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Die
vorliegende Erfindung betrifft Tajixanthonhydrat und dessen Verwendung
zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
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Hintergrund der Erfindung
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Nach
Aussagen des Weltgesundheitsberichtes 2002 der World Health Organization
(WHO) sind Infektionskrankheiten weltweit nach wie vor die Todesursache
Nr. 1. Besonders in den Entwicklungsländern sterben jährlich Millionen
Menschen an den Folgen von Durchfallerkrankungen, Malaria, Tuberkulose,
AIDS und anderen Infektionskrankheiten. Während in den Industrieländern die
klassischen Infektionskrankheiten größtenteils zunächst besiegt
schienen, tritt hier nunmehr jedoch eine neue Problematik zu Tage:
Immer mehr Keime entwickeln Resistenzen gegenüber den gängigen Antibiotika. Dazu gehören die
Grampositiven Erreger wie die Staphylokokken und Enterokokken, welche
Septikämien
und andere Infektionen auslösen,
hauptsächlich
bei immunsupprimierten Patienten. Als besondere Problemherde sind
die Methicillin- und Oxacillin-resistenten Staphylokokken (MRSA,
ORSA), die Vancomycin-resistenten Enterokokken sowie die multiresistenten
Pseudomonaden zu nennen.
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Eine
weitere Herausforderung auf dem Gebiet der antibiotischen Wirkstoff-Findung
stellt die Suche nach natürlich
gebildeten, nichtoxischen Substanzen dar, die die Bildung von mikrobiellen
Biofilmen potent verhindern. Unter Biofilmen versteht man eine Gemeinschaft
von Mikroorganismen, die sich in eine extrazelluläre Polysaccharid-Matrix
einhüllt,
wodurch die Einzelzellen befähigt
werden, aneinander und/oder an Oberflächen zu haften (J. W. Costerton,
Z. Lewandowski, D. E. Caldwell, D. R. Korber, H. M Lappin-Scott,
Annu Rev Microbiol 1995, 49, 711–45; P. Stoodley, K. Sauer,
D. G. Davies, J. W. Costerton, Annu. Rev. Microbiol. 2002, 56, 187–209). Die
mikrobielle Gemeinschaft kann dabei sowohl aus einer als auch aus
mehreren Spezies bestehen. Die Organisation von planktonischen Zellen
in einem Biofilm führt
zu einer deutlich erhöhten
Widerstandsfähigkeit
der gesamten Population gegenüber
Umwelteinflüssen.
Biofilme sind daher nicht als eine Ansammlung von Einzelzellen zu
verstehen. Sie ähneln
vielmehr in ihrer Physiologie einem multizellulären Organismus, in dem unterschiedliche
Genexpression und metabolische Aktivität, Dynamik und Arbeitsteilung
herrschen.
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Biofilme
sind in der Natur weit verbreitet. Sie finden sich bevorzugt an
den Grenzflächen
zwischen fester und flüssiger
Phase und stellen im aquatischen Milieu (Flüssen, Seen, Meeren etc.) möglicherweise
die vorherrschende Lebensform von Mikroorganismen dar. Biofilme
können
aber auch zum Problemfall für
den Menschen werden. So stellen Biofilm-bildende humanpathogene
Bakterien eine bedeutende Ursache für chronische und rekurrierende
Infektionen in der Humanmedizin dar. Bekannte Beispiele hierfür sind die
Plaquebildung auf Zähnen
durch Streptokokken, die Alginatbildung von Pseudomonas aeruginosa
bei Lungeninfektionen im Rahmen einer cystischen Fibrose und nicht
zuletzt die Besiedlung von Kunststoff- und Metallimplantaten durch
Biofilm-bildende Staphylokokken in der modernen Intensivmedizin.
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Ein
weiteres wirtschaftlich bedeutendes Problemfeld außerhalb
der Medizin ist die Biofilmbildung auf den im Wasser befindlichen
Teilen von Schiffen. Biofilme bilden hier die organische Matrix
für den
Aufwuchs von Muscheln oder Bryozoen. Dieser Sekundäraufwuchs
auf Schiffsrümpfen
kann mehrere Dezimeter dick werden. Die Folge ist eine drastische
Erhöhung
des Wasserwiderstandes und damit eine Reduktion der Beweglichkeit
und der Fahrtgeschwindigkeit der Schiffe. Der auf beiden Gebieten,
(i) Biofilm-Bildung auf Materialien, die in Haushalt oder Klinik
benutzt werden, und (ii) Biofilm-Bildung auf Fahrzeugen im aquatischen
Milieu, eintretende wirtschaftliche Schaden ist beträchtlich
und beträgt
weltweit die Größenordung
von mehreren 100 Millionen EUR. Deshalb wird intensiv nach Substanzen
gesucht, die die Biofilm-Bildung hemmen.
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Eine
rationale Suche nach potenten bioaktiven Substanzen setzt an der
Erforschung derjenigen Prozesse an, die im aquatischen Milieu eine
Biofilm-Bildung verhindern. Es ist bekannt, daß Organismen, die im Süß- oder
im Meerwasser vorkommen, meist jahrelang ohne Aufwuchs leben können. Eine
Strategie dieser Organismen (meist Tiere) ist es, durch Schleimabsonderung
die Biofilm-bildenden Mikroorganismen von ihrer Oberfläche wegzuspülen. Weiterhin
beherbergen diese aquatischen Tiere Mikroorganismen, die bioaktive Substanzen
bilden und diese an die Oberfläche
der Tiere abgeben. Somit wird die Primärbesiedelung durch Biofilm-bildende
Mikroorganismen unterdrückt;
infolge dessen wird auch eine Besiedelung mit Sekundärorganismen
verhindert.
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Solche
bioaktiven Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf Primär- und Sekundärbesiedelung ausüben, werden
Antifouling-Wirkstoffe genannt. Bisher sind noch keine Substanzen
aus lebenden Organismen, die eine solche Antifouling-Aktivität besitzen,
bekannt.
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Ziel
der Forschung auf diesem Gebiet muß es deshalb sein, derartige
Mikroorganismen zu identifizieren, die bioaktive Substanzen mit
Antifouling-Wirksamkeit produzieren. Zur wirtschaftlichen Nutzung
solcher Antifouling-Substanzen muß auch gewährleistet sein, daß diese
Produzenten kultivierbar sind. Einen solcher Organismus ist der
Pilz der Spezies Emericella variecolor, der Wirkstoffe aus der Klasse
der Tajixanthonhydrate produziert. Im Folgenden wird die Anwendung
von Tajixanthonhydrat und verwandten Diolen als potente Wirkstoffe
zur Verhinderung der Biofilm-Bildung beschrieben.
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Im
Hinblick auf die wachsende Bedeutung von nosokomialen Infektionen
haben die Erfinder ihre Bestrebungen auf die Identifizierung von
Biofilm-inhibierenden Wirkstoffen gegen multiresistente Staphylococcus-aureus-
und S.-epidermidis-Erreger konzentriert. Diese Bakterien treten
hauptsächlich
im Zusammenhang mit der Verwendung von Kunststoff- und Metallimplantaten
auf und lösen
besonders bei immunsupprimierten Patienten schwere Allgemeininfektionen
aus. Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus sind gegenwärtig die
häufigste
Ursache für
Krankenhausinfektionen überhaupt.
Beide Spezies bilden auf künstlichen
Oberflächen
(z. B. auf Venenkathetern, Herzschrittmachern oder auf Gelenkersatz)
Biofilme aus, die aus den Bakterien selbst und einer Polysaccharidmatrix
bestehen. Diese Matrix, die auch als Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin (PIA)
bezeichnet wird, besteht aus β-1,6-verknüpften Glucosaminoglycan-Untereinheiten, die
mit unterschiedlichen Seitengruppen substituiert sind (D. Mack,
W. Fischer, A. Krokotsch, K. Leopold, R. Hartmann, H. Egge, R. Laufs,
J. Bacteriol. 1996, 178, 175–83).
Die Substanz vermittelt die Adhärenz
der Zellen untereinander und ist damit für das dreidimensionale, mehrschichtige
Wachstum eines Staphylokokken-Biofilms verantwortlich. Bisher konnte
man vier Proteine, IcaA, IcaD, IcaB und IcaC, identifizieren, die
in die PIA-Synthese involviert sind (C. Heilmann, O. Schweitzer,
C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack, F. Götz, Mol. Microbiol. 1996, 20,
1083–91;
C. Gerke, A. Kraft, R. Süssmuth,
O. Schweitzer, F. Götz,
J. Biol. Chem. 1998, 29, 18586–93).
Die Gene, die für
diese Enzyme kodieren, sind im so genannten icaADBC-Operon organisiert, das
bisher in allen getesteten S.-aureus-Isolaten und in 70 bis 80 Prozent
aller S.-epidermidis-Stämme
aus Fremdkörper-assoziierten
Infektionen nachgewiesen wurde (W. Ziebuhr, C. Heilmann, F. Götz, P. Meyer,
K. Wilms, E. Straube, J. Hacker, Infect. Immun. 1997, 65, 890–6; S. E.
Cramton, C. Gerke, N. F. Schnell, W. W. Nichols, F. Götz, Infect
Immun. 1999, 67, 5427–33).
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Obwohl
das PIA nach allen bisherigen Erkenntnissen der wichtigste Faktor
für den
Aufbau eines Biofilms bei Staphylokokken ist, sind daran aber auch
noch weitere Komponenten beteiligt. So konnte nachgewiesen werden,
daß die
Etablierung eines Biofilms in zwei Phasen abläuft. Die erste Phase erfordert
zunächst
die Adhärenz
der Staphylokokken auf der Oberfläche, an die sich in der zweiten
Phase die PIA-vermittelte Akkumulation des Biofilms anschließt. Die
erste Phase der Biofilmbildung, die auch als initiale Adhärenz bezeichnet wird,
wird bei S. epidermidis durch ein Oberflächenprotein vermittelt, das
als AtlE bekannt ist (C. Heilmann, M. Hussain, G. Peters, F. Götz, Mol.
Microbiol. 1997, 24, 1013–24).
AtlE übt
neben der initialen Adhärenz
noch eine weitere Funktion in der Staphylokokkenzelle aus. Es ist
als Autolysin-Protein an der Separation der Zellwand bei der Zellteilung
beteiligt. Mutationen im atlE-Gen führten daher zur Hemmung der
Biofilmbildung auf Oberflächen
und zur Entstehung von Zellaggregaten im Kulturüberstand (C. Heilmann, M. Hussain,
G. Peters, F. Götz,
Mol. Microbiol. 1997, 24, 1013–24).
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Beschichtungen
von z. B. Kathetern mit antimikrobiell wirksamen Substanzen wie
Minocyclin oder Rifampicin oder die Instillation von Antibiotika
in das Katheterlumen sind eine von mehreren Möglichkeiten, Biofilmbildung
zu verhindern oder zu unterdrücken.
In der Mehrzahl der im medizinischen Bereich auftretenden Biofilmen
wird lediglich eine therapeutische Behandlung mit konventionellen
Bioziden durchgeführt,
eine effiziente Prophylaxe ist bislang noch nicht erzielt worden.
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Chexal,
Kuldip K.; Holker, John S. E.; Simpson, Thomas J. "Biosynthesis of fungal
metabolites. VI. Structures and biosynthesis of minor metabolites
from variant strains of Aspergillus variecolor. Robert Robinson
Lab., Univ. Liverpool, Liverpool, UK Journal of the Chemical Society,
Perkin Transactions 1: Organic and Bio-Organic Chemistry (1972–1999) (1975),
(6), 549–54.
beschreiben die Bildung von Tajixanthonhydrat (Formel 1) durch Hydrolyse
von Tajixanthon (dem Epoxid). Biologische Aktivitäten werden
nicht erwähnt.
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Malmstrom
et al. (Malmstrom J, Christophersen C, Barrero AF, Oltra JE, Justicia
J, Rosales A. "Bioactive
metabolites from a marine-derived strain of the fungus Emericella
variecolor." J Nat
Prod 2002 Mar; 65(3): 364–7)
beschreiben die Isolierung der Stoffe Varitriol, Varioxiran, Dihydroterrein
und Varixanthon aus dem Pilz Emericella variecolor. Varixanthon
zeigte eine antimikrobielle Aktivität.
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Malstrom
et al. beschreiben weiterhin die antimikrobielle Aktivität von Tajixanthonhydrat
gegenüber
E. coli, E. faecalis, B. subtitis und S. aureus. Formel
1:
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Es
ist somit eine Aufgabe des vorliegen den Erfindung, neuartige Verwendungen
von Tajixanthonhydrat zur Verfügung
zu stellen.
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Durch
die Anwendung eines einfachen Screening-Assays zur Biofilmbildung
bei Staphylokokken (G. D. Christensen, W. A. Simpson, J. J. Younger,
L. M. Baddour, F. F. Barrett, D. M. Melton, E. H. Beachey, J. Clin. Microbiol.
1985, 22, 996–1006)
konnte aus dem marinen Pilz Emericella variecolor die bioaktive
Verbindung isoliert werden, die als Tajixanthonhydrat 1 identifiziert
wurde. Diese Substanz greift beispielsweise in die Biofilmbildung
von Staphylokokken ein, ohne den Erreger abzutöten.
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Die
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
die Verwendung von Tajixanthonhydrat (Formel 1) zur Behandlung von
Tumorerkrankungen gelöst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Tajixanthonhydrat,
gegebenenfalls als eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend
eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß der vorliegenden
Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.
Diese Stoffe sind dem Fachmann gut bekannt und können der einschlägigen Literatur
entnommen werden. Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Verwendung,
bei der die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer, gegebenfalls
zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungslösung oder
Trägersubstanz
vorliegt. Besonders bevorzugt liegt diese als Oberflächenbeschichtung,
als Zusatz von Werksstoffen oder Spüllösungen vor. Weiter bevorzugt
ist eine pharmazeutische Zusammensetzung oder Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung, die weitere Chemotherapeutika enthält. Diese Chemotherapeutika
können
alle für
den Fachmann üblichen
Chemotherapeutika im Rahmen einer Krebstherapie umfassen (z. B.
Taxol oder andere).
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Erfindungsgemäß kann Tajixanthonhydrat
bevorzugt mit den üblichen
Lösungsmitteln,
Hilfs- und Trägerstoffen
zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-
und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch
zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu
finden.
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In
Vergleichsbeispielen wurden Biofilm-inhibierende Aktivitäten durch
Nachweis des Wachstums und Anheftung von S. epidermidis (Klinikisolat)
auf Polystyrol-Platten mit oder ohne Zugabe von Tajixanthonhydrat (gereinigter
Extrakt) getestet. Dabei konnte gezeigt werden, daß nach 24
h schon eine Konzentration von 10 μg/ml die Biofilmbildung um 81%
reduziert hat (80 μg/ml – 91%) Weiterhin
konnte festgestellt werden, daß die Substanz
die Bakterien weder abtötet,
noch die Wachstumsrate inhibiert ist. Ungeklärt ist allerdings, wo im Stoffwechsel
der Bakterien das Tajixanthonhydrat eingreift, damit die Biofilmbildung
inhibiert wird.
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Ein
weiterer Vergleichs-Test zur Bestimmung der Wirkung von Tajixanthonhydrat
bei Biofilmen war der Nachweis der Biofilm-Inhibition an Polystyrolplatten
von Bakterien aus Salzwasser (isoliert aus dem Meeresschwamm Suberites
domuncula) nach Anzucht dieser auf verschiedenen Materialien.
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Danach
wurden die Kolonien isoliert und reine Bakterienkolonien hergestellt,
die anschließend
für 72 h
mit (verschiedene Konzentrationen) oder ohne Zusatz von Tajixanthonhydrat
inkubiert wurden. Der entstandene Biofilm wurde nach Anzahl der
Bakterien (CFU) analysiert und eine Reduktion, in Abhängigkeit
der getesteten Bakterienstämme,
bei einer Konzentration von 1 μg/ml
zwischen 30% und 65% festgestellt, bei einer Konzentration von 10 μg/ml zwischen
70% und 90%.
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Für die erfindungsgemäße Anwendung
wurde die Substanz auf ihre Wirkung auf Tumorzellen getestet. Unter
Benutzung von Nager- und humanen Tumorzelllinien konnte in vitro
gezeigt werden, daß Tajixanthonhydrat
eine zytostatische Aktivität
ausübt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von Tajixanthonhydrat
zur Behandlung von Tumorerkrankungen. Diese Verwendung kann zum
Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen
mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder
Trägersubstanz
erfolgen. Im Falle der Behandlung von Tumorerkrankungen ist eine
Behandlung in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,3 und 30,0 μg/ml bevorzugt.
Die Herstellung solcher Medikamente kann analog zu der oben beschriebenen
Weise erfolgen.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Behandlung
einer Erkrankung, ausgewählt
aus Tumor- und/oder bakteriellen Erkrankungen und/oder Entzündungszuständen, die
das Verabreichen einer erfindungsgemäßen Verbindung, etwa in Form
einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung, umfaßt.
Die Verabreichung kann erfindungsgemäß in Form einer Depotsubstanz
oder als Vorläufer
zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungslösung oder
Trägersubstanz
erfolgen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung soll unter einem "Derivat" eine Verbindung
der Tajixanthon-Klasse verstanden werden, die aus anderen (z. B.)
marinen Organismen isoliert werden kann, als den hier (beispielhaft)
erwähnten.
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Unter
einem "Vorläufer" einer Substanz soll
im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstanden
werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die
Bedingungen im Körper
(z. B. pH im Magen, oder ähnliches)
so verändert
wird, oder aber durch den Körper
nach Aufnahme so metabolisiert wird, daß sich als wirksame Substanz
die erfindungsgemäße Verbindung
oder deren Derivate bilden. Zum anderen werden als Vorläufer aus
Organismen isolierte Derivate von Tajixanthon verstanden, die als Ausgangsprodukte
zur Synthese der Verbindung in dem jeweiligen Organismus dienen
und bereits die hierin angegebenen Eigenschaften des Tajixanthon
aufweisen.
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Die
Erfindung soll nun im folgenden weiter in den Beispielen unter bezug
auf die beigefügte
Figur beschrieben werden, ohne jedoch auf diese begrenzt zu sein.
Es zeigt
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1.
Die Wachstumskurve eines Biofilm-negativen S. epidermidis 196 nach
Zugabe von Tajixanthonhydrat (cfu: Colony-forming units) (Vergleichsbeispiel).
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Beispiel 1:
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Beschreibung des allgemeinen Verfahrens
der Pilzanzucht und der Isolierung der bioaktiven Substanz
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Der
vorliegende Pilzstamm der Spezies Emericella variecolor wurde am
16.05.2000 aus dem marinen Schwamm Haliclona valliculata, welcher
vor der Capo di Fonza auf Elba, Italien, gesammelt wurde, isoliert.
Der Schwamm wurde sofort nach der Entnahme mit Hilfe einschlägiger marin-mykologischer
Methoden auf seinen Pilzbesatz hin untersucht. Die vorliegende Isolation
wurde durch Auslegen kleiner Gewebestückchen des sezierten Schwammes
auf einer Nähragarplatte
folgender Zusammensetzung (CYAS-Medium; J. I. Pitt, Mycologia 1973,
65, 1135–1157)
gewonnen:
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Czapek-Yeast Extract-Agar + Seawater:
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- 30 g Saccharose
- 5 g Yeast Extract
- 3 g NaNO3
- 1 g K2HPO4
- 10 ml Mineral-Lösung:
- 5 g KCl, 5 g MgSO4 + 7H2O,
0,1 g FeSO4 + 7H2O/100
ml H2O
- 1 ml Spurenmetall-Lösung:
- 1 g ZnSO4 + 7H2O,
0,5 g CuSO4 + 5H2O/100
ml H2O
- Antibiotika
- 1000 ml Meerwasser (30–33
PSU)
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Durch
mehrere Reinigungsstufen wurde die primäre Rohkultur zu einer axenischen
Reinkultur weitergezüchtet.
Die Stammkultur erfolgte auf Schrägagarröhrchen folgender Zusammensetzung
(GPYNS-Medium; K. Schaumann, Mar. Biol. 1974, 28, 221–235):
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Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Ammoniumnitrat-Meerwasser-Agar:
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- 1,0 g Glucose
- 0,5 g Pepton
- 0,1 g Hefeextrakt
- 1,0 g Ammoniumnitrat
- 15,0 g Agar
- 1000 ml Meerwasser (30–33
PSU)
- PH 7,2–7,4
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Die
Anzucht der Pilzkultur für
die Gewinnung des Naturstoffes Tajixanthonhydrat erfolgte in 1-L-Erlenmeyerkolben,
die mit je 300 ml Nährlösung folgender
Zusammensetzung (WS-Medium;
L. J. Wickerham, US Dept. Tech. Bull. 1951, 1029, 1–56) beschickt
wurden:
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Wickerham-Meerwasser-Medium:
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- 3,0 g Hefeextrakt
- 3,0 g Malzextrakt
- 5,0 g Pepton
- 10,0 g Glucose
- 1000 ml Meerwasser (30–33
PSU)
- PH 7,2–7,4
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Die
Sterilisation der Nährlösung erfolgte
durch Autoklavieren bei 121°C/1
bar, 15 Minuten. Als Inokulum für
die experimentelle Pilzkultur dienten zehn Stück Mycelscheibchen (Durchmesser
5 mm) je Kolben. Diese wurden aus einer 7 Tage alten Vorkultur auf
WS-Agar mit Hilfe eines Korkbohrers ausgestanzt und in die Nährlösung (300
ml je Kolben) übertragen.
Die Inkubation der beimpften Kolben erfolgte über einen Zeitraum von 14 Tagen
bei Raumtemperatur oder auch konstant 20°C in statischer Kultur im Dunkeln.
Anschließend wurde
das gewachsene Mycel einschließlich
der Kulturbrühe
abgeerntet, mit 40 ml Ethylacetat pro 300 ml Kulturbrühe versetzt
und bei –86°C tiefgefroren.
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Von
insgesamt 30 300-ml-Kulturansätzen
wurde das Mycel vom Kulturmedium durch Filtration getrennt und das
Kulturfiltrat dreimal mit je einem Liter Essigester extrahiert.
Die Essigesterphasen wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne
eingeengt. Dieser Extrakt wurde in 200 ml Methanol + 3% Wasser aufgenommen
und dreimal mit je 100 ml Petrolether extrahiert. Die Petroletherphasen
wurden vereinigt im Vakuum eingeengt und einer präparativen
HPLC-Trennung unterzogen:
Säule:
Waters SymmetryPrep C18, 19 × 300
mm
Eluent: Wasser, Acetonitril + 0.05% TFA
Gradient: von
70% Acetonitril auf 94% Acetonitril in 20 min, 30 min halten auf
94% Acetonitril
Fluss: 12 ml/min
Detektion: 254 nm
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Zwischen
18 und 19 min eluierte eine Vorstufe, welche sich beim Einengen
und Trocknen vollständig zu
Tajixanthonhydrat umwandelte. Durch einen weiteren präparativen
HPLC-Lauf wurde
die Verbindung weiter aufgereinigt:
Säule: Waters SymmetryPrep C18,
19 × 300
mm
Eluent: Wasser, Acetonitril + 0.05% TFA
Gradient: von
10% Acetonitril auf 100% Acetonitril in 30 min
Fluss: 12 ml/min
Detektion:
254 nm
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Tajixanthonhydrat
eluierte zwischen 24 und 25 min und ergab nach dem Trocknen 12 mg
eines gelben, kristallinen Feststoffs (mp 195°C; [α] 25 / D –58.6° (CHCl
3;
c = 0.33)). Die NMR-Daten
stimmten gut mit früher
veröffentlichten
(J. S. D. Holker, R. D. Lapper, T. J. Simpson, J. Chem. Soc., Perkin
Trans. 1 1974, 2135–2140) überein.
MS
(70 eV): m/z (%) 440 (46) [M
+], 372 (44),
371 (45), 333 (86), 283 (28), 255 (36).
Tabelle 1 NMR-Daten von Tajixanthonhydrat
| Position | δH(ppm) | δC(ppm) |
| 1 | 7.22
d | 119.34 |
| 2 | | 138.81 |
| 3 | | 149.84 |
| 4 | | 121.15 |
| 5 | | 117.08 |
| 6 | | 152.21 |
| 7 | | 184.58 |
| 8 | | 109.49 |
| 9 | | 160.67 |
| 10 | 6.76
d | 110.21 |
| 11 | 7.52
d | 138.41 |
| 12 | | 116.31 |
| 13 | | 153.36 |
| 14 | 5.40
dd | 63.52 |
| 15 | 2.74
d | 45.07 |
| 16 | 4.34
ddd/4.42 dd | 64.81 |
| 17 | | 142.70 |
| 18 | 1.85
s | 22.72 |
| 19 | 4.58
dd/4.81 dd | 112.54 |
| 20 | 2.35
d | 17.59 |
| 21 | 2.70
dd/3.19 dd | 32.13 |
| 22 | 3.74
dd | 77.99 |
| 23 | | 73.31 |
| 24 | 1.42
s | 26.74 |
| 25 | 1.37
s | 23.77 |
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Beispiel 2: (Vergleichsbeispiel)
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Biologische Aktivitäten
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Wirkung
des Tajixanthonhydrates im quantitativen Staphylokokken-Biofilmassay
Anwendungsgebiet: Verhinderung des Entstehens eines Staphylokokken-Biofilmes
auf Kunststoff- und Metalloberflächen
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Biofilm-Assay (S.-epidermidis-Klinik-Isolate)
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Eine Übernachtkultur
des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis RP62A wird 1:200 in
TSB (Tryptic Soy Broth) verdünnt.
96-Loch-Gewebekultur-Platten (Greiner, Nürtingen, Deutschland) werden
mit jeweils 200 μl
der Bakteriensuspension pro Vertiefung angeimpft und mit dem zu
testenden Extrakt (in DMSO) versetzt. Nach 24 Stunden Inkubation
bei 37°C
wird die optische Dichte des Überstandes
bei 600 nm gemessen; anschließend
wird aus den Vertiefungen abpippettiert. Der Überstand wird 1:106 mit
frischem TSB-Medium verdünnt
und zur Lebendzellzahlbestimmung (CFU, Colony Forming Unit) auf
TSB-Agarplatten ausplattiert. Die Gewebekulturplatte wird 3x mit
PBS (Phosphat-gepufferte Saline) gewaschen, bei 37°C vollständig getrocknet und
anschließend
mit einer gesättigten
Kristallviolettlösung
(je 200 ⎕l pro Vertiefung für 5 Minuten) gefärbt. Nach
erneutem Waschen und Trocknen bei 37°C wird die Absorption des anhaftenden
Biofilms bei A490 nm mit Hilfe eines ELISA-Platten-Readers bestimmt.
Eine Absorption von < 0.12
gilt als negativ, eine Absorption von 0.12–0.24 gilt als schwach positiv
und eine Absorption von > 0.24
gilt als Biofilm-positiv.
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Ergebnis:
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Es
wurden verschiedene Extrakte in Konzentrationen von 10, 20, 50,
100 μg/ml
getestet. Die Substanz Tajixanthonhydrat reduzierte die Biofilmbildung
von S. epidermidis RP62A um bis zu 91%, ohne jedoch die Wachstumsrate
der Bakterien zu beeinträchtigen
oder die Keime zu töten
(Tab. 2, 3;
1). Die Daten hinsichtlich der
Biofilminhibierung konnten durch Elektronenmikroskopie (REM) und
konfokale Mikroskopie (CLSM) bestätigt und abgesichert werden.
Damit übt
Tajixanthonhydrat einen deutlich hemmenden Effekt auf die Biofilmbildung
von S. epidermidis aus, wobei an dieser Stelle noch offen bleibt,
ob die Substanz die initiale Adhärenz
der Staphylokokken beeinträchtigt
und/oder eher in die akkumulative Phase der Biofilmbildung (PIA-Synthese)
eingreift. Tabelle 2 Effekt des Tajixanthonhydrates auf die
Biofilmbildung von S. epidermidis RP62A
| Konzentration
(μg/ml) | A490 nm | %
Biofilm-Reduzierung | CFU
im Kulturüberstand |
| 0 | 1.029 ± 0.14 | | 1.51E+7 |
| 10 | 0.192 ± 0.04 | 81 | 2.85E+7 |
| 20 | 0.167 ± 0.06 | 84 | 5.77E+7 |
| 30 | 0.166 ± 0.04 | 84 | 3.05E+7 |
| 40 | 0.159 ± 0.04 | 84 | 4.37E+7 |
| 50 | 0.119 ± 0.01 | 88 | 4.9E+7 |
| 60 | 0.11 ± 0.02 | 89 | 1.3E+7 |
| 70 | 0.1 ± 0.03 | 90 | 3.31E+7 |
| 80 | 0.091 ± 0.02 | 91 | 1.06E+8 |
| 90 | 0.09 ± 0.03 | 91 | 2.92E+7 |
| 100 | 0.092 ± 0.03 | 91 | 3.37E+7 |
Tabelle 3 Wachstumsrate und Generationszeit des
Biofilm-negativen S. epidermidis-Stammes 196 nach Zugabe von Tajixanthonhydrat
| Experiment | Spezifische
Wachstumsrate (μ) | Generationszeit
(G) |
| Kontrolle | 0.64
hr–1 | 1.14
hr |
| 20 μg/ml | 0.68
hr–1 | 1.17
hr |
| 100 μg/ml | 0.60
hr–1 | 1.46
hr |
-
Beispiel 3: (Vergleichsbeispiel)
-
Wirkung des Tajixanthonhydrates im Biofilmassay
(Anwendungsgebiet: Beispielsweise Verhinderung des Aufwuchses auf
Schiffsrümpfen):
-
(a) Gewinnung von Bakterien, die Biofilme
produzieren, aus dem aquatischem Milieu
-
Solide
Platten wurden etwa ein bis drei Tage lang im Wasser aufgestellt,
im hier vorliegenden Beispiel in Seewasser-Aquarien. Entsprechend
können
die Platten zur Biofilm-Bildung auch in Süßwasser gelegt werden. Als
Material (Dicke bis zu 3 cm) wurden Platten z. B. aus Aluminium,
Polyacryl, Glas oder anderem Material ausgewählt. Nach der submersen Verweilzeit
in Seewasser siedelten sich Biofilm-produzierende Mikroorganismen
auf den Platten an. In dem hier aufgeführten Beispiel wurden Bakterienkolonien
isoliert und auf Agarplatten weiter gezüchtet. Diese Vereinzelungsschritte,
die zur Herstellung von reinen Bakterien-Kolonien führen, sind
Stand der Technik; deshalb braucht hier nicht auf die Methodik eingegangen
zu werden. Die Biofilm-produzierenden Bakterien wurden zusammen
mit kommensalistischen/symbiontischen Bakterien aus dem Meeresschwamm
Suberites domuncula isoliert. Die Methode ist beschrieben (N. L.
Thakur, U. Hentschel, A. Krasko, C. T. Pabel, A. C. Anil, W. E.
G. Müller,
Aquatic Microbial. Ecol. 2003, 31, 77–83). Als Kultivierungsmedium
für die
Bakterien wurde Agar benutzt, der wie folgt zusammengesetzt war:
0,25% Pepton, 0,15% Hefe-Extrakt, 0,15% Glycerol, 1,6% Agar (in
100% Seewasser). Die "Fouling-Bakterien"-Stämme wurden
als FB1, FB2 und FB3 bezeichnet
-
(b) Methode zur Bestimmung der Antifouling-Aktivität
-
Die
Bakterien, Stämme
FB1, FB2 und FB3, wurden in dem Medium B-1 (0,25% Pepton, 0,15%
Hefe-Extrakt, 0,15% Glycerin in 100% Seewasser) vermehrt; die Inkubation
geschah in Schüttelkulturen
bei 30°C. Nach
der Anzüchtung
wurden 5 μl
dieser Übernachtkultur
von Bakterien zu 2 ml B-1-Medium gegeben. Diesem Ansatz wurde nun
in steigenden Konzentrationen Tajixanthonhydrat zugegeben. Als Konzentration
wurde der Bereich 0,1 bis 30 μg/ml
(Endkonzentration) ausgewählt.
In den Kontrollen wurden die Bakterien (Stämme FB1, FB2 und FB3) nur in
Medium mit dem Lösungsmittel
für die
Testsubstanz Tajixanthonhydrat (< 1%
DMSO), sowie in den gleichen Testgefäßen inkubiert.
-
Zur
Durchführung
der Bebrütung
wurden nun die jeweiligen 2-ml-Ansätze in 6-Well-Platten aus Polystyrol
gegeben (Falcon no. 3836). Eine Inkubation bei 30°C für eine Dauer
von 72 Stunden schloß sich
an. Während
dieser Inkubation bildeten die Bakterien an der angrenzenden Festphase,
dem Plastikmaterial, einen Biofilm.
-
Nach
der Inkubation wurde das Medium mit den in diesem sich befindlichen
Bakterien aus den Wells abpippetiert; die Wells wurden anschließend noch
zweimal mit sterilem Seewasser ausgespült, um leicht-adhäriende Bakterien
zu entfernen. Diejenigen Bakterien, die den Biofilm während dieser
Bebrütung
produziert hatten, blieben nach dieser Behandlung noch auf den Plastikwandungen
der Inkubationsgefäße.
-
Auswertung:
Es wurde die Anzahl der fest-adhärienden
Bakterien, die sich in der Biofilm-Matrix befanden, wie folgt bestimmt.
Ein autoklavierter/sterilisierter Wattebausch (Durchmesser des stumpfen
Endes: 3 mm) wurde benutzt, um unter stets standardisierten Bedingungen
Aliquots an adhärenten
Biofilm-Bakterien zu gewinnen. Der Wattebausch wurde anschließend unter
Schütteln
2 Minuten lang in 10 ml steriles Seewasser überführt. Danach wurden 100-μl-Aliquots
dieses Bakterien/Seewasser-Ansatzes entnommen und auf Agar-Platten
mit B-1-Medium ausgestrichen. Die Ansätze wurden 24 Stunden lang
bei 30°C
inkubiert. Die Anzahl der Kolonien pro 1-cm2-Fläche wurde
bestimmt. In einem Vorversuch war die Konzentration der Bakterien im
Seewasser derart eingestellt worden, dass sich in den Kontrollansätzen ohne
Tajixanthonhydrat im Durchschnitt 2–5 × 102 Bakterienkolonien
pro cm2 auf den Agarplatten ausbildeten.
Die Kolonien wurden unter einem Binokular ausgezählt. Die Anzahl dieser Kolonien
ist in "Colony-Forming
Units (CFU)" angegeben.
-
Die
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellt.
| Bakterien-Stamm | Kontrolle | Tajixanthonhydrat |
| | (102 CFU/cm2) | Konzentration
(μg/ml) | (102 CFU/cm2) |
| FB1 | 3,4 ± 0,5 | | |
| FB1 | | 0,1 | 3,9 ± 0,6 |
| FB1 | | 1 | 1,8 ± 0,4 |
| FB1 | | 10 | 0,6 ± 0,3 |
| FB1 | | 30 | 0,2 ± 0,2 |
| FB2 | 3,1 ± 0,6 | | |
| FB2 | | 1 | 2,1 ± 0,6 |
| FB2 | | 10 | 0,9 ± 0,3 |
| FB3 | 3.9 ± 0,5 | | |
| FB3 | | 1 | 1,4 ± 0,3 |
| FB3 | | 10 | 0,4 ± 0,3 |
Tabelle
4: Anzahl an Biofilm-produzierenden Bakterien in Abhängigkeit
von der Zugabe an Tajixanthonhydrat. Die Quantifizierung erfolgte
durch Angabe von Colony-Forming Units (CFU). Die Anzahl der Parallelversuche war
5.
-
Ergebnis:
Wie in der Tabelle zusammengefaßt,
enthielt der Abstrich der Kulturgefäß-Wände (Wells), die mit Biofilm-produzierenden
Bakterien in Abwesenheit der Substanz (Kontrolle) inkubiert wurden,
eine Konzentration an Bakterien, die mit 3,4 ± 0,5 × 102 CFU/cm2 angegeben wird. Wird Tajixanthonhydrat
in steigenden Konzentrationen zu dem Inkubationsmedium hinzugegeben,
kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme an Bakterien.
Bereits bei einer Konzentration von 1 μg/ml beträgt die Menge an Bakterien nur
noch 1,8 ± 0,4 × 102 CFU/cm2 (bei Bakterienstamm
FB1). Diese Abnahme ist signifikant (P < 0.001 – T-Test; nach: L. Sachs, Angewandte
Statistik. Springer, Berlin; 1984). Die starke inhibierende Wirkung
von Tajixanthonhydrat ist Bakterienstamm-abhängig etwas unterschiedlich.
Der Stamm FB2 wird mit einer Reduktion auf 2,1 ± 0,6 × 102 CFU/cm2 etwas geringer inhibiert; dafür ist die
Reduktion des Stammes FB2 nach Inkubation mit Tajixanthonhydrat
(1 μg/ml)
mit 1,4 ± 0,3 × 102 CFU/cm2 vergleichsweise
stärker.
Bei der höheren
Tajixanthonhydrat-Konzentration von 10 μg/ml ist die Abnahme der Besiedelung
an Biofilm-produzierenden Bakterien noch stärker und beträgt bei dem
Stamm FB1 0,6 ± 0,3 × 102 CFU/cm2.
-
Aus
diesem Befund muß geschlossen
werden, daß die
Antifouling-Aktivität
von Tajixanthonhydrat unter den hier angegebenen Testbedingungen
hoch ist, wie an der signifikante Reduktion an Biofilm-produzierenden
Bakterien abzulesen ist.
-
Beispiel 4:
-
(3) Wirkung des Tajixanthonhydrates auf
Tumorzellen
-
(a) Methode zur Bestimmung der antitumorale
Wirkungen
-
Die
Antitumorwirkung wurde u. a. am L5178y-Mäuselymphomzellsystem nachgewiesen
(ATCC CRL 1722). Diese Zellen wurden in Suspensionskultur gehalten,
wie bereits früher
beschrieben (W. E. G. Müller,
R. K. Zahn, Cancer Res. 1979, 39, 1102–1107). Die ED50-Konzentrationen für Tajixanthonhydrate
und andere Wirkstoffe wurden wie folgt bestimmt. Die Zellen wurden
in RPMI-Medium, dem 10% fötales
Kälberserum
zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulumskonzentration wurden
10.000 Zellen/ml gewählt.
Zum Startzeitpunkt wurde die ausgewählte Substanz zugegeben und
die Kultur 72 Stunden lang bebrütet.
Danach wurde die Anzahl der lebenden Zellen mittels des kolorimetrischen
XTT-Ansatzes bestimmt und mit einem ELISA-Reader ausgewertet (siehe:
D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker, K. D. Paull, A. Monks, S. Tierney,
T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff, M. R. Boyd, Cancer Res.
1988, 48, 4827–4833;
T. Daum, J. Engels, M. Mag, J. Muth, S. Lücking, H. C. Schröder, E.
Matthes, W. E. G. Müller,
Intervirology 1992, 33, 65–75).
In analoger Weise wurden die Tumorzell-Linien PC-12 (adrenaler,
phaeochromocytomaler Tumor [Ratte]; ATCC CRL 1721), Sarcoma 180
(Sarkom [Maus]; ATCC TIB 66) sowie HeLa S3 (epitheloides Carcinom
[Cervix; Mensch]; ATCC CCL 2.2) eingesetzt.
-
Die
ED50-Konzentrationen wurden nach Durchführung des
kolorimetrischen XTT-Tests durch lineare Regression bestimmt (L.
Sachs, Angewandte Statistik. Springer, Berlin, 1984 1–168). Die
jeweiligen Mittelwerte mit der dazugehörigen Standardabweichung wurden
aus 10 unabhängigen
Experimenten ermittelt.
-
(b) Ergebnis
-
Wie
oben erwähnt,
führte
man die biologische Testung mit Tumorzellen durch und ermittelte
die ED
50-Konzentrationen für Tajixanthonhydrat.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5
| Tumor-Zellinie | ED50-Konzentration (μg/ml) |
| L5178y-Lymphomzellen | 9,7 ± 1,0 |
| PC-12-Zellen | 16,2 ± 1,4 |
| HeLa
S3-Zellen | 14,2 ± 1,2 |
-
Es
wird deutlich, daß Tajixanthonhydrat
eine zytostatische Aktivität
auf Tumorzellen ausübt.
Die Hemmkonzentration liegt bei den verwandten L5178y-Lymphomzellen
bei 9,7 ± 1,0;
im etwa gleichen Bereich werden auch die PC-12-Zellen und weiterhin
die HeLa-S3-Zellen gehemmt.
-
Diese
Hemmwirkung zeigt, daß Tajixanthonhydrat
neben der ausgeprägten
Hemmung des Stoffwechsels der Mikroorganismen auch inhibierend auf
das Wachstum von tierischen/menschlichen Tumorzellen wirkt. Dieser
Effekt erhöht
den beschriebenen Biofilm-hemmenden (anwendungsbezogenen) Wert der
Substanz. Als Erklärung
sei aufgeführt,
daß häufig nach
Besiedelung von Biofilmen mit Mikroorganismen auch ein weiterer Aufwuchs
mit tierischen Zellen eintritt.
