alkyl bedeutet, wobei Alkyl wie vorstehend definiert ist, oder wobei die Gruppe R' auch eine verbrückende Gruppe ist, die zwei Sauerstoffatome, die mit R' verbunden sind, verbindet,
R" Wasserstoff, Halogen, Alkyl, wie vorstehend definiert, oder Perhaloalkyl darstellt, und wobei
R ausgewählt ist unter den folgenden Alternativen: lineare Alkylkette mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen; Oligoprenylrest (IVa), wobei n von 1 bis 10 ist und wobei die gestrichelt gezeichnete Bindung anzeigt, dass dieser Rest teilweise oder ganz hydriert sein kann, oder ein zum Oligoprenylrest (IVa) regioinvers angebundener Rest desselben Typs, d.h. X und die Anknüpfungsstelle (Bindung, die sich mit der Schlangenlinie kreuzt) sind vertauscht; Noroligoprenylrest (IVb), bei dem gegenüber IVa die erste CH2-Gruppe an der Bindungsstelle fehlt, wobei ansonst die Definition wie für Iva sind; oder 'Polyethylenglycolrest (V) (PEG), wobei m 0 oder 1 ist, p von 0 bis 50 ist, und wobei X ausgewählt ist unter OH, OMe oder OAc, wobei Ac (Acyl) wie oben definiert ist.
2. Verbindung der folgenden Formel
Figure imgf000035_0001
wobei sowohl die E als auch die Z Isomere umfasst sind, gemeinsam in Mischung oder einzeln und wobei Z eine lineare Alkylgruppe mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt oder den Rest CH2-0-Phenyl, und wobei R" wie in Anspruch 1 definiert ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R" Wasserstoff ist.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die lineare Alkylkette eine Alkylkette mit einer geradzahligen Anzahl an Kohlenstoff atomen ist.
5. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die lineare Alkylkette ausgewählt ist unter C-ιoH2ι, C-|2H25, Cι H29 und C16H33.
6. Verbindung Nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei R ausgewählt ist unter Geranyl, Neryl, Famesyl, Geranylgeranyl, Phytyl und Solanosyl.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei R ausgewählt ist unter Polyethylenglycolresten V, wobei p von 3 bis 10 ist und/oder X OMe ist.
8. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
3 3 3 3 3 3 3 3 11 II II II II II II II M M ^ ^ J^ M M M
Figure imgf000037_0002
Ji. 4. J. ψ. O) *■
Figure imgf000038_0001
22:R = Ac n=12 23: R = Ac n = 10 24:R = Ac n = 14 25:R = H n=12 26:R=H n=10
Figure imgf000038_0002
27 28 29
Figure imgf000038_0003
31 30
9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Medikament.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassen mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 sowie mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.
11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Biozid
12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Antibiotikum, als Fungizid, als Inhibitor für Enzyme, als Desinfektionsmittel oder als Holzschutzmittel.
13. Verwendung mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pilzerkraπkungen, Erkrankungen hervorgerufen durch gram-positive Keime, oder Infektionen, die Re- sestenzen zeigen im Hinblick auf eine Behandlung mit Vancomycin.
14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die Extraktion von Pilzen der Gattung Schnecklinge mit polaren oder unpolaren Lösungsmitteln oder überkritischem C02.
15. Verfahren nach Anspruch 14, weiter umfassend den Einsatz von Ultraschall, Wärme oder Druck.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, weiter umfassend mindestens einen weiteren pharmazeutisch aktiven Bestandteil.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei dieser zusätzliche aktive Bestandteil ausgewählt ist aus der Klasse der aktiven Mittel, die gegen gram-negative Bakterien wirken.
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